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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第2期
收稿日期 : 2011-11-15
基金项目 : 河南省科技攻关项目（092102110128）
作者简介 : 崔波 , 男 , 研究员 , 研究方向 : 生物技术 ; E-mail: laocuibo@163.com
通讯作者 : 叶永忠 , 男 , 博士生导师 , 研究方向 : 植物学的研究与教学工作 ; E-mail: yeyzh@163.com
蝴蝶兰 LFY 基因克隆及高效植物表达载体的构建
崔波1,2 牛苏燕1 蒋素华2 武思1 王默菲2 叶永忠1
（1 河南农业大学生命科学学院，郑州 450002 ；2 郑州师范学院生物工程研究所，郑州 450044）
摘 要 : 根据 NCBI 中蝴蝶兰 LFY 花序分生组织基因序列设计 2 对引物，用 RT-PCR 法从蝴蝶兰花芽中扩增出 LFY 基因，
对扩增产物进行克隆和测序。结果表明，获得的蝴蝶兰 LFY 基因约为 1 500 bp，与报道序列同源性达 98.71%。将 LFY 基因插入
pRI101-ON 载体中，经 PCR、双酶切及测序鉴定，证实重组表达质粒中含有目的片段，表明成功构建了高效植物表达载体 pRI101-
LFY。
关键词 : 蝴蝶兰　LFY 基因　克隆　高效植物表达载体构建
LFY Gene Cloning of Phalaenopsis and Construction of
High-effective Plant Expression Vector
Cui Bo1 ,2 Niu Suyan1 Jiang Suhua2 Wu Si1 Wang Mofei2 Ye Yongzhong1
（1College of Life Science，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002 ；2Institute of Bioengineering，
Zhengzhou Normal College，Zhengzhou 450044）
Abstract: Two pairs of primers were designed according to the reference Phalaenopsis LFY floral meristem identity gene from NCBI.
The Phalaenopsis LFY floral meristem identity gene was amplified from the Phalaenopsis blossom bud by using RT-PCR. PCR product was
cloned into the PMD19-T and sequenced. The sequencing result showed that the target gene was about 1 500 bp and the homology between the
Phalaenopsis LFY floral meristem identity gene and the template was 98.71%. Inserting the Phalaenopsis LFY floral meristem identity gene into
pRI101-ON vector. The recombinant plasmid pRI101-LFY was identified by PCR, double digests and sequencing. The result showed that the
recombinant plasmid pRI101-LFY was constructed successfully.
Key words: Phalaenopsis LFY gene Cloning Construction of high-effective plant expression vector
LFY 是 一 个 花 分 生 组 织 基 因（floral meristem
identity gene），1992 年，Weigel 等［1］首次克隆得到
拟南芥 LFY 基因，并发现拟南芥经花诱导后，LFY
基因活化，LFY mRNA 起初积累于顶端花序分生组
织的周边区，继而强表达于花原基，而后在花发育
过程中继续表达。
LFY 与调控植物开花时间的基因密切相关。光
受体 PHY 和 CRY 接受光信号后，通过生物钟调节
CO 的表达，进而由 CO 的下游靶基因 SOC1 和 FT
通过花序分生组织基因（LFY、AP1 等）调节开花 ；
