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Research Progress of Cultivation Technology of Taxus and Its Distribution in China

红豆杉分布与培育技术研究进展



全 文 :·技术与方法·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(7):51-57
红豆杉,别名紫杉、赤柏松,属红豆杉科(Ta-
xaceae)红豆杉属(Taxus),常绿乔木或灌木[1,2],
为第四世纪冰川后遗留古老孑遗植物,全世界自然
分布极少,1994 年被列为国家一级重点保护植物,
有“植物大熊猫”之称[3]。因其能产生具有独特抗
癌机制的次生代谢产物——紫杉醇[4],且可以不间
断释放氧气[5],红豆杉具有很好的药用特性和保健
作用 ;同时也是一种很好的观赏性植物,其木材更
可用于建筑、家具制造、雕刻等用途。
红豆杉主要用于从中提取紫杉醇及其衍生物,
虽然已开发出多种紫杉醇药源生产方法,如化学合
成 / 半合成法、微生物发酵法、细胞工程及基因工
程技术等,但受限于投入成本过高、生产工艺复杂
以及产紫杉醇效率低下等条件的限制,植株栽培仍
是当前最为经济、稳定、有效的方法。本文就红豆
杉生物学特性、境内分布和林业培育技术作如下
综述。
1 红豆杉的生物学特性及分布
红豆杉树种为常绿乔木或灌木,小枝不规则互
生,属典型浅根植物,主根不明显,侧根发达。雌
收稿日期 :2014-11-22
基金项目 :“十二五”国家科技支撑计划课题(2013BAC09B00)
作者简介 :刘新星,女,教授,研究方向 :生物工程 ;E-mail :xxlcsu@126.com
通讯作者 :刘学端,男,教授,研究方向 :生物工程 ;E-mail :xueduanliu@sina.com
红豆杉分布与培育技术研究进展
刘新星  余响华  刘学端 
(中南大学资源加工与生物工程学院,长沙 410083)
摘 要 : 红豆杉培育技术的发展,对提高红豆杉林种植面积、缓解紫杉醇药源紧缺的难题,具有非常重要的现实意义。介
绍了中国红豆杉的基本生物学特性及其林业分布状况;综述了近 10 年来红豆杉培育技术的研究进展,包括传统的播种和扦插技术、
现代林业培育技术路线与方法方面的最新研究成果,重点论述了以组培为基础的无性繁殖技术在红豆杉林业培育中的应用 ;提出
红豆杉林业育种领域亟待加强的方面,为推广红豆杉林业培育技术、扩大种植面积提供借鉴和参考。
关键词 : 红豆杉 ;分布 ;组织培养 ;培育技术
DOI :10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.008
Research Progress of Cultivation Technology of Taxus and Its
Distribution in China
Liu Xinxing Yu Xianghua Liu Xueduan
(School of Mineral Processing & Bioengineering,Central South University,Changsha 410083)
Abstract: The development of cultivation technology of taxus(Taxus chinensis)is of great significance on increasing taxus forest area
and relieving the shortage of medicinal herb resources for paclitaxel. The basic biological characteristics of taxus and forest distribution in
China are introduced. Then the research progress on cultivation technologies of taxus are summarized, including traditional seeding and cuttage
technology, the latest research achievements on contemporary forest cultivation technologies and methods, especially the application of asexual
reproduction in the cultivation of taxus forest. Finally, the aspects which should be strengthened urgently in taxus forestry breeding are pointed
out. All of above works aim to provide the references for extending forest cultivation technology and enlarging cultivation area of taxus.
