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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第7期
苹果树腐烂病（Apple valsa canker）是苹果生
产中危害最严重的病害，由黑腐皮壳真菌 Valsa mali
Miyabe & Yamade 引起［1，2］。目前我国和日本已经就
病菌的扩展定植［3］主要的致病物质［4-6］等问题进行
了研究，但仍没有充分证据证明病菌产生的哪些胞
外物质与致病性密切相关，对其致病机制了解甚少。
因此，深入研究苹果树腐烂病菌的致病物质及其产
收稿日期 ：2013-12-26
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31171796），高等学校博士学科点专项科研基金（20120204110002），高等学校学科创新引智计划（B07049），
公益性行业（农业）科研专项（201203034）
作者简介 ：王海英，女，硕士，研究方向 ：苹果病害防治 ；E-mail ：wanghaiying0703@163.com
通讯作者 ： 黄丽丽，女，教授，研究方向 ：植物病害综合防治 ；E-mail ：huanglili@nwsuaf.edu.cn
韩青梅，女，副研究员，研究方向 ：植物病害综合防治 ；E-mail ：hanqm@nwsuaf.edu.cn
苹果树腐烂病菌胞外蛋白提取方法
王海英1，2  何媛媛2，3  黄丽丽1，2  韩青梅1，2
（1. 西北农林科技大学植物保护学院，杨凌 712100 ；2. 旱区作物逆境生物学国家重点实验室，杨凌 712100 ；
3. 西北农林科技大学理学院，杨凌 712100）
摘 要 ： 选择一种理想的蛋白提取方法，获得数量多、质量高的苹果树腐烂病菌 Valsa mali 胞外蛋白用于蛋白质组学分析，
为全面解析该病原菌的致病机制奠定基础。采用冷冻干燥透析结合法、脱氧胆酸钠（DOC）-10%TCA 沉淀法、硫酸铵沉淀法 3 种
方法分别提取苹果树腐烂病菌的胞外蛋白，并筛选最适的硫酸铵浓度，利用 Bradford 法测定蛋白总量、SDS-PAGE 检测蛋白条带分
辨率及不同致病力菌株蛋白差异。结果表明，70% 硫酸铵沉淀提取的胞外蛋白量最高、SDS-PAGE 电泳可辨认蛋白条带最多。强
弱致病菌株胞外蛋白的 SDS-PAGE 电泳图谱在 37-50 kD 有 4 条蛋白条带差异明显，由此表明，70% 硫酸铵盐析法更适合用于苹果
树腐烂病菌胞外蛋白质差异分析时蛋白质的提取。
关键词 ： 苹果树腐烂病菌 硫酸铵沉淀 蛋白定量 聚丙烯酰胺凝胶电泳 差异蛋白
Study on Extracting of Extracellular Proteins in Valsa mali
Wang Haiying1，2 He Yuanyuan 2，3 Huang Lili1，2 Han Qingmei1，2*
（1. College of Plant Protection，Northweat Agriculture and Forestry University，Yangling 712100 ；2. State Key Laboratory of Crop Stress
Biology for Arid Areas，Yangling 712100 ；3. College of Science，Northweat Agriculture and Forestry University，Yangling 712100）
Abstract:  An optimal protein extraction method, as much as possible to obtain high-quality extracellular proteins of Valsa mali, is helpful
to thoroughly analyze the proteomics and pathogenesis of the pathogen. In this study, the three methods freeze drying system/dialysis, DOC-
10%TCA precipitation and ammonium sulfate precipitation were used to extract the extracellular proteins of Valsa mali, respectively. Then the
optimal concentration of ammonium sulfate needed to be screened. The proteins extracted by the three methods were quantified and separated
separately through Bradford and SDS-PAGE, and then extracellular proteins extracted from pathogenicity of different isolates were also compared
with SDS-PAGE. The results showed that the content and distinguishability of protein sample extracted by 70% ammonium sulfate was optimal,
and four protein lanes are significantly different in the SDS-PAGE electrophoresis patterns of different isolates. So this method is the most
suitable for extracting extracellular protein sample to analyse the difference of Valsa mali protein.