春化作用通过 VIN3 起始抑制 FLC 的表达，然后通
过 VIN2 和 VIN1 等维持 FLC 表达沉默状态［2］；自
主途径的 7 个基因通过不同的机制抑制 FLC 的表
达，进而促进了 SOC1 和 FT 的表达 ；与 GA 合成及
信号传导有关的组分通过 SOC1 和 LFY 调节开花时
间。LFY 不受 CO 的直接调节，并且 GA 途径和长日
照途径在 LFY 启动子上作用的顺式元件不同，这说
明调控开花时间的 4 条途径——光周期途径、春化
途径、自主途径和 GA 途径在 LFY 这个下游基因发
生整合。同时作为花器官基因（floral organ identity
gene），LFY 能直接激活 AP1 的表达。
通过对模式植物拟南芥 LFY 基因研究的深入，
发现 LFY 基因是一个控制花序梢分生组织特征的基
因，LFY 参与促进花分生组织的形成和花分生组织
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属性的控制［3,4］，参与维持花分生组织的正常功能、
花启动及防止花分生组织的逆转。在花分生组织属
性基因中 LFY 基因是首先表达的。LFY 编码了一个
发育开关，其活性足以将所有侧梢转变成单花芽，
从而诱导植株提早开花。
LFY 基因广泛表达于植物的营养和生殖器官，
在花诱导后表达水平加强。LFY 基因表达量只有达
到一定阈值才能成花，同时过量表达不影响花模式
且能提前成花。在杨树、烟草、菊花和水稻等植物中，
LFY 的超量表达均使花期提前［5-8］。本研究从蝴蝶
兰花芽克隆出 LFY 同源基因 cDNA，根据表达载体
pRI101-ON DNA 有一个翻译增强子 OsADH，来源于
水稻的乙醇脱氢酶 5 非编码区，可以在单子叶植物
中表达外源基因，构建了高效植物表达载体 pRI101-
LFY，进一步转入单子叶植物蝴蝶兰中，验证蝴蝶兰
LFY 基因的功能及表达部位，使其 LFY 基因能够高
效表达，最终调控蝴蝶兰的花期。
1 材料与方法
1.1 材料
蝴蝶兰（Phalaenopsis amabilis）来自郑州师范
学院智能温室。采样取蝴蝶兰花芽抽出 3-5 cm 时的
芽尖，然后用液氮收集，置于 -80℃保存。克隆载体
pMD19-T Vector、Pfu DNA 聚合酶、Taq DNA 聚合酶、
限制性内切酶、T4 DNA 连接酶、表达载体 pRI101-
ON 均购于 TaKaRa 公司 ；植物总 RNA 提取试剂盒、
普通琼脂糖 DNA 回收试剂盒、质粒小提试剂盒、
IPTG、X-gal、dNTPs 及 DNA Marker 购 于 TIANGEN
公司 ；E.coli DH5α 由本实验室保存。引物合成和基
因测序由上海英骏公司完成。
1.2 方法
1.2.1 引物设计与合成 根据 NCBI 上报道的蝴蝶
兰 LFY 基因序列（GenBank 登录号 ：AY969008.1），
运用 Primer Premier5.0 和 Olig6.0 软件设计引物扩增
蝴蝶兰 LFY 基因。为构建真核表达载体，在引物的 5
端分别加上酶切位点和相应的保护碱基。上游引物
为：5-CATCTAGACCCTCACCGCTGTCCATG-3，下游
引 物 为 ：5-CGGGATCCTATCTCATCCGCACCAGTTC
-3，下划线部分分别为 Xba I 和 BamH I 酶切位点。
1.2.2 总 RNA 的提取 根据 TIANGEN 公司的植物
总 RNA 提取试剂盒从蝴蝶兰花芽中提取总 RNA。
1.2.3 目的基因的 RT-PCR 扩增
1.2.3.1 反转录 以 mRNA 为模板，Oligo（dT）为
引物，在逆转录酶作用下合成蝴蝶兰 LFY cDNA 第
一链。
1.2.3.2 PCR 扩增 以 cDNA 为模板进行 PCR 反应。
PCR 反应体系为 20 μL ：10×PCR buffer 2 μL、dNTP
2 μL、引物各 0.4 μL 、cDNA 0.5 μL 、rTaq+Pfu 酶 0.4 μL
（rTaq/Pfu=15/1） 、加 ddH2O 至总体积 20 μL ；反应
程序：95℃变性 30 s，55℃退火 40 s，72℃延伸 40 s，
30 个循环；72℃延伸 10 min。然后用体积分数为 0.8%
的琼脂糖凝胶检测扩增结果，最后用 1.2% 琼脂糖凝
胶回收目的片段。
1.2.4 目的基因的克隆与鉴定 将回收的目的片段
克隆到载体 pMD19-T 的 EcoR V 位点，转化 E. coli
DH5α 感受态细胞中，涂布于含氨苄青霉素（Amp
100 mg/L），IPTG（20 mg/L），X-Gal（20 mg/L）的 LB
平板培养基，37℃培养过夜，经抗性筛选后挑取白
色菌落。提取质粒后进行 PCR 扩增检测，对 PCR