Key words: Taxus chinensis ;forest distribution ;tissue culture ;cultivation technology
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.752
雄异株,异花授粉,球花小,单生于叶腋。雄球花具
柄、基部有鳞片,呈头状 ;雌球花胚珠顶生,基部
有珠托,呈盘状,下部有苞片,数枚 ;种子坚果状,
球形,生于杯状肉质的假种皮中,成熟时肉质假种
皮红色[6,7]。
红豆杉属植物是典型的阴性树种,对气候的变
化,特别是对温度、光照和湿度的要求较严。在偏
酸性、排水良好,湿润、松散、肥沃的土壤上生长良
好。幼苗喜阴、忌晒,育苗及移植第一年需遮阴管
理。成熟林常见于乔木林下第二、三层,多为散生,
极少有大面积天然纯林存在。红豆杉生长缓慢,寿
命长,是典型的慢生树种,100 年以上树龄的红豆
杉胸径仅 40 cm。幼树和成树在冠层郁闭度 0.5- 0.6
条件下长势良好,随郁闭度增加,长势减弱。红豆
杉萌发力强,耐修剪,耐寒。天然更新方式为种子
繁殖和无性萌芽繁殖。受限于散生分布及结种数量
少、种皮厚、休眠期长的特点,红豆杉天然更新能
力弱[8]。
中国本土红豆杉有 4 个种 1 变种[9],即东北
红豆杉(Taxus cuspidata Sieb et Zucc),云南红豆杉
(Taxus yunnanensis), 南 方 红 豆 杉(Taxus chinensis
var.mairei),喜马拉雅红豆杉(Taxus wallichiana),
中国红豆杉(Taxus chinensis),分布于我国西南、东
北、东南及台湾等地。其林业分布及主要生物学特性,
如表 1 所示。
2 红豆杉林业培育
2.1 有性繁殖
红豆杉有性繁殖技术即播种,成熟的红豆杉种
子因其休眠期较长,自然条件下需经两冬一夏连续
14 个月左右的湿沙储藏后方可播种发芽。播种前经
适当处理,可大大缩短促后熟周期,其一般步骤为:
先机械磨损或化学腐蚀种皮,破除蜡质和栓质层对
水分和氧气的阻隔作用 ;再经水浸、湿沙层或变温
层积处理,解除胚轴休眠[23];最后经催芽、消毒、
清洗等处理后即可进行田间播种育苗。
采用有性繁殖技术时常用的破除休眠方法为变
温层积处理,张志权等[24]在处理云南红豆杉种子时,
先磨破种皮,再在 25℃暖温中层积 36 周后继续在 5℃
低温中层积 12 周,种子发芽率可达 74.9%。同时研
究发现,层积前激素预处理对种子萌发并无明显促
进作用。吉前华[25]处理南方红豆杉种子的技术流
程则为 :先用 60% 浓硫酸腐蚀种皮 3 h,再经 100
mg/L GA3+10 mg/L 6-BA 的水溶液浸泡 24 h,最后在
珍珠岩作层积基质上作 9 个月的 25℃暖温层积和 3
个月的 5℃低温层积,发芽率可达 36.1%。Liu 等[26]
通过比较研究后认为 300 mg/L 的 GA 浸泡 2 d加浓
硫酸腐蚀1min 的前处理方式结合变温层积处理是
解除南方红豆杉种子休眠的最佳组合,并且确定长
链脂肪酸是影响种子萌发的主要抑制物质。
李秋琦等[27]则通过测定不同层积阶段南方红
豆杉种子生理生态指标的变化,以期揭示南方红
豆杉种子休眠及其解除的机理。其处理种子流程
为 :300 mg/L 的 GA 2 d→浓硫酸1min →湿沙混匀
→ 4℃层积 3 个月→ 25℃层积 3 个月→ 4℃层积 150
d。在分析了可溶性糖、淀粉、蛋白质、脂肪及淀
粉酶活性的变化规律后认为,在“冷 - 热 - 冷”变
温层积过程中,解除南方红豆杉种子休眠的关键在
于脂肪酸的分解与转化,这些被利用的脂肪除了为
种胚形态形成提供物质和能量外,还可能导致了种
子萌发抑制物的降解。
2.2 无性繁殖