Key words:  Valsa mali Ammonium sulfate precipitation Protein quantification SDS-PAGE Different proteins
生机制可为有效防治病害提供科学依据。
蛋白质组学已广泛应用于病原与寄主互作的研
究中，它可以将基因组序列信息和在特定条件中执
行生命功能的蛋白质有机地联系起来，并全面检测
不同组织器官所表达的蛋白质及在不同发育阶段、
不 同 条 件 下 蛋 白 质 表 达 的 差 异。iTRAQ（Isobaric
tags for relative and absolute quantitation）是蛋白质组
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第7期50
学领域一项新的同位素标记技术，它克服了二维电
泳（2-DE）对低丰度蛋白、膜蛋白、偏碱蛋白，分
子量偏大或偏小蛋白的分离和检测困难的缺点［7］，
蛋白定量更准确，但该技术对样品的蛋白含量和质
量要求较高，限制了该技术在低表达的胞外蛋白上
的应用和发展［8］。目前胞外蛋白提取方法有 ：发酵
液冷冻干燥法［9］，这种方法适用于高含量胞外蛋白
的提取 ；有机溶剂沉淀法，这种方法弊端是至少加
入 3 倍发酵液体积的有机溶剂［10］，不适合大体积
发酵液中胞外蛋白提取。本试验中苹果树腐烂病菌
Valsa mali 在正常生长状态下分泌的蛋白较少，分离
沉淀困难。因此，建立一种高效的胞外蛋白质提取
方法，以获取种类和数量较多的胞外蛋白是该菌进
行胞外蛋白质组学实验的重要前提。
本研究通过比较液体发酵培养条件下 2 种蛋白
提取方法对苹果树腐烂病菌胞外蛋白的提取效率，
选择其中能够提取尽可能多的高质量的胞外蛋白的
方法，旨在为后续苹果树腐烂病菌胞外蛋白质组学
的研究提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
本实验所用苹果树腐烂病菌野生型菌株 8# 由本
实验室分离获得并于 -80℃冰箱保存。蛋白质组学试
剂均购自 MP 公司，其它试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 直接冷冻干燥 / 透析 参照常明等［11］的方法，
略有改动。将 500 mL 发酵滤液分装于 50 mL 的离心
管中，冷冻干燥至粉末。粉末用 MilliQ 水重新溶解，
将重新溶解的溶液在 MilliQ 水中进行透析（4℃，约
24 h），4℃、5 000 r/min 离心 10 min，弃沉淀，上清
液再次冷冻干燥（-104℃ 约 48 h）。最后用水化上
样缓冲液（7 mol/L 尿素，2 mol/L 硫脲，0.065 mol/L
CHAPS，0.1 mol/L DTT，0.001% Bio-Lyte）重新悬浮，
放于 -80℃备用。
1.2.2 DOC-10%TCA 沉 淀 法 参 照 Schwarz 等［12］
的方法略有改动，向 500 mL 发酵滤液中均匀加入
DOC 至其终浓度为 0.02%（W/V），处理后的滤液冰
上静置 30 min，然后缓慢滴入已配好 10%（W/V）
的 TCA，同样冰上静置 30 min 后 4℃、10 000 r/min
离心 10 min，去掉上清，并用 96% 冰乙醇彻底清洗
