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苹果树腐烂病菌不同致病力菌株对苹果的诱导效应



全 文 :植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (6): 810~816  doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.0032810
收稿 2014-01-26  修定 2014-04-18
资助 国家自然科学基金(31272001和31000891)、现代农业产业技
术体系建设专项资金(CARS-28)、国家农业行业公益性项目
(201203034-02)、山东省科技攻关计划(2010GNC10918)
和山东省“泰山学者”建设工程专项经费。
* 通讯作者(E-mail: cxwang@qau.edu.cn; Tel: 0532-
88030480)。
苹果树腐烂病菌不同致病力菌株对苹果的诱导效应
雍道敬, 李保华, 王彩霞*
青岛农业大学农学与植物保护学院, 山东省植物病虫害综合防控重点实验室, 山东青岛266109
摘要: 以‘富士’苹果叶片为材料, 采用刺伤接种法, 比较了苹果树腐烂病菌强致病菌LXS080601和弱致病菌LXS081501侵染
对寄主体内丙二醛(MDA)含量、渗透调节物质及防御酶活性的影响。结果表明, 两菌株侵染后, 叶片MDA、蛋白质和可
溶性糖含量均增加, 接种LXS080601叶片MDA含量快速上升, 最大增幅为141.15%, 而接种LXS081501叶片的MDA含量变
化较小, 增幅仅为1.16%~16.24%, 但后者可溶性糖和蛋白质含量增幅分别高达158.12%和113.57%, 显著高于接种
LXS080601的处理。同时, 两菌株均能诱导叶片内4种防御酶活性的升高, 但LXS081501诱导的苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过
氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)和多酚氧化酶(PPO)活性均显著高于LXS080601, 说明不同致病力腐烂病菌对寄主防御
酶活性的影响存在显著差异。
关键词: 苹果树腐烂病菌; 丙二醛; 渗透调节物质; 防御酶
The Inductive Effects of Different Virulence Isolates of Valsa mali var. mali on
Apple
YONG Dao-Jing, LI Bao-Hua, WANG Cai-Xia*
Key Lab of Integrated Crop Pest Management of Shandong, College of Agronomy and Plant Protection, Qingdao Agricultural
University, Qingdao, Shangdong 266109, China
Abstract: The dynamic changes of malondiadehyde (MDA) content, osmotic adjustment substances content
and defense enzymes activity were investigated in ‘Fuji’ apple leaves induced by isolates LXS080601 and
LXS081501 of Valsa mali var. mali using wound inoculation method. After inoculation, the diseased lesion
size, MDA content, soluble sugar and protein contents, as well as defense enzymes activity such as polyphenol
oxidase (PPO), phenylalanine ammonia lyase (PAL), peroxidase (POD) and catalase (CAT) were determined.
The results showed that the diseased lesion area caused by isolate LXS080601 with high virulence was signifi-
cantly bigger than that by LXS081501 with low virulence. The MDA, soluble sugar and protein contents were
increased in Fuji leaves infected with two isolates. The MDA content increased quickly and the strongest in-
crease rate was 141.15% in Fuji leaves infected with LXS080601, however, it changed less in Fuji leaves in-
fected by LXS081501 ranging from 1.16% to 16.24%. The increase rates of soluble sugar and protein contents
were 158.12% and 113.57% in Fuji leaves inoculated by LXS081501, respectively, which was much higher
than that induced by LXS080601. In addition, the activities of POD, PAL, CAT and PPO could be induced in
Fuji leaves by the two isolates as well, but their activities increases were significantly higher in leaves induced
by LXS081501 than by LXS080601 within the measured period.
Key words: Valsa mali var. mali; MDA; osmotic adjustment substances; defense enzyme
由Valsa mali var. mali引起的苹果树腐烂病是
一种毁灭性病害, 在我国各苹果产区普遍发生, 主
要危害主枝主干, 甚至造成毁园, 严重制约了我国
苹果产业的持续发展(陈策2009; 曹克强等2009; 李
保华等2013)。据调查, 2008年我国苹果主产区腐
烂病的总体发生率为52.7%, 2011年山东烟台苹果
产区腐烂病再度猖獗发生, 我国正面临腐烂病菌
第5次大流行的威胁(曹克强等2009; 王彩霞等
2012; 李保华等2013)。苹果树腐烂病菌为弱寄生
菌, 主要通过产生细胞壁降解酶和毒素类物质, 分
解或杀死寄主细胞而进行侵染(刘福昌等1980;
雍道敬等: 苹果树腐烂病菌不同致病力菌株对苹果的诱导效应 811
Natsume等1982; 陈晓林等2012)。目前, 尚未发现
有效的抗苹果树腐烂病栽培品种, 且该病菌可从
寄主木质部侵染并潜伏, 依靠化学药剂很难有效
控制腐烂病的发生与危害(Abe等2007, 2011; 李保
华等2013; 张清明等2013)。
诱导植物抗病性是植物病害防治的新途径,
以弱致病菌作为生物因子诱导是增强寄主抗病性
的重要方法(汪海军等2010)。近年来, 诸多研究表
明通过接种弱致病菌可诱导植物对其相应的强致
病菌株产生抗病性, 其机理主要是弱致病菌接种
后提高了寄主体内防御相关酶的活性, 促进了植
保素等抗性物质的积累(何晨阳2001; Singh等2003;
石延霞等2007; 李玲玲2011)。苹果树腐烂病是一
种典型的枝干病害, 以枝条作为试验材料需考虑
枝条龄期、含水量等的影响。因此 , 韦洁玲等
(2010)建立了以苹果叶片为接种材料的研究体系,
叶片本身均一性较好, 误差小, 可用于苹果树腐烂
病菌致病力分化、品种和抗病资源的筛选以及药
剂防病效果评价等研究, 该体系的可靠性在本实
验室也得到了验证。本课题组在前期研究中筛选
到一株腐烂病菌弱致病力菌株LXS081501, 该菌株
接种苹果离体枝条后再接种强致病力菌株LXS-
080601, 其病斑面积相比单独接种强致病力菌株
的处理显著降低。为探究腐烂病菌弱致病力菌株
LXS081501和强致病力菌株LXS080601对寄主诱
导效应的差异, 本研究选取感病品种‘富士’叶片作
为接种材料, 比较了强致病菌株和弱致病菌株侵
染对寄主MDA、可溶性糖和蛋白质含量及多种防
御酶活性的影响, 以期明确弱致病菌LXS081501的
生防潜能, 为苹果树腐烂病的有效防控提供新策
略和新思路。
材料与方法
1 供试菌株和植物材料
供试菌株: 苹果树腐烂病菌(Valsa mali var.
mali)强致病力菌株LXS080601与弱致病力菌株
LXS081501分别采集自山东栖霞富士果园与新疆
乌鲁木齐海棠, 单菌丝分离后进行致病力测定并
保存(陈晓林等2012; 赵红等2012)。
供试植物材料: 采自‘富士’苹果(Malus domes-
tica Borkh.)幼树1~2年生枝条的第4~5片健康、完
全展开的叶片, 苹果幼树栽植于青岛农业大学胶
州市科技示范园温室内。
2 方法
2.1 接种与取样
‘富士’叶片洗净后用75%酒精表面消毒, 晾干
备用。接种方法参考韦洁玲等(2010)的报道, 分别
在叶片端部、中部、基部用无菌接种针造成伤口
(每处针刺4下, 伤口均匀分布在直径6 mm的圆形
区域)。将腐烂病菌菌株LXS080601和LXS081501
接种于马铃薯琼脂培养基(PDA)平板中央, 25 ℃暗
培养3 d后, 在菌落边缘打取直径6 mm的菌饼, 接
种于叶片正面刺伤处, 每叶片接种6个点, 以接种
PDA培养基的叶片作为对照。叶片接种后置于15
cm培养皿中, 于25 ℃、100%相对湿度条件下培
养, 定期观察病斑扩展情况, 测定病斑面积。每处
理接种4个叶片, 试验设置3次重复。
叶片接种后每间隔12 h定期取样, 以接种点为
中心, 取病健交界组织, 液氮速冻后于–80 ℃冰箱
保存备用。取样时采用完全随机方法, 每次取4个
叶片的混合样作为一个重复。
2.2 丙二醛(MDA)、可溶性糖和蛋白质含量的测定
取0.2 g叶片组织液氮充分研磨后, MDA用2
mL 10%三氯乙酸溶液提取, 采用硫代巴比妥酸比
色法测定; 可溶性糖用5 mL蒸馏水, 沸水浴中提取
30 min, 采用苯酚法测定(邹琦2003); 可溶性蛋白质
用2 mL提取液(62.5 mmol·L-1 Tris-HCl, pH 6.8,
0.5% SDS, 10%甘油, 5%巯基乙醇)冰浴条件下提
取, 采用考马斯亮蓝G-250染色法测定(曾广娟等
2009)。
2.3 防御酶系酶液的提取及活性测定
酶液提取方法参照Moerschbacher等(1986)的
报道, 略作改进。取0.2 g叶片组织液氮充分研磨
后, 加入2 mL含1% PVP的0.1 mol·L-1磷酸缓冲液
(pH 5.5~8.8), 于4 ℃、10 000 r·min-1离心20 min, 所
得上清液即为酶粗提液。
过氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)的活性
测定方法参照高伟等(2012)的报道, 分别以OD470
和OD410每分钟内变化0.01作为1个酶活性单位。
过氧化物酶(CAT)活性的测定参考高勇等(2012)的
方法, 以每分钟OD240变化0.01的酶量定义为1个酶
活性单位; 苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性测定参考
植物生理学报812
Qin和Tian (2005)的报道, 以OD290每小时变化0.001
所需酶量作为1个酶活性单位。
2.4 数据分析
采用SPSS 17.0进行数据统计, 用Duncan氏新
复极差法进行差异显著性分析(P<0.05), 用Micro-
soft Excel 2007作图并进行分析。
实验结果
1 不同致病力菌株接种后‘富士’叶片的症状变化
‘富士’叶片接种不含菌的PDA后, 始终未表现
明显症状(图1-A), 而接种LXS080601菌饼12 h后,
针刺部位可观察到明显褐变; 接种后24 h, 出现褐
色坏死病斑(图1-B)。随接种时间的延长, 病斑不
断扩展, 接种72 h后, 病斑面积达4.50 cm2 (图1-C)。
接种5~7 d后, 病斑扩展至整个叶片。接种LXS-
081501后24 h, 针刺部位可见轻微变褐(图1-D), 但
病斑扩展缓慢。接种72 h后, 病斑面积仅为0.32
cm2 (图1-E), 且此后病斑不再继续扩展。
2 腐烂病菌侵染对叶片MDA含量和渗透调节物质
的影响
2.1 对MDA含量的影响
‘富士’叶片接种不含菌的PDA不同时间, MDA
含量始终没有明显变化; 接种LXS080601和LXS-
081501后不同时间, 两者MDA含量变化存在明显差
异(表1)。‘富士’叶片接种LXS080601后12 h, MDA
含量相比对照增加了73.25%, 随接种时间延长MDA
含量逐渐升高, 于接种后60 h到达高峰, 为12.13
µmol·g-1 (FW), 增幅高达141.15%, 随后MDA含量和
增幅均显著降低。而LXS081501接种后, ‘富士’叶片
MDA含量和增幅整体呈缓慢上升趋势, 接种后72 h
达到高峰, 分别为5.94 µmol·g-1 (FW)和16.24%, 均显
著小于接种LXS080601的处理。表明腐烂病菌强致
病菌株对寄主细胞膜的损害较大, 而弱致病菌株对
其影响较小, 并未发生明显的脂膜过氧化。
2.2 对渗透调节物质的影响
两个不同致病力菌株接种‘富士’叶片后, 可溶
图1 ‘富士’叶片接种腐烂病菌LXS080601和LXS081501后的发病症状
Fig.1 Symptoms on ‘Fuji’ leaves inoculated by V. mali LXS080601 and LXS081501
A: 接种PDA对照; B、C: 接种LXS080601后24 h和72 h; D、E: 接种LXS081501后24 h和72 h。
表1 腐烂病菌LXS080601和LXS081501接种后‘富士’叶片MDA含量的变化
Table 1 The changes of MDA content in ‘Fuji’ leaves after inoculation with V. mali LXS080601 and LXS081501
时间/h
MDA含量/μmol·g-1 (FW) 增加率/%
对照 接种LXS080601 接种LXS081501 接种LXS080601 接种LXS081501
12 5.01±0.18a 8.58±0.64c 5.23±0.13b 73.25 4.40
24 5.16±0.19a 8.54±0.02c 5.22±0.47b 65.50 1.16
36 5.03±0.42a 9.08±0.33bc 5.27±0.32b 80.52 4.77
48 5.09±0.09a 10.58±0.59b 5.41±0.33b 107.86 6.29
60 5.03±0.38a 12.13±0.14a 5.50±0.27ab 141.15 9.34
72 5.11±0.43a 8.76±0.49c 5.94±0.26a 71.43 16.24
  表中数据为平均值±标准差, 同列数据旁不同字母表示在P<0.05水平差异显著。表2、3同此。
雍道敬等: 苹果树腐烂病菌不同致病力菌株对苹果的诱导效应 813
性糖含量的变化如表2所示, 均呈现先升高后降低
的趋势, 而对照叶片可溶性糖含量没有明显变化。
接种LXS080601后24 h, 叶片内可溶性糖含量和增
幅达最大值, 分别为5.46 mg·g-1 (FW)和61.19%, 随后
逐渐下降, 接种后72 h可溶性糖含量与对照相当, 仅
为3.80 mg·g-1 (FW); 而接种LXS081501后12 h, 叶片
内可溶性糖含量增幅已达123.86%, 于接种后36 h达
到高峰, 为9.11 mg·g-1 (FW), 随后可溶性糖含量缓慢
降低, 但始终显著高于接种LXS080601的处理。
‘富士’叶片接种不含菌的PDA后, 可溶性蛋白
质含量变化不显著, 接种LXS080601后, 蛋白质含
量缓慢增加, 于接种后72 h达最大值, 为1.91 mg·g-1
(FW), 而其增幅在接种后48 h最高, 为28.77%;
LXS081501接种后, 叶片内可溶性蛋白质含量先增
加后降低, 但始终显著大于接种LXS080601的处
理, 于接种后48 h到达高峰, 为3.06 mg·g-1 (FW), 此
时增幅也最大, 为113.57%。
3 不同致病力菌株对富士叶片防御酶活性时序变
化的影响
3.1 对PPO和PAL活性的影响
‘富士’叶片接种不含菌的PDA后, PPO和PAL
活性在测定时间内均变化不明显(图2)。LXS-
080601接种后, 叶片内PPO活性呈先升高后降低的
趋势, 于接种后60 h达到活性峰值, 为50.67 U·g-1
(FW); LXS081501接种后24 h, PPO活性开始显著
高于对照, 接种后36~48 h, 酶活性急剧上升并达到
高峰, 为对照酶活性的5.97倍, 接种后48 h起弱致病
菌诱导的PPO活性显著高于强致病菌。相比于
PPO活性, 由图2可见, LXS080601接种‘富士’叶片
后, PAL活性在接种后24 h和48 h出现了两个活性
高峰, 分别为对照酶活性的1.89倍和1.75倍; 但
LXS081501接种后, PAL活性为先升高后降低的单
峰曲线, 于48 h达到高峰, 是对照酶活性的2.22倍,
且从接种后36 h开始, LXS081501诱导的PAL活性
显著高于接种LXS080601的处理。说明腐烂病菌
不同致病力菌株均可诱导寄主体内PPO和PAL活
性提高, 但弱致病菌株LXS081501的诱导效果显著
优于强致病菌株LXS080601。
3.2 对POD和CAT活性的影响
图3结果显示, 不同致病力腐烂病菌菌株接种
‘富士’叶片后, POD和CAT活性总体呈现先升高后
降低的趋势。LXS080601接种后, POD活性于接种