2.2.1 组培成苗技术 采用植物组织培养技术获得
完整植株有两条途径 :器官发生途径和体细胞胚发
生途径,现有红豆杉组培成苗技术成果全部属于器
官发生途径,而器官发生途径又可分为直接发生和
间接发生途径,前者指由外植体直接诱导成苗,后
者指外植体经诱导成愈伤组织再分化成苗。
2.2.1.1 外植体直接诱导成苗 选择具有初生分生
能力的红豆杉组织(嫩枝、顶芽、腋芽、茎尖、离
体胚等),经体外培养可直接诱导发芽或生根,形成
完整植株[28]。影响外植体芽诱导效率的因素主要有
种属、取材季节、部位、培养基配比、外源激素浓
度,常选用 WPM、B5、MS、DCR 等作基本培养基,
为防止褐变,可添加 0.2%-0.5% 的活性炭粉(AC)。
以枝条为外植体时,多选用处于生长旺盛期或长有
营养芽的嫩枝,这样有利于茎芽的诱导增殖。激素
配比对诱导结果影响较大,但遵循愈伤组织诱导基
本规律,即 :分裂素高有利于出芽,而生长素高则
2015,31(7) 53刘新星等 :红豆杉分布与培育技术研究进展
有利于生根。目前尚未见系统的诱导红豆杉外植体
生根发芽最佳条件的报道,研究结果主要集中于芽
的诱导,如用 TIBA(2,3,5-三碘苯甲酸)诱导南方
红豆杉新梢,3.0 mg/L 时诱导率可达 100%,另外单
独添加 0.1 mg/L ZT 和 0.01 mg/L 6-BA 时效果也十分
理想[29];而关于红豆杉外植体诱导生根方面的研究
则不如芽诱导那么丰富,当前技术只能保证可以诱
导出不定根,如喜马拉雅红豆杉的枝条在添加 3.5
mg/L IBA 的 MS 和 8 mg/L IBA 的 1/2 MS 培养基上培
养,60-80 d 后可诱导生根[30]。总的来说,分裂素
浓度控制在 1-4 mg/L 利于出芽[31],而生根则受外
植体树龄和 IBA 影响较大,且诱导生根困难,最好
选用幼龄树枝[32]。
影响红豆杉外植体芽诱导发生的因素较多,有
种的原因,也有外植体选择部位与季节的原因,培
养基的配方则更为重要,特别是外源生长调节剂的
量和种类的选择,较难把握,其是否与植物内源激
素有关,现在还不清楚。因此,在进行芽诱导前对
外植体内源激素进行分析研究,对降低外源生长调
节剂添加的盲目性、提高诱导的成功率具有重要
意义。
2.2.1.2 离体胚 离体胚是一类特殊的外植体,它
取材于成熟或未成熟的红豆杉种子,从中分离出
胚 / 胚性组织,再经体外培养以获得完整植株的技
术。其基本流程为 :种子先进行简单的预处理,然
后在无菌条件下去外种皮,再经化学消毒杀菌、剥
离出胚性组织,最后置于培养基上培养。
关于红豆杉离体胚培养研究起步较早[33],对不
同种类的红豆杉国内外均有研究,尤以南方红豆杉、
东北红豆杉、云南红豆杉和欧洲红豆杉[33-36]的研
究成果较为丰富。
种子的预处理方式主要包括流水冲洗和低温处
表 1 中国红豆杉林业分布及其主要生物学特性
品种 生物学特性 生长要求 分布
东北红豆杉
(Taxus cuspidata)
树冠倒卵形或阔卵形,树皮红褐色或灰红色,薄质,片状
剥裂。枝条密生 ;叶呈螺旋状,基部左右扭转。球花生于
叶腋 ;胚珠卵形、淡红色直生 ;种子卵形,成熟时紫褐色,
有光泽 ;假种皮成熟时倒卵圆形,浓红色[5]。
喜湿润,怕涝,适于
在疏松湿润排水良好
的砂质壤土上生长。
黑龙江东南部、吉林东部和
辽宁东部[10]
云南红豆杉
(Taxus yunnanensis)
树冠倒卵形,树皮红 / 黄褐色,枝条水平展开,小枝条不
规则互生,叶薄,呈螺旋状排列,叶面深绿 / 绿色,中脉
隆起,两侧各有一条淡黄色气孔带 ;雄球花淡褐黄,单生
于叶腋,雌花生于腋生的短枝上,胚珠淡红,卵形直生[11];
种子卵圆至椭球形,紫褐色。
对土壤的适应性较
强,在各种壤土、冲
积土、石灰岩石砾土
均能生长[12].