检测为阳性的质粒双酶切鉴定，经 PCR 以及双酶切
鉴定均为阳性的质粒进行测序。
1.2.5 高效植物表达载体的构建与鉴定 用引物对
阳性 pMD19-T-LFY PCR 扩增，PCR 扩增体系和反应
程序参照 1.2.3.2 进行。用 Xba I/BamH I 双酶切回收
的 PCR 产物，1.2% 琼脂糖凝胶电泳分离和回收目
的基因，通过 T4 连接酶将目的基因片段定向连接到
经同样处理的植物表达载体 pRI101 中 , 转化 E.coli
DH5α 感受态细胞，涂布于含有卡那霉素（Kan 50
mg/L）LB 平板培养基，37℃培养过夜，挑取菌落。
提取质粒后进行 PCR 扩增检测，对 PCR 检测为阳
性的质粒双酶切鉴定，经 PCR 以及双酶切鉴定均为
阳性的质粒进行测序，测序结果用 PrimerPremier 5.0
软件进行分析。
2 结果
2.1 蝴蝶兰LFY基因的鉴定
根据 NCBI 已报道的蝴蝶兰 LFY mRNA 序列，
结合设计的引物，目的片段大小为 1 473 bp。经琼
脂糖凝胶电泳，蝴蝶兰 cDNA 的 PCR 扩增产物片段
大小约为 1 500 bp（图 1），与预期结果一致。
2012年第2期 67崔波等 ：蝴蝶兰 LFY 基因克隆及高效植物表达载体的构建
2.2 重组克隆质粒pMD19-T LFY的PCR及双酶切鉴定
对重组克隆质粒进行 PCR 扩增和电泳，结果
也出现 1 条约 1 500 bp 的特异条带，经 Xba I/BamH
I 双 酶 切 电 泳 出 现 2 条 带，1 条 为 质 粒 片 段， 约
2 700 bp，另一条为克隆的蝴蝶兰 LFY 基因片段，约
1 500 bp（图 2），与预期结果一致。
2.3 重组表达质粒pRI101-LFY的鉴定
对 PCR 检测为阳性的重组质粒进行双酶切鉴
定，用 1.2% 的琼脂糖凝胶对酶切产物进行电泳检测。
结果（图 3）显示，共出现 2 条带，1 条约 10 500
bp 的质粒片段 ; 另一条约 1 500 bp 为克隆的蝴蝶兰
LFY 基因片段，与预期结果一致。将 PCR 和双酶
切鉴定为阳性的重组表达质粒进行测序，测序结果
与报道的序列同源性达 98.71%，并带有完整的酶切
位点，所对应蛋白与 NCBI 报道蝴蝶兰 LFY 蛋白比
对结果（图 4）显示，与报道序列同源性达到 99%。
证明重组表达质粒 pRI101-LFY 中含有目的基因，且
读码框正确，表达载体构建成功。
M.1kb plus Marker ；1.pMD19-T LFY 菌液 PCR 产物 ；
2.pMD19-T LFY 质粒双酶切鉴定
图 2 菌液 PCR 及双酶切鉴定
图 4 蛋白比对结果
3 讨论
随着基因组学的发展，目前在很多植物中成功
地克隆出成花相关基因 ，如 LEAFY 基因、AP1 基
因等，并且通过转基因技术将这些基因导入了一些
植物中，并且能够正常表达，提早开花。Blazquez［9］
将拟南芥 LFY 基因在转入其本身后，转基因植株的
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侧芽全部转变为花芽，使花期提前。邵寒霜等［6］从
拟南芥中克隆到 LFY 基因，并转入菊花，使菊花
花期提前 60-70 d。He 等［8］将 LFY 基因导入水稻，
使得转化植株的抽穗期比对照提前了 26-34 d。Pena
等［10］将拟南芥 LFY 基因转入柑橘，得到的转基因
柑橘，当年开花，呈现明显早花现象，且果实正常，
其种子当年播种，第二年春天即开花结果，并且转
化植株所获得的性状可以稳定遗传。对基因结构和
功能的研究，最终目的是为了应用。目前多数的应
用仅限于印证 LFY 基因的功能，并且在应用过程中
也出现一些异常现象。如转 LFy 基因水稻产量略有
下降，有些花发育不正常，转基因杨树花药未能开裂 ,
茎卷曲下垂、叶面积缩小、并在顶部呈现不同程度
的卷曲［11］。Kato 等［13］在番茄中，LFY 同源基因突
变体表现为开花晚或者花完全转变为芽［12,13］ , 因此
通过转基因技术将开花基因导入蝴蝶兰，验证蝴蝶
兰 LFY 基因的功能和表达部位，最终达到调控蝴蝶
兰花期具有重要的意义。
4 结论
本试验通过基因工程技术，从蝴蝶兰中提取
的 RNA 反转录成 cDNA 作为模板进行 PCR 扩增目
的基因，成功的克隆出蝴蝶兰 LFY 花序分生组织基
因，利用表达载体 pRI101-ON DNA 含有花椰菜花叶
病毒启动子 CaMV 35S 和翻译增强子 OsADH 可以在
单子叶植物中表达，成功构建其高效植物表达载体
pRI101-LFY，进一步进行转化试验，最终达到调控
蝴蝶兰花期的目的。
参 考 文 献
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（责任编辑 狄艳红）