沉淀，重复上述离心及清洗过程 2-3 次 ；最后清洗
后的沉淀用水化上样缓冲液（同 1.2.1）重新悬浮，
放于 -80℃备用。
1.2.3 硫酸铵沉淀法 5 份 500 mL 发酵滤液置于冰
浴环境，260 r/min 搅拌，少量缓慢加入硫酸铵粉末，
分别至硫酸铵终浓度为 50%、60%、70%、80% 和
90%，沉淀过夜 ；4℃、10 000 r/min 离心 30 min ［10］，
沉淀用磷酸缓冲液溶解后装入已处理的透析袋并置
于 MilliQ 水中透析，BaCl2 检测无沉淀后，将蛋白粗
提液 4℃、5 000 r/min 离心 10 min，弃沉淀，上清液
冷冻干燥，蛋白干粉用水化上样缓冲液（同 1.2.1）
重新悬浮，-80℃保存。
1.2.4 蛋白粗品质量及蛋白含量的测定 不同方法
获得的蛋白粗品冷冻干燥至恒重后称重。利用水化
上样缓冲液（同 1.2.1）溶解蛋白粗品，Bradford 法［13］
测定蛋白溶液浓度并计算总蛋白量。标准品为牛血
清白蛋白（1 mg/mL），根据不同浓度标准品在 595
nm 波长处的吸光度值绘制标准曲线，得到计算公式，
即可算出蛋白质浓度，并进一步计算溶液中总蛋白
量。然后由蛋白粗品质量和 Bradford 检测到的总蛋
白量计算蛋白相对含量，数据由 3 次生物学重复试
验获得，并经过 SPSS16.0 软件中 Duncan 模型进行
P=0.05 水平的显著性分析。㳻ⲭ⴨ሩਜ਼䟿‰= ᙫ㳻ⲭ䟿㳻ⲭ㋇૱䍘䟿 ×1000‰
1.2.5 蛋 白 样 品 SDS-PAGE 电 泳 检 测 硫 酸 沉 淀
法中蛋白获得量最高的样品与冷冻干燥 / 透析法、
DOC-10%TCA 法的蛋白样品进行 12% 分离胶，5%
浓缩胶的 SDS-PAGE，考马斯亮蓝 G-250 染色，比
较蛋白样品的电泳图谱的分辨率。
1.2.6 野生菌株 8# 及其突变体 X900 的 SDS-PAGE
条带差异比较 选择 3 种方法中提取效率最高的方
法提取苹果树腐烂病菌野生型强致病菌株 8# 及其不
致病突变体 X900 的胞外蛋白，实验经过 3 次生物
学重复获得蛋白样品进行 12% SDS-PAGE 电泳，分
析同一菌株不同批次提取的蛋白样品的重复性，以
及不同菌株的胞外蛋白之间 SDS-PAGE 图谱差异。
2014年第7期 51王海英等 ：苹果树腐烂病菌胞外蛋白提取方法
2 结果
2.1 胞外蛋白粗品质量及蛋白含量分析比较
冷冻干燥 / 透析法、DOC-10%TCA 沉淀法及不
同浓度硫酸铵沉淀法提取的蛋白粗品称重、Bradford
法检测的蛋白总量并根据 1.2.5 中公式计算蛋白相对
含量，在 P=0.05 水平进行差异显著性分析结果如表
1 所示，50%-80% 硫酸铵终浓度沉淀获得的蛋白粗
品质量随硫酸铵浓度提高而显著增加，而至 90% 时
蛋白粗品质量未明显增加 ；DOC-10%TCA 与 50% 硫
酸铵沉淀获得的蛋白粗品质量最少，无显著差异 ；
冷冻干燥 / 透析法获得的粗蛋白质量最高。利用
Bradford 法检测粗蛋白中蛋白总量，结果表明 70%
硫酸铵沉淀的蛋白粗品中蛋白总量明显高于其他硫
酸铵浓度以及冷冻干燥 / 透析法和 DOC-10%TCA 法，
而蛋白相对含量与 DOC-10%TCA 沉淀法无明显区
别，在所有方法中最高。
表 1 不同方法获得蛋白粗品质量及蛋白定量结果