主要分布于云南省[13]
南方红豆杉
(Taxus chinensis var.mairei)
树皮淡灰色或灰褐色,长条薄片 ;叶长条形、微弯,上部
常渐窄,背面中脉带或有乳头角质突起,淡绿色,边带宽
而明显 ;种子倒卵圆形或柱状长卵形,生于红色肉质杯状
假种皮中[14];大枝开展,小枝互生。
土壤种类要求不甚严
格[15]
台、浙、赣、粤北、桂北 / 东北、
陕(秦岭)、豫、鄂、湘西、
甘西、川、贵、滇东北及晋
东南
喜马拉雅红豆杉
(Taxus wallichiana)
常绿乔木或灌木,树冠开展,多丛枝 ;冬芽卵圆形,基部
芽鳞的背部具脊,先端极尖 ;叶条形,较密,排成彼此重
叠的二列,质地较厚,直而不弯,叶背有两条淡黄色气孔
带 ;种子柱状长圆形,种脐椭圆形[16]。
喜温凉,在土壤呈碱
性,湿润肥沃,排水
良好,空气湿度大于
80% 时生长良好[16]。
云南西北部,西藏日客则地
区[17,18]
中国红豆杉
(Taxus chinensis)
叶基部扭转排成二列,条形,微弯,边缘微反曲,下面沿
中脉两侧有两条灰绿色或黄绿色气孔带,绿色边带极窄,
中脉带上有密生均匀的微小乳头点 ;种子扁卵圆形,先端
微有二脊,种脐卵圆形[19]。
土层深厚、肥沃、排
水良好的沙壤土[20]
黄河以南 1000 m 以上的山
地上部,华南、西南地区落
叶阔叶林中[19]
曼地亚红豆杉
(Taxus media)
多为灌木型,小叶互生;叶螺旋状,基部扭转,排成二列、
条形,常微弯,叶片较厚,深绿色 ;叶背有两条宽灰 / 黄
绿色气孔带 ;雄球花单生叶腋,雌球花胚球单生于侧生短
轴顶端,基部托以圆盘状假种皮 ;种子扁卵圆形,假种皮
杯状,种脐卵圆形[21]。
中性、酸性、微碱性
土壤均能生长
海拔 460-2000m,年最低温
度≥ -25℃地区均可生长[22]
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.754
理,流水冲洗应用较早。1994 年,Zhiri 等[34]将胚
性组织从欧洲红豆杉(Taxus baccata L.cv.Stricta)种
子中剥离之前,先以流水冲洗 7 d,后置于含 0.5%
活性炭(AC)的改良 MS 和 Heller 培养基中,培养
7 d 后离体胚萌发率达 100%,张长河等[35]也以南
方红豆杉种子为对象进行了类似的研究发现,种子
经流水冲洗 9 d 以上,所得离体胚经 10 d 的离体培养,
萌发率可达 100%,并认为种子在自来水中反复冲洗
有利于种胚的萌发,并推测可能的原因是冲冼去除
了胚及胚乳内抑制萌发的物质(如 ABA)。低温处
理为播种培育前处理常用方法,也可应用于离体胚
培养,如臧新等[36]采用 4℃低温处理成熟的南方红
豆杉种子 30 d,其萌发率可达 69.10% ;同时与流水
冲洗预处理对比,发现长时间(>4 d)的冲洗对种
胚的萌发不利,并对流水冲洗有利于萌发的传统解
释提出质疑。另外还指出,长时间的水冲洗会使胚
乳呈现粉糊状,给消毒、胚乳剥离工作造成一定的
困难,且易被污染。
种子经去种皮后还需经消毒杀菌处理,常用消
毒 剂 有 70% 乙 醇、0.1% 升 汞、0.125% NaClO 等。
杀菌处理后即可从中剥离出胚性组织,关于胚乳的
去留,当前研究者基本倾向于去除胚乳更有利于
萌发,但并不绝对,如朱念德等[37]通过对南方红
豆杉种胚离体培养发现,冷层积的种子在含 2 mg/L
6-BA 的培养基上培养时,带胚乳的离体胚的萌发率
比不带胚乳的高出 22.05%,达 72.15%,同时结合解
剖观察后认为,红豆杉种胚本身没有休眠期,胚乳
