全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第6期
收稿日期 ：2014-01-18
基金项目 ：浙江省科技攻关项目（2008C22081）
作者简介 ： 蔡晔，女，研究方向 ：动物病毒学 ；E-mail ：meviky_cy@sina.cn ；饶品彬同为本文第一作者
通讯作者 ： 姜永厚，男，博士，副教授，研究方向 ：病毒分子诊断与动物病毒分子生物学 ；E-mail ：yonghoujiang@163.com
猪圆环病毒 2 型（Porcine circovirus type 2，PC-
V2）是近年来发现的一种重要的猪病病原，与在各地
广泛流行的断奶仔猪多系统衰竭综合征（Postweaning
multisystemic wasting syndrome，PMWS）、猪呼吸道疾
病 综 合 征（Porcine respiratory disease complex，PR-
EvaGreen 实时荧光定量 PCR 检测猪圆环病毒 2 型
方法的建立
蔡晔  饶品彬  吴海港  姜永厚
（浙江理工大学生命科学学院，杭州 310018）
摘 要 ： 根据 GenBank 中的猪圆环病毒 2 型（PCV2）ORF4 基因序列设计一对特异性引物，通过常规 PCR 扩增 PCV2 的
ORF4 基因，并将其纯化的 PCR 产物克隆入 pMD18-T 载体中，构建重组质粒。应用该重组质粒进行 EvaGreen 实时荧光定量 PCR，
建立了 PCV2 DNA 的标准曲线，并进行熔解曲线分析。结果显示 ：建立的 EvaGreen 实时荧光定量 PCR 特异性强，与其他非靶标
病毒基因不发生交叉反应；灵敏度高，最高可检测到 10 拷贝 /μL 的病毒量；重复性好，3 个浓度的批间和批内的变异系数均小于 2.5%；
对 118 份临床样品进行检测，阳性样品 25 份，阳性率为 21.2%，检测结果与普通 PCR 相符率为 99.2%，其中一份样品经荧光 PCR
检测为 PCV2 阳性，普通 PCR 检测为阴性。结果表明，建立的 EvaGreen 实时荧光定量 PCR 方法具有特异性强、敏感度高、重复性好、
简便快捷等特点，可用于临床 PCV2 感染的早期诊断以及分子流行病学调查。
关键词 ： 猪圆环病毒 2 型 EvaGreen 实时荧光定量 PCR 检测
Development of EvaGreen Real-time Fluorescence Quantitative
Polymerase Chain Reaction to Detect Porcine Circovirus Type 2
Cai Ye Rao Pinbin Wu Haigang Jiang Yonghou
（College of Life Science，Zhejiang Sci-Tech University，Hangzhou 310018）
Abstract:  According to genome sequences of ORF4 of porcine circovirus type 2（PCV2）published in GenBank, a pair of primers was
designed. The ORF4 gene was amplified with traditional PCR. The PCR product was cloned into pMD18-T vector and sequenced to construct
positive recombinant plasmid. The recombinant plasmid was used as template for EvaGreen real-time PCR to generate standard curve and melt
curve. The results showed that EvaGreen real-time PCR in the present study was highly specific while used to detect other nontarget viruses, and
its sensitivity was proved to be 10 copies/μL and reproducibility for both intra-assay and inter-assay were less than 2.5%. Then the established
method was utilized to test 118 clinical samples. The result indicated that the PCV2 positive rate was 25/118, which was 99.2% consistent with
that of conventional PCR tests, except one sample that was positive for PCV2 by real-time PCR but negative by conventional PCR. Thus, this
method in the current study showed the characteristics of specificity, sensitivity, reproducibility and simple operation, which could be used in
subclinical diagnosis and epidemiological investigation of PCV2.
Key words:  Porcine circovirus type 2 EvaGreen Real-time PCR Detection
DC）、猪皮炎与肾病综合征（Porcine dermatitis and
nephropathy syndrome，PDNS）、 仔 猪 先 天 性 震 颤
（Congenital tremor，CT）及猪繁殖系统障碍等多种疾
病密切相关［1，2］，其中以 PMWS 危害最大，给世界
各地养猪业造成了重大经济损失。PCV2 具有自身特
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第6期76
有的生物学特性，单一感染 PCV2 后一般不会引起
明显的发病，但由于其具有持续性感染和免疫抑制
作用，能诱发病猪产生免疫抑制后继发感染和混合
感染其他病原，且其致病性与病毒载量相关，导致
其潜在危害很大［3-5］。因此建立一种快速准确的诊
断方法对 PCV2 进行早期快速检测，对促进养猪业
的健康发展具有重要意义。
实时荧光定量 PCR（Real-time fluorescent quanti-
tative PCR，Real-time PCR）是在普通 PCR 技术基础
上加入荧光基团发展起来的一种快速灵敏的核酸检
测技术，弥补了常规的病毒分离鉴定、血清学等方
法对感染早期无法确诊及普通 PCR 技术不能精确定
量和假阳性率高等缺点［6，7］，可应用于病毒疾病的
早期诊断。实时荧光定量 PCR 一般包括荧光杂交探
针和荧光染料两类，与荧光探针实时定量 PCR 方法
比较，染料法实时定量 PCR 避免了设计、标记荧光
探针，检测费用相对降低，同时适用于任何 PCR 扩
增体系［8］。EvaGreen 是一种新型的用于实时荧光定
量 PCR 的 DNA 结合荧光染料，对 PCR 的抑制性远
小于在实时荧光定量 PCR 中使用较多的 SYBR Green
染 料［9］。 因 此，EvaGreen 在 Real-time PCR 中 可 使
用较高工作浓度，从而获得比 SYBR Green 更好的
扩增信号，其稳定性也强于 SYBR Green［10，11］。基
于此本研究拟建立一种 EvaGreen 实时荧光定量 PCR
方法用于 PCV2 的检测，应用于 PCV2 的早期诊断中，
同时也为进一步开展疫苗研究、诊断试剂研发等奠
定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病毒株与临床样品 PCV2 参考株由本实验室
保存，阴性对照包括猪伪狂犬病病毒（Pseudorabies
virus，PRV）和猪乙型脑炎病毒（Japanese encepha-
litis virus，JEV）疫苗干粉购自武汉科前动物生物制
品有限公司 ；猪细小病毒（Porcine parvovirus，PPