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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第2期
DNA 转座子的实质是一段能改变宿主基因组插
入位点的 DNA 序列［1，2］，通常存在于矮牵牛（Petu-
nia hyhrida Vilm）、飞燕草（Delphinium grandiflorum
L.）、金鱼草（C.demersum）、甜豌豆（Lathyrus odor-
atus L.）等植物以及一些低等非脊椎动物中［3， 4］。由
于转座子存在种属特异性，一直以来转座子在脊椎
收稿日期 : 2013-10-08
基金项目 : 国家重点基础研究发展计划（2010CB126305）, 中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目 (HSY201205)
作者简介 : 陶然 , 女 , 硕士研究生 , 研究方向 : 鱼类基因工程育种 ; E-mail ：taoran0227@163.com
通讯作者 : 李明云 , 男 , 教授 , 博士生导师 , 研究方向 ：种质种菌工程、遗传育种和分子遗传，E-mail ：limingyun@nbip.net ；梁利群 , 女 , 研究员 ,
E-mail ：llq-1019@163.com
Tgf2 转座子多克隆位点的克隆与表达
陶然1，2  常玉梅2  梁利群2  唐然2  窦新杰2，3  王楠2，3  李明云1
（1. 宁波大学海洋学院，宁波 315211 ；2. 淡水鱼类育种国家地方联合工程实验室 农业部淡水水产生物技术与遗传育种重点实验室 中国水
产科学研究院黑龙江水产研究所，哈尔滨 150070 ；3. 上海海洋大学 水产与生命学院，上海 201306）
摘 要 ： 以金鱼 pTgf2-EF1α-EGFP 转座子为基础，构建含有多克隆位点（Multiple cloning sites，MCS）序列以及外源目的基
因肌醇-3-磷酸合成酶（Myo-inositol-3-phosphate synthase，MIPS）的重组表达载体并注射到斑马鱼 1-2 期受精卵，检测重组表达载
体 pTgf2-EF1α-MCS-EGFP 和 pTgf2-EF1α-MCS-MIPS-EGFP 在斑马鱼中绿色荧光蛋白基因（EGFP）的表达情况以及外源基因 MIPS
在斑马鱼体内的整合情况。荧光观察结果显示，两个重组载体均不影响 EGFP 的表达，只是表达强度存在一定差异，表明对 Tgf2
转座子的改造是有效的。转基因斑马鱼 PCR 检测结果显示，靶基因 MIPS 的编码区能够完整地整合到斑马鱼基因组中，整合效率
达 31.4%。重组表达载体的成功构建显示金鱼 Tgf2 转座子可以介导外源基因在斑马鱼中的表达，为以后 Tgf2 转座子在鱼类基因功
能研究方面奠定了基础。
关键词 ： 金鱼 Tgf2 转座子 MCS 序列 转基因斑马鱼
Tgf2 Transposon Multiple Cloning Sites Cloning and Expression
Tao Ran1，2 Chang Yumei2 Liang Liqun2 Tang Ran2 Dou Xinjie2，3 Wang Nan2，3 Li Mingyun1
（1. College of Ocean，Ningbo University，Ningbo 315211 ；2.China National & Local United Engineering Laboratory of Freshwater Fish
Breeding，Key Laboratory of Freshwater Aquatic Biotechnology and Genetic Breeding，Ministry of Agriculture，Heilongjiang River Fisheries
Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Harbin 150070 ；3. College of Fisheries and Life Science，Shanghai Ocean
University，Shanghai 201306）
Abstract:  The goldfish pTgf2-EF1α-EGFP transposon vector was reconstructed by insertion of artificial synthesized multiple colning
sites（MCS）. In order to examine its effectiveness, the recombinant vectors of pTgf2-EF1α-MCS-EGFP and pTgf2-EF1α-MCS-MIPS--EGFP
containing the exogenous gene, Myo-inositol-3-phosphate synthase（MIPS）were injected into 1-2 cells of zebrafish embryos. Both fluorescence
observation of GFP and PCR detection of exogenous gene sizes verified the effectiveness of the reconstructed vector, in spite of slight differences
in fluorescent strength of GFP. Moreover, the reconstructed vector has a higher integration efficiency（31.4%）in the genome of zebrafish based
on the results. The successful construction of recombinant expression vector displays goldfish Tgf2 transposon can mediate exogenous gene
expression in zebrafish and it would be useful to Tgf2 transposon in gene function research of fish.