提取方法
粗蛋白质量
（μg）
总蛋白量
（μg）
蛋白相对含量
（‰）
50% 硫酸铵沉淀 48.3±3.2 e 0.09±0.0037 d 1.98±0.20 c
60% 硫酸铵沉淀 62.4±2.1 d 0.17±0.0076 c 2.86±0.16 b
70% 硫酸铵沉淀 87.0±2.1 c 0.33±0.0034 a 3.86±0.13 a
80% 硫酸铵沉淀 99.6±2.4 b 0.27±0.0066 b 2.70±0.12 b
90% 硫酸铵沉淀 104.4±2.9 b 0.11±0.0069 d 1.06±0.04 d
DOC-10%TCA 44.6±2.0 e 0.18±0.0016 c 4.07±0.18 a
冷冻干燥 / 透析 125.3±11.1a 0.27±0.0025 b 2.22±0.13 c
数据为 1 mL 发酵液获得，经过 3 次生物学重复，硫酸铵盐析及 DOC-TCA
两种方法的沉淀过程均在 0℃条件下进行
2.2 冷冻干燥/透析、DOC-10%TCA、70%硫酸铵
提取的样品SDS-PAGE电泳
将冷冻干燥 / 透析法、DOC-10%TCA 法及 70%
硫酸铵沉淀法获得的蛋白样品进行 SDS-PAGE 电
泳， 结 果（ 图 1） 显 示，70% 硫 酸 铵 沉 淀 的 蛋 白
（b1、b2）可辨认条带最多，而且浓度较高。在 14.4-
25.0 kD 范围内，冷冻干燥 / 透析法蛋白样品（a1、
a2）几乎没有条带，DOC-10%TCA 法提取的样品有
蛋白条带，但可辨认的蛋白条带较少，而 70% 硫酸
铵沉淀的蛋白样品（b1、b2）条带较多，分辨率和浓
度较高 ；在 25-66.2 kD 分子量范围内冷冻干燥 / 透
析法提取的样品蛋白条带比较清晰，图中箭头 A 所
指的蛋白浓度较高，但条带数量较少，总蛋白浓度
很低，DOC-10%TCA 法提取的蛋白样品条带较前者
多，但分辨率低，70% 硫酸铵沉淀的蛋白样品条带
最多、分辨率最高，只是接近 66.2 kD 大小处的蛋白
条带 B 浓度低于 A 条带 ；大于 66.2 kD 分子量范围
内，冷冻干燥 / 透析的蛋白样品条带很少且非常微弱，
70% 硫酸铵和 DOC-10%TCA 获得的蛋白样品中的条
带相对较多，但分辨率均较低。
116.0
kD
M
A B
a1 a2 b1 b2 c2c1
66.2
45.0
35.0
25.0
18.4
14.4
a1，a2 ：冷冻干燥 / 透析两次生物学重复样品 ；b1，b2 ：70% 硫酸铵沉淀两次
生物学重复样品 ；c1，c2 ：DOC-10%TCA 沉淀法两次生物学重复样品
图 1 三种方法提取的蛋白样品 SDS-PAGE 电泳
2.3 不同致病菌株胞外蛋白SDS-PAGE比较
采用 70% 浓度硫酸铵提取 8# 及其不致病突变
体菌株 X900 发酵液中的胞外蛋白，3 次重复试验获
得的蛋白样品进行 12% SDS-PAGE 电泳，电泳部分
图谱（图 2）显示，该提取方法获得的蛋白样品分
辨率较高、重复性较好。两株菌的差异蛋白条带明显，
3 个蛋白条带 a、b、c 只在 8#（4、5、6 泳道）中存在，
在突变体 X900（1、2、3 泳道）中缺失 ；而图中蛋
白条带 d 在突变体 X900 中表达，在野生型 8# 未表达。
d
1 2 3 4 5 6 M
a
50
kD
37
b
c