表2 腐烂病菌LXS080601和LXS081501接种后‘富士’叶片可溶性糖含量的变化
Table 2 The changes of soluble sugar content in ‘Fuji’ leaves after inoculation with V. mali LXS080601 and LXS081501
时间/h
可溶性糖含量/mg·g-1 (FW) 增加率/%
对照 接种LXS080601 接种LXS081501 接种LXS080601 接种LXS081501
12 3.28±0.18a 4.86±0.14b 7.34±0.49c 48.13 123.86
24 3.39±0.22a 5.46±0.43a 8.38±0.13b 61.19 146.85
36 3.53±0.53a 4.77±0.03b 9.11±0.22a 35.27 158.12
48 3.69±0.42a 4.40±0.22c 8.52±0.16b 19.15 130.62
60 3.47±0.33a 4.01±0.14c 7.99±0.09bc 15.63 130.29
72 3.47±0.23a 3.80±0.25c 7.40±0.20c 9.43 112.97

表3 腐烂病菌LXS080601和LXS081501接种后‘富士’叶片可溶性蛋白质含量的变化
Table 3 The changes of soluble protein content in ‘Fuji’ leaves after inoculation with V. mali LXS080601 and LXS081501
时间/h
可溶性蛋白质含量/mg·g-1 (FW) 增加率/%
对照 接种LXS080601 接种LXS081501 接种LXS080601 接种LXS081501
12 1.46±0.03a 1.51±0.16c 2.79±0.06c 3.46 92.33
24 1.51±0.02a 1.74±0.02b 2.83±0.02c 14.92 86.99
36 1.51±0.02a 1.84±0.12a 2.82±0.14c 21.86 87.06
48 1.42±0.09a 1.83±0.18a 3.06±0.05a 28.77 113.57
60 1.49±0.06a 1.86±0.06a 3.04±0.06a 24.95 105.40
72 1.51±0.05 1.91±0.05a 2.92±0.04b 26.61 93.37

植物生理学报814
后36 h达到峰值, 为38.75 U·g-1 (FW), 随后酶活性
缓慢降低; LXS081501诱导的POD活性, 在接种后
12~36 h增幅较小, 接种后36~48 h迅速增加并出现
活性高峰, 为75 U·g-1 (FW), 于接种后60~72 h酶活
性快速降低, 但仍显著高于接种LXS080601的处
理。与POD不同, LXS081501诱导的CAT活性水平
在测定时间内始终显著高于LXS080601, 前者在接
种后60 h达活性峰值, 为29.25 U·mg-1 (FW), 而后者
在接种后36 h酶活性最大 , 仅为18.75 U·mg-1
(FW)。该结果表明弱致病菌株LXS081501诱导寄
主抗氧化酶的活性水平显著高于强致病菌株LXS-
080601。
讨  论
丙二醛(MDA)是膜脂过氧化的最终产物, 其
含量的高低常被作为反映细胞膜脂过氧化作用强
弱和质膜破坏程度的一个重要指标(Kuk等2003;
付艳等2011)。本研究发现 , 强致病菌株LXS-
080601接种后12~60 h, 叶片内MDA含量持续上升,
这一时期也是菌丝大量生长并对组织造成严重影
响的时期, 说明组织发生了较为严重的膜脂过氧
化。60~72 h MDA增幅有所下降, 可能是由于叶片
组织内保护酶活性的升高。接种LXS081501后叶
片MDA含量虽持续升高, 但增长较缓慢且增幅较
小, 72 h后增幅仅为16.24%, 并没有发生明显的膜
脂过氧化, 推测与其诱导寄主渗透调节物质和防
御酶活性升高有密切关系。
病原菌侵染后植物细胞内正常的代谢活动受
到影响, 从而积累一些渗透调节物质, 以维持细胞