Key words:  Goldfish Tgf2 transposon MCS sequence Transgenic zebrafish
动物中的应用仍是空白。直到 1996 年，日本学者
Koga 等［5］首次在白化变异青鳉（Oryzias latipes）中
发现了具有自主转座活性的脊椎动物转座子——
Tol2 转座子。Tol2 转座子与果蝇（Drosophila melano-
gaster）Hobo、金鱼草（Antirrhinum majus）Tam3 和
玉米（Zea mays L.）Ac 等均属于 hAT 转座子家族［6］。
2014年第2期 125陶然等 ：Tgf2 转座子多克隆位点的克隆与表达
Tol2 转座子作为高效的基因转移工具，在一些脊椎
动 物 如 斑 马 鱼（Danio rerio）、 非 洲 爪 蝉（Xenopus
laevis）和鸡中的转座效率较高［7-9］，而在青鳉中的
转座效率还是很低［10］。因此，对于在不同脊椎动物
中都能高效表达的转座子还在不断探索发现中。
2010 年，邹曙明［10］等在不同品系金鱼中发现
了具有自主转座活性的脊椎动物转座子——Tgf2 转
座子，此转座子也属于 hAT 转座子家族，这是目
前发现的第 2 个自主转座的脊椎动物转座子。Tgf2
转座子全长 4 720 bp，包含 4 个完整的开放性阅读
框（ORFs）。其与 Tol2 转座子相似度高达 97%，具
有转座必须的末端倒位重复序列（Terminal inverted
repeats，TIRs）、亚末端重复序列（Subterminal repe-
ats，SRs） 和 中 间 倒 位 重 复 序 列（Internal inverted
repeats，IRs）［11，12］。研究证实，Tgf2 转座子具有高
效内源性转座活性［13］。金鱼 Tgf2 转座子的发现不
仅对此类转座子的转座效率、各组成元件的功能研
究具有指导性意义和较高价值，并且构建高效、通
用的 Tgf2 转座系统更会促进鱼类转基因和基因捕获
方面的发展［12，14］。
多 克 隆 位 点（Multiple cloning sites，MCS） 是
包含多个限制性内切酶酶切位点的长度为几十个碱
基的 DNA 序列，也称为多位点接头，是基因工程
中常用到的载体质粒的标准配置序列。然而，由于
基因结构的复杂性和多样性，在将外源基因插入含
有 MCS 的载体中时，MCS 序列包含的酶切位点的
种类有时难以满足特定研究需求，导致特定基因功
能分析无法顺利进行，形成分子生物学研究领域的
瓶颈。因此，迫切需要一种简单有效的 MCS 序列的
人工设计与合成方法，以此满足不同科研工作的需
求。MIPS 催化底物葡萄糖-6-磷酸（G6P）转化成磷
酸肌醇（IP），是肌醇合成的限速酶 MIPS 基因［15］。
MIPS 基因被认为是调节 大 脑 肌 醇 水 平 的 潜 在 药
靶［16］，并且在保护植物免受外部逆境伤害过程中发
挥重要作用，与逆境胁迫处理下的抗性有关，其表
达受到干旱、盐胁迫和低温的诱导［17］。本研究根据
Tgf2 载体原始系统，人工设计并合成一段符合特定
需求的 MCS 序列，将其克隆至 Tgf2 转座子系统验
证其有效性，以此解决大多数外源目的基因编码序
列无法插入到一些商业化载体中进行基因功能验证
的不足。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试 验 鱼 与 载 体 来 源 斑 马 鱼 为 AB 品 系 ；
PMD-18T/MIPS 质 粒 由 本 实 验 室 自 制 pTgf2-EF-1α-
EGFP 质粒由上海海洋大学邹曙明老师惠赠。
1.1.2 培养基 LB 培养基（酵母提取物 5 g/L、胰
蛋白胨 10 g/L、Nacl 10 g/L，pH7.0），固体培养基另
加琼脂粉（Agar）15 g/L。
1.1.3 酶与试剂 限制性内切酶（ACS I、Xmal I）
购自 NEB，限制性内切酶（Hind III、Sal I）、大肠杆
菌 DH5α、pMD18-T 载 体、Taq 聚 合 酶、2000 DNA
Marker、T4 DNA 连接酶、凝胶回收试剂盒均购自大
连宝生物（TaKaRa）工程公司 ；质粒 DNA 提取试
剂盒 TIANGEN 公司，其他试剂都是国产分析纯产品。
引物合成及测序由北京英俊生物技术公司完成。
1.2 方法
1.2.1 MCS 序列设计与合成 利用 Primer premier 5.0
软件设计多克隆位点序列，从酶切位点表中选择表
达载体 Tgf2 及目标靶基因中都不存在的 11 个酶切
位点，分别为 Hind III、Stu I、Bcl I、BspE I、Pme I、
Asc I、Sma I/Xma I、Pac I、Hae III、Sca I、Sal I ；将
设计好的 MCS 序列的两两酶切位点之间以 ATAT 碱
基结构串联，在串联后的碱基序列两端各添加与表
达载体克隆区相同的两个酶切位点 Hind III 和 Sal I ；
再将上述序列两末端随机添加 GGAACC 碱基（图
1），然后送至测序公司合成，由此完成了 MCS 序列
的人工设计与合成。根据 MCS 两端序列，设计正向
引物 P1（5-CCCAAGCTTATGCATGCATATTG-3）与
反向引物 P2（5-GGTTCCACGCGTCGACATATAGTA-
C-3），用于长度为121 bp MCS寡核苷酸链的PCR扩增。
CCCAAGCTTATGCATGCATATTGATCAATATTCCGGAATATGTTTAAACATATGGCGCGCCAT
ATCCCGGGATATTTAATTAAATATGGCCATATAGTACTATATGTCGACGCGTGGAACC
Hind III
Stu I
Sma I/ Xma I Pac I Sca I Sal IHae III
Bcl I BspE I Pme I Asc I
图 1 人工设计合成的 MCS 序列
1.2.2 PMD-18T/MCS 质粒的构建 将合成的 MCS 寡
核苷酸链利用引物 P1、P2 进行 PCR 扩增，反应体
系（25 μL）：MCS 模板 1 μL，引物 P1、P2 各 1 μL，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第2期126
2×PCR Master Mix 12.5 μL，H2O 9.5 μL。PCR 扩 增
条件为 ：95℃ 5 min，95℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 30
s，35 个循环，72℃ 7 min ；反应结束后，进行 1.5%
琼脂糖凝胶电泳并切胶回收 MCS 条带，回收条带与
pMD18-T 载体连接，16℃水浴连接 30 min，然后转
化至大肠杆菌 DH5α，37℃倒置培养过夜。选择经
蓝白斑筛选后的阳性克隆进行菌斑 PCR 反应，反应
体系（25 μL）Master Mix 12.5 μL，通用引物 AVM 和
M13-47 各 1 μL，H2O 10.5 μL，PCR 扩增条件同上 ；
反应结束后，1.5% 琼脂糖凝胶电泳检测，挑选阳性
克隆摇菌提取质粒，然后送测序公司进行测序。
1.2.3 表 达 载 体 pTgf2-EF1α-MCS-EGFP（ 多 克 隆
位 点 表 达 载 体 ） 的 构 建 将 经 测 序 验 证 的 pMD-
18T/MCS 质粒与 pTgf2-EF1α-EGFP 质粒利用限制性
内切酶 Hind III 和 Sal I 分别进行双酶切，反应体系
（20 μL）：Hind III 和 Sal I 各 1 μL，10×K buffer 3
μL，pMD18-MCS 质粒或 Tgf2 质粒 3 μL，H2O 12 μL，
37℃酶切 3 h，1.5% 琼脂糖凝胶电泳检测后切胶回收。
将回收的 MCS 片段与 Tgf2 质粒大片段进行连接反
应，反应体系（10 μL）：MCS 回收产物 7 μL，Tgf2
质粒酶切回收产物 1 μL，T4 连接酶 1 μL，T4 连接
buffer 1 μL，16℃水浴连接过夜，次日转化，37℃倒
置培养过夜，挑取阳性克隆进行菌斑 PCR 反应，反
应体系和扩增条件 1.2.2。反应结束后，1.5% 琼脂
糖凝胶电泳检测，然后挑取阳性克隆摇菌提取质粒，
送测序公司进行测序。测序结果正确即获得重组的
表达载体 pTgf2-EF1α-MCS-EGFP。
1.2.4 pTgf2-EF1α-MCS-EGFP 在 斑 马 鱼 体 内 的 表
达 将表达载体 pTgf2-EF1α-MCS-EGFP 利用显微注
射的方法注射到 1-2 细胞时期的斑马鱼受精卵中，
置于培养皿在恒温培养箱中培养。培养条件 ：28℃，
10∶14 h 光 周 期， 分 别 于 注 射 12、24、40 和 72 h
观察报告基因 EGFP 表达情况。
1.2.5 pTgf2-EF1α-MIPS-EGFP 的构建 将 pMD18T/
MIPS 质 粒 与 pTgf2-EF1α-MCS-EGFP 质 粒 利 用 ACS
I 和 Xmal I（NEB）限制性内切酶分别进行双酶切，
反 应 体 系（20 μL）：pMD18-MIPS 质 粒 或 Tgf2-MCS
质 粒 3 μL，ACS I 和 Xmal I 各 1 μL，buffer 4 3 μL，
BSA 0.2 μL，H2O 11.8 μL，37℃酶切 3 h，1.5% 琼脂
糖凝胶电泳检测后切胶回收，然后将回收的 MIPS
片段与 pTgf2-EF1α-MCS-EGFP 质粒大片段进行连接
反应，反应体系和条件同 1.2.3，然后转化，挑取阳
性克隆利用 引物 Tgf2-F（5-ACAAGACGCTTACAG-
GCTGAATG-3） 和 Tgf2-R（5-CTTCCCATTCTAAA-
CAACACCC-3）进行菌斑 PCR 反应，反应体系同
1.2.2，扩增条件为：95℃ 5 min，95℃ 30 s、55℃ 30 s、
72℃ 30 s，35 个循环，72℃ 7 min；反应结束后，1.5%
琼脂糖凝胶电泳检测，挑取阳性克隆摇菌提取质粒，
送测序公司进行测序。测序结果正确即获得重组的
表达载体 pTgf2-EF1α-MIPS-EGFP。
1.2.6 pTgf2-EF1α-MCS-MIPS-EGFP 质粒在斑马鱼体
内的表达
1.2.6.1 荧光观察 将表达载体 pTgf2-EF1α-MIPS-
EGFP 利用显微注射的方法注射到 1-2 细胞时期的斑
马鱼受精卵中，置于培养皿在恒温培养箱中培养。
培 养 条 件 ：28 ℃，10∶14 h 光 周 期， 分 别 于 注 射
12、24、40 和 72 h 观察报告基因 EGFP 表达情况。
1.2.6.2 靶基因 MIPS 的 PCR 检测 注射重组表达
载体 pTgf2-EF1α-MIPS-EGFP 的斑马鱼中表达 EGFP
阳性个体人工养殖 3 个月后，剪取转基因鱼和野生
型对照斑马鱼的尾鳍提取 DNA，对靶基因 MIPS 进
行 PCR 检测（正向引物 ：5-TTGGCGCGCCATGCC-
TGAGAAA-GTTCGTATC-3，反向引物 ：5-TCCCCC
CGGGTTATGAGACTGTATGTCGAATCTTC-3），反应
体系同 1.2.2，扩增条件为 ：95℃ 5 min，95℃ 30 s、
55.6℃ 30 s、72℃ 83 s，35 个循环，72℃ 7 min ；反
应结束后，产物进行 1.5% 琼脂糖凝胶电泳检测，比
较转基因鱼和对照鱼是否有目的条带来判断 MIPS
基因是否整合到了斑马鱼基因组中。本研究所有分
子试验操作参考《分子克隆实验手册》［18］。
2 结果
2.1 MCS序列的PCR扩增与克隆
本试验设计的 MCS 长度为 121 bp，经 PCR 扩
增成功获得双链的 MCS 序列，将其克隆至 PMD18-T
质粒中，菌落 PCR 及其测序均证实本研究设计的
MCS 序列有效（图 2）。
2.2 重组表达载体 pTgf2-EF1α-MCS-EGFP 在斑
马鱼中的表达
通过 PCR 方法获得长度为 121 bp 的 MCS 序列，
2014年第2期 127陶然等 ：Tgf2 转座子多克隆位点的克隆与表达
再通过酶切、连接等方法将 MCS 序列构建到原始
Tgf2 质粒中（图 3）。图 4 是注射 pTgf2-EF1α-MCS-
EGFP 质粒的斑马鱼体内 12、24、40、72 h 后报告
基因 EGFP 的瞬时表达荧光观察结果。
斑马鱼中瞬时表达情况。图 5 是注射 pTgf2-EF1α-
MIPS-EGFP 质粒的斑马鱼体内 12、24、40、72 h 后
报告基因 EGFP 的瞬时表达荧光观察结果。
2000
bp bp
M
1000
750
500
250
100
2000
MA B
1000
750
500
250
100
A ：单链 MCS 的 PCR 扩增结果 ；B: 菌落 PCR 扩增结果
图 2 MCS 序列的 PCR 扩增
Amp
R185
SV40 PA
pgfT2AL220R185
5 637 bp EGFP
L220
EF1a
Kpn l
BgIII
Cla l
Not
BamH I
Hind III
Xhol
Kpnl
Sal I
Amp
pTol2-MCS
5752 bp
L220
Kpnl
Xhol
EF1a
EGFP
R185
SV40 PA
Kpnl
BgIII
Cla I
Not
BamH I
Hind III
+
Sal l
MCS
图 3 pTgf2-EF1α-MCS-EGFP 的构建过程
2.3 重组表达载体pTgf2-EF1α-MIPS-EGFP在斑马
鱼中EGFP的表达
通 过 显 微 注 射 将 重 组 表 达 载 体 pTgf2-EF1α-
MIPS-EGFP 注射到斑马鱼中，分时段观察 EGFP 在
A B C D
A ：显微镜荧光下胚胎发育 12 h 的转基因斑马鱼 ；B ：显微镜荧光下胚胎发
育 24 h 的转基因斑马鱼 ；C ：显微镜荧光下胚胎发育 40 h 的转基因斑马鱼 ；
D ：显微镜荧光下胚胎发育 72 h 的转基因斑马鱼
图 4 pTgf2-EF1α-MCS-EGFP 在斑马鱼中的表达情况
A B C D
A ：显微镜荧光下胚胎发育 12 h 的转基因斑马鱼 ；B ：显微镜荧光下胚胎发
育 24 h 的转基因斑马鱼 ；C ：显微镜荧光下胚胎发育 40 h 的转基因斑马鱼 ；
D ：显微镜荧光下胚胎发育 72 h 的转基因斑马鱼
图 5 pTgf2-EF1α-MIPS-EGFP 在斑马鱼中的表达情况
2.4 重组表达载体pTgf2-EF1α-MIPS-EGFP在斑马
鱼中的PCR验证
取人工养殖 3 个月的 EGFP 表达阳性斑马鱼和
野生型对照斑马鱼尾鳍提取 DNA，利用引物 ACSI-
S10 和 XmalI-S10 进行目的基因 MIPS 的 PCR 检测。
图 6 是 40 尾斑马鱼的 PCR 检测结果，MIPS 基因大
小为 1 660 bp。图 6 结果显示基因编码区能够完整
的整合到斑马鱼基因组中，说明 Tgf2 介导的转基因
载体在斑马鱼中也有较高的转基因效率。
3 讨论
近年来由转座子介导的转基因技术已成为分子
遗传育种中的主流技术，不仅能使鱼类的优良基因
得到传递，也能使鱼类产生新的变异，同时还能筛
选出鱼类一些重要性状的主控基因［5］以及进行增强
子捕获等研究［19］。例如，Fujimura 等［20］利用 Tol2
转座子获得转基因罗非鱼 ；Huang 等［21］通过 Tol2
转座子介导的增强子捕获技术成功构建了心肌特异
性表达 GFP 的转基因斑马鱼 ；Szeverenyi 等［22］ 利
用转座子标签法鉴定水稻的功能基因。金鱼 Tgf2 转
座子作为 hAT 转座子家族的新成员具有自主转座活
性，并与青鳉鱼 Tgf2 转座子相似度达 97%，表明
Tgf2 转座子也可以作为鱼类转基因和增强子捕获的
研究［11， 23］，有关 Tgf2 转座子在鱼类转基因中的应
用报道还很少，只有郭秀明［12］等利用金鱼 Tgf2 转
座系统在团头鲂成鱼基因组中的表达以研究其插入
的效率，结果显示整合效率为 31.5%，拷贝数至少
为 2 个。
之前载体改造中 MCS 序列一般都是通过分子
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第2期128
克隆获得，这样的序列不仅不能满足大部分载体改
造者的需求，如目的基因和 MCS 序列中没有相同的
酶切位点等，还会存在将 MCS 序列插入原始载体后
出现排斥的现象，如目的基因不能表达［24，25］。本
文是人工设计并合成一段符合特定需求的 MCS 序列
并构建到金鱼 Tgf2 表达载体中，即在原始 Tgf2 质
粒 EF1α 启动子下游和报告基因 EGFP 上游区间插
入 MCS 序列。由于 MCS 序列在 EGFP 基因的前面，
当 pTgf2-EF1α-MCS-EGFP 注射到斑马鱼中，可以通
过能否看到报告基因 EGFP 的表达来判定此改造是
否可行。将构建得到的重组表达载体注射到斑马鱼
中进行载体的功能验证，一方面在胚胎发育的不同
时期都看到了 EGFP 的表达，构建的含有人工合成
MCS 序列的 pTgf2-EF1α-MCS-EGFP 载体能够在宿主
体内正确表达，表明该 MCS 序列并没有影响报告基
因的正常编码，重组载体是有效的。MIPS 插入 MCS
序列中 GFP 能够表达，只是荧光强度减弱。由于原
始载体中只有一个 EF1α 启动子，当一个启动子启
动两个基因表达的时候势必会减弱后续基因的表达
效率，所以 pTgf2-EF1α-MCS-MIPS-EGFP 的 EGFP 的
表达亮度会弱一些，可以在报告基因 EGFP 前再插
入一个启动子来解决荧光表达弱的这个问题 ；另一
方面也进行了 PCR 检测，共检测转基因斑马鱼 86 尾，
其中含有靶基因 MIPS 的转基因个体为 27 尾，整合
效率达 31.4%。
4 结论
本研究是为了解决大多数外源目的基因编码序
列无法插入到一些商业化载体中进行基因功能验证
的不足而人为设计并合成了一段含有 11 个酶切位点
的 MCS 序列，序列中添加的 ATAT 结构能够防止各
不同内切酶对酶切位点的识别错误，同时也防止了
较多 GC 碱基所引起的甲基化作用。GGAACC 序列
为随机添加，能够平衡上下游 PCR 扩增引物之间的
退火温度和 GC 含量，利于后续扩增。再将其克隆
至金鱼 Tgf2 表达载体并注射到斑马鱼中通过观察斑
马鱼中 EGFP 的表达情况以及外源基因 MIPS 在斑
马鱼体内的整合情况验证其有效性，以此解决大多
数外源目的基因编码序列无法插入到一些商业化载
体中进行基因功能验证的不足。
参 考 文 献
［1］ Finnegan DJ. Eukaryotic transposable elements and genome evolution
［J］. Trends Genet, 1989, 5, 103-107.
［2］ Curcio MJ, Derbyshire KM. The outs and ins of transposition ：from
mu to kangaroo［J］.Nat Rev Mol Cell Biol, 2003, 4 ：865-877.
［3］ Amutan M, Nyyssonen E, Stubbs J, et al. Identification and cloning
of a mobile transposon from Aspergillus niger var. awamori.［J］.
Current Genetics, 1996, 29（5）：468-473.
［4］ Norimoto M, Li ZJ, Kawagoe Y, Hayashimoto A. Transposition of the
maize activator element in transgenic rice plants［J］.Nucleic Acids
Research, 1991, 19（3）：617-622.
［5］ Koga A, Suzuki M, Inagaki H, et al. Transposable element in
fish［J］.Nature, 1996, 383（6595）：30.
［6］ Akihiko K. Transposition mechanisms and biothechnology applicati-
ons of the medaka fish tol2 transposable element.［J］.Advances in
Biophysics, 2004, （38）：161-180.
［7］ Kawakami K, Takeda H, Kawakami N, et al. A transposon-mediated
gene trap approach identifies developmentally regulated genes in
zebrafish.［J］.Developmental Cell, 2004, 7（1）：133-144.
［8］ Kawakami K, Imanaka K, Itoh M, Taira M. Excision of the Tol2
transposable element of the medaka fish Oryzias latipes in Xenopus
laevis and Xenopus tropicalis［J］.Gene, 2004, （338）：93-98.
［9］ Sato Y, Kasai T, Nakagawa S, et al. Stable integration and conditional
expression of electroporated transgenes in chicken embryos［J］.
M
2000
1000
750
500
250
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1617 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 3334 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45
1-40 ：注射个体，其中 3、10、12、14、17、18、21、22、28、32 是整合外源目的基因 MIPS 的个体 ；41-44 ：未注射个体 ；45 ：H2O
图 6 转基因斑马鱼 MIPS 基因的 PCR 检测结果
2014年第2期 129陶然等 ：Tgf2 转座子多克隆位点的克隆与表达
Developmental Biology, 2007, （305）：616-624.
［10］ 邹曙明 , 杜雪地 , 袁剑 , 蒋霞云 . 金鱼 hAT 家族转座子 Tgf2 的
克隆及其结构［J］. 遗传 , 2010, 32（12）：1263-1268.
［11］ Kawakami K. Tol2 ：a versat i le gene transfer vector in
vertebrates［J］.Genome Biology, 2007, 8 ：7.
［12］ 郭秀明 , 黄创新 , 沈睿杰 , 等 .Tgf2 转座子在团头鲂基因组中
的插入效率［J］. 遗传 , 2013, 35（3）：1-8.
［13］ Jiang XY, Du XD, Tian YM, et al.Goldfish transposase Tgf2
presumably from recent horizontal transfer is active［J］.The
FASEB Journal, 2012, 26（6）：2743-2752.
［14］ 付光明 , 苏乔 , 安利佳 . 青鳉 Tol2 转座子研究进展［J］. 遗传 ,
2006, 28（7）：899-905.
［15］ Neelon K, Wang Y, Stec B, Roberts M. Probing the mechanism of
the Archaeoglobus fulgidus inositol-1-phosphate synthase［J］.
Journal of Biological Chemistry, 2005, 280（12）：11475-11482.
［16］ Michell R. Inositol derivatives ：evolution and functions［J］.
Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2008, 9（2）：151-161.
［17］ Abreu E, Aragao F. Isolation and Characterization of a myo-inositol-
1-phosphate synthase gene from yellow passion fruit（Passifora
edulis f. flavicarpa）expressed during seed development and
environmental stress［J］. Annals of Botany, 2007, 99 ：285-292.
［18］ Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning ：A
Laboratory Manual［M］.2nd ed. Cold Spring Harbor, NY ：Cold
Spring Harbor Laboratory, 1989.
［19］ Xue YL, Xiao A, Wen Lu, et al. Generation and characterization of
blood vessel specific EGFP transgenic zebrafish via Tol2 Transposon
mediated enhancer trap screen［J］. Progress in Biochemistry and
Biophysics, 2010, 37（7）：720-727.
［20］ Fujimura K, Kocher TD.Tol2-mediated transgenesis in tilapia
（Oreochromis niloticus）［J］.Aquaculture, 2011, （7）：342-346.
［21］ Huang W, Deng Y, Dong W, et al. The effect of excess expression of
GFP in a novel heart-specific green fluorescence zebrafish regulated
by nppa enhaner at early embryonic development［J］.Molecular
Biology Reports, 2011, 38（2）：793-799.
［22］ Szeverenyi I, Ramamoorthy R, Teo ZW, et al. Large-scale systematic
study on stability of the Ds element and timing of transposition in
rice［J］.Plant and Cell Physiology, 2006, 47, 84-95.
［23］ Jiang XY, Du XD, Tian YM, et al. Goldfish transposase Tgf2 presu-
mably from recent horizontal transfer is active［J］. The FASEB
Journal, 2012, 26（7）：2743-2752.
［24］ 潘求真 , 徐曙光 , 李佳 , 等 . 绿色荧光蛋白表达载体的改造和
表达［J］. 黑龙江畜牧兽医 , 2007（1）：13-15.
［25］ 朱大兴 , 王艳萍 , 杨学勤 , 等 . 高效原核表达载体 pBV220 的
改造与应用［J］. 生物工程学报 , 2008, 24（7）：1312-1316.
（责任编辑 李楠）