1-3 ：X900 的 3 个生物学重复样品 ； 4-6 ：8# 3 次生物学重复样品
图 2 强弱致病菌株胞外蛋白 SDS-PAGE 电泳
3 讨论
冷冻干燥 / 透析法是一种简单、方便的胞外蛋
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第7期52
白质提取方法。Medina 等［9］在分析黄曲霉外泌蛋白
质组学时利用冷冻干燥法获得较多的黄曲霉外泌蛋
白，电泳图谱效果比较理想。本试验用该方法获得
的蛋白样品经 Bradford 定量，结果显示蛋白含量很
高，而 SDS-PAGED 电泳条带少而弱，原因可能是
黄曲霉外泌蛋白表达较高，简单的冷冻干燥法能够
提取足够多的胞外蛋白。苹果树腐烂病菌胞外蛋白
分泌很少，提取的粗蛋白干粉未经过沉淀分离，蛋
白粗品中培养基成分，如可溶性淀粉较多，蛋白含
量很低，导致蛋白干粉溶解时呈黏稠状，过高估计
了蛋白定量结果［14］。
DOC-10%TCA 沉淀法是较为常用的胞外蛋白样
品 制 备 技 术，Schwarz 等［12］ 利 用 DOC-10%TCA 沉
淀法获得的丙酮丁醇梭菌的胞外蛋白质量明显好于
PEG6000 和丙酮沉淀两种方法。常明等［11］在探索
稻瘟病菌胞外蛋白提取方法时也证明 DOC-10%TCA
沉淀法比冷冻干燥法更适合稻瘟病菌的胞外蛋白的
提取。本实验中用该方法提取的苹果树腐烂病菌胞
外蛋白虽然浓度较高，但蛋白样品分辨率很低，可
能原因是 TCA 沉淀了实验所用培养基中的某些成分，
样品需要进一步纯化，所以如果将该方法用于本实
验胞外蛋白的提取，有待对蛋白样品作进一步纯化
以提高样品分辨率。
硫酸铵沉淀法是一种经典的蛋白质提取方法，
Jiang 等［10］比较了 TCA 沉淀、丙酮沉淀、超滤、硫
酸铵沉淀及氯仿 / 甲醇 5 种蛋白提取方法对人体血
浆蛋白的提取效果，结果表明 5 种提取方法电泳图
谱效果没有明显差异，但是有机溶剂沉淀时使用的
有机试剂至少是 3 倍发酵滤液体积［10］，离心工作量
增加，不适合用于大体积发酵液蛋白质的提取。同
时在探索沉淀血浆蛋白的理想硫酸铵浓度时，70%
硫酸铵沉淀的血浆蛋白量是 50% 硫酸铵浓度的 2 倍
多，这点与本实验结果一致。本实验运用 70% 硫酸
铵盐析法提取 Valsa mali 胞外蛋白，蛋白含量和分
辨率最高。继续增加硫酸铵浓度可能导致发酵液中
其他大分子物质一起沉淀，增加了蛋白粗品的质量，
原本沉淀的某些蛋白随硫酸铵浓度增加溶解度改变，
重新复溶，导致蛋白含量降低。本实验在硫酸铵沉
淀后避免用导致蛋白损失的冰丙酮洗涤法对蛋白进
行纯化［10］，而是增加了透析、低速离心去除盐离子
和不溶性多糖，从而保证了较高的蛋白回收率和分
辨率。
4 结论
本试验通过比较 3 种蛋白提取方法获得的胞外
蛋白粗品质量和蛋白含量，以及 SDS-PAGE 电泳图
谱分析，初步明确 70% 硫酸铵沉淀的胞外蛋白粗品
中蛋白总量及相对含量较为理想、SDS-PAGE 电泳
图谱分辨率最高，且重复性好。用该方法提取的不
同致病力的苹果树腐烂病菌的胞外蛋白 SDS-PAGE
电泳图谱差异明显。由此证明，该方法更适合苹果
树腐烂病菌胞外蛋白差异比较时蛋白的提取。
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（责任编辑 狄艳红）