中某些抑制物的存在不利于种子的萌发,故离体培
养时应当去除胚乳,然而考虑到胚乳可提供胚萌发
所必需的营养物质,胚乳部分可予以保留,但必须
在培养基中添加 6-BA,并推测是 6-BA 抵消了胚乳
中的抑制物的作用 ;赵沛基等[38]也认为在剥离胚
体时保留少量胚乳更有利于离体胚的萌发。
获得的离体胚置于无菌培养基上培养,适合
的基本培养基种类较多,常用有 MS、B5、White、
DCR、BLCG、6,7-V 和 McCown 等。考虑到胚在其
萌发过程中会产生大量的醌类物质,通常需在培养
基 中 添 加 0.3%-0.5% 的 AC。Liao 等[39] 以 曼 地 亚
红豆杉成熟种胚为研究对象,确定最佳培养基为 :
1/2 MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L 2,4-D,pH 5.8、25℃
培养 30 d 后,其萌发率可达 62% ;臧新等[36]在考
察 MS、B5 和 BLCG 对离体胚的萌发率影响后发现,
培养基的种类对离体胚培养的生长与发育影响不显
著 ;而 Yang 等[40]则通过对比研究发现,B5 培养
基较 White、MS、DCR 更有利于促进南方红豆杉离
体胚萌发,其诱导发芽率高达 96%,且对早期胚胎
出芽生长发育和诱导生根十分有利。Hoseini 等[41]
对欧洲红豆杉合子胚进行离体培养,确定最适培养
基组成为 :MS+100 mg/L 干酪素水解物 +1g/L 酵母浸
提物 +100 mg/L Vc+5 g/L AC,15 d 后诱导成苗比例
为 20%,且发现未成熟胚和成熟胚组并无显著差异,
这一结论与早期张淑华等(Chang)[42]对台湾红豆
杉研究结果类似。但与国内多数研究成果存在较大
分歧,如曾余力等[38,43]对南方红豆杉、云南红豆
杉离体胚展开芽诱导研究后认为,成熟胚诱导效果
优于未成熟胚,且成熟已萌发胚是诱导不定芽形成
的最优选择。这可能与胚的处理方式有关,国内研
究发现,在剥离胚时带上少部分胚乳,其萌发率显
著提高[38],而国外研究成果中并未指明制备离体胚
时需保留少量胚乳。
离体胚在 25±1℃、pH 5.8、光周期 12 h、光强
度 2 000 Lx 或散光的条件下培养 30 d 后,即可获得
正常的红豆杉幼苗。
2.2.1.3 愈伤组织诱导成苗 目前世界上主要红豆
杉品种均可诱导形成愈伤组织[44]。诱导材料常选用
茎段组织而不使用叶片 ;基本培养基多采用 MS、B5
或 WPM(SH)培养基,植物组培常用激素均可诱
导红豆杉形成愈伤组织,但需注意生长素和分裂素
浓度配比,生长素浓度控制在 1.0-2.0 mg/L、分裂素
浓度控制在 0.1-1.0 mg/L 范围内,2 周左右即可诱导
形成愈伤组织[45,46]。
适当提高激素用量可缩短愈伤组织形成时间,
如张翔宇[32] 以改良的 MS+4.0 mg/L NAA+1.3 mg/L
2,4-D +0.3 mg/L KT+0.1% 活性炭为培养基,培养 7 d
即可形成愈伤组织,且南方红豆杉愈伤组织诱导率
高达 100%。
为防止褐变,需向培养基中添加抗褐化试剂,
常用试剂有活性炭(AC)、水解酪蛋白(CH)、Vc 等,
凡利等[47]在同时考虑愈伤组织生长速率与防止褐
化的基础上,认为水解酪蛋白是最佳选择;而李丽[48]
2015,31(7) 55刘新星等 :红豆杉分布与培育技术研究进展
则认为向培养基中添加 0.01-0.2 mg/L Vc 为最优。
获得的愈伤组织需经再分化方可诱导成苗,此
时可通过减少激素用量使其生根发芽,如张翔宇[29]