膨压对某些生理功能的调控作用(黄国宾等2009;
惠竹梅等2013)。可溶性糖和蛋白质是重要的渗透
调节物质, 可增加细胞质浓度, 在保护蛋白质分
子、抵抗氧化胁迫等方面具有重要作用(吴雪霞等
2011)。此外, 可溶性糖作为新陈代谢的呼吸基质,
图2 不同致病力腐烂病菌菌株对‘富士’叶片PPO和PAL活性的影响
Fig.2 Effects of V. mali LXS080601 and LXS081501 infection on the PPO and PAL activities in ‘Fuji’ leaves
图3 不同致病力腐烂病菌菌株对‘富士’叶片POD和CAT活性的影响
Fig.3 Effects of V. mali LXS080601 and LXS081501 infection on the POD and CAT activities in ‘Fuji’ leaves
雍道敬等: 苹果树腐烂病菌不同致病力菌株对苹果的诱导效应 815
在叶片中的含量越高, 植株营养状态越好, 其抗病
性越强。本研究发现, 腐烂病菌侵染后寄主体内
可溶性糖和蛋白质含量均升高, 但弱致病菌LXS-
081501对渗透调节物质的诱导效果显著优于强致
病菌, 这与前人研究结果一致(Whatley等1980; 夏
正俊等1994)。
植物受到诱导物的刺激后, 会发生一系列的
防御反应, 体内的有关防御酶发生相应的变化(Pal-
aniyandi等2013)。大量研究显示植物体内的防御
酶如POD、PPO、PAL和CAT等在抵抗病原菌侵
染方面发挥重要作用(Moerschbacher等1986; Qin
和Tian 2005; El-Tarabily等2009; 高勇等2012; Pala-
niyandi等2013), 其中PPO可以催化木质素和酚类
氧化产物的形成, 构成保护性屏蔽, 也可以通过形
成醌类物质直接发挥抗性作用; 而PAL是莽草酸途
径中酚类物质、植保素、木质素等抗菌物质合成
过程中最关键的酶类(段灿星等2012)。POD和
CAT是植物机体内源活性氧清除剂, 能有效抑制活
性氧对植物细胞的伤害, 且POD涉及形成毒性氧
化代谢物, 促进木质化而限制病原菌的侵入和扩
展(郑文宇等2013)。本研究中两个不同致病力菌
株LXS080601和LXS081501均可诱导寄主体内上
述防御酶活性的升高, 但弱致病菌诱导的PPO、
PAL、POD和CAT活性均显著高于接种强致病菌
的处理。综合图1和表1的结果, 随强致病菌侵染
时间的延长, 寄主的抗氧化功能随病情加重而逐
渐下降, 活性氧清除能力的下降直接导致活性氧
的大量积累, 进而加速脂膜过氧化, 降低了寄主抵
抗强致病力菌株侵染的能力, 接种72 h后其病斑面
积迅速增加甚至随后扩展至整个叶片, 而弱致病
菌诱导的上述防御酶在接种后72 h仍维持在较高
水平, 其活性氧的清除能力和合成抗性物质的能
力并未显著降低。
本文首次对苹果树腐烂病菌不同致病力菌株
对寄主的诱导效应进行了系统分析, 研究发现, 与
强致病菌LXS080601相比, 弱致病菌LXS081501侵
染后, 寄主体内MDA含量变幅较小, 而渗透调节物
质含量显著升高 , 且能够持续诱导寄主防御酶
PPO、PAL、POD和CAT活性的升高, 与已报道的
其他弱致病菌对寄主的诱导抗病性生化机制相一
致, 暗示该弱致病菌具有良好的生防潜能, 有关弱
致病菌LXS081501的诱导抗病效果及其分子机制
有待进一步研究。
参考文献
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发生和防治情况调查. 植物保护, 35 (2): 114~116
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陈晓林, 牛程旺, 李保华, 李桂舫, 王彩霞(2012). 苹果树腐烂病菌
产生细胞壁降解酶的种类及其活性分析. 华北农学报, 27 (2):
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