即通过改良的 MS+0.05 mg/L 6-BA+1 mg/L NAA +0.05
mg/L KT + 1 mg/L CH 组合培养愈伤组织,在温度
25℃、湿度 85%、光照 1 000-1 200 Lx、光周期 12 h
条件下,培养 60 d 可诱导出芽 ;而 Datta 等[49]通过
研究喜马拉雅红豆杉的绿色愈伤组织发现,采用 1/2
WPMSH+ 2.5 mg/L 6-BA+1% AC 培养 4 周即可诱导
出芽,1/5 氮源的 MS 培养基培养 4 周即可诱导生根。
当前采用愈伤组织诱导成苗技术成果多集中在
实验室阶段,且以提高红豆杉愈伤组织诱导率为主,
而在提高愈伤组织生根出芽、组培苗存活率等方面
研究较少。植物试管苗在培养过程中常常会出现玻
璃化现象,经愈伤组织诱导的红豆杉组培苗是否也
存在此问题,以及炼苗移栽过程中因生长条件的改
变对幼苗的影响与对策,均有待于继续深入研究。
2.2.2 扦插 我国境内现有红豆杉品种均可进行扦
插[18,50],扦插并无季节限制,但多选在春、秋季进行,
以避开林木高速生长期和高温、干旱的不利气候因
素[51],也可选在夏秋高温季节进行,如南方红豆杉,
采用封闭式高温扦插法[52],其成活率可达 92.7% ;
母树选择 3-10 年树龄 ;基质可用沙壤土、沙土、珍
珠岩、园土和黏土[53,54],多选用混合土壤,且采用
分层基质更有利于后期生根,提高出苗率[55];扦插
前需用 1‰-3‰的 KMnO4+ 生根粉 /IAA/NAA/IBA 处
理[56-58];插穗多选用 1-3a 的木质化 / 半木质化枝
条,以利于生根和存活,插穗长度为 10-25 cm,茎
粗 0.3-1.0 cm,最好选用萌发枝条[59],同时去除基
部枝叶,保留顶梢和上端枝叶,下剪口斜切,剪口
最好为马蹄形[60];扦插深度保持穗长的 1/3-1/2[61],
插后立即喷水,初期喷水 2-3 次 /d,中后期保持 1
次 /d 即可 ;插穗后保持 60%-80% 遮光度,定期喷
洒多菌灵 / 甲基托布津溶液,预防真菌侵害[62];扦
插后一般 30-80 d 即可生根,生根率因品种不同而异,
东北红豆杉最高可达 100%。
3 展望
作为解决紫杉醇药源紧缺的主要途径,实施人
工造林仍是当前的不二选择,且传统培育技术相对
成熟,已广泛应用至红豆杉人工育种中,并取得了
良好效果。然受限于红豆杉生长缓慢、种子自然萌
发时间长、生根幼苗存活率不高(1 年以上)以及
生长环境要求特殊等特点,单纯依靠传统培育技术
仍无法有效缓解紫杉醇药源紧缺的难题,而以组培
为基础的现代林业培育技术多数停留在实验室阶段,
无法为红豆杉的实地种植栽培提供足够可靠的支持。
但作为实现植物物种快速繁殖的最有效途径,其应
用前景不言而喻。从技术层面讲,当前应主要着力
于研究红豆杉种子萌发期和幼苗期营养物质与代谢
成分的变化,以及基于此研究基础之上的关于外源
激素与红豆杉自身调节物质之间的作用关系。详尽
阐明这些机理与变化规律,是实现组培技术规模化
培育人造红豆杉林的必然需求,亦是科研工作者亟
需解决的技术关键。
随着研究成果的不断丰富,以及代谢调控理论、
分子生物学和基因组学的深入研究,红豆杉的人工
培育技术和理论将不断完善。本课题组致力于濒危
物种红豆杉的近自然保护与回归关键技术研究,包
括红豆杉的生态调节机制、人工反向调节以及适应
不同地域气候环境红豆杉品种的培育技术,以打破
气候环境因素对红豆杉生长与繁殖的限制,实现红
豆杉的跨地域式培育,进一步扩大红豆杉林业种植
面积。
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(责任编辑 狄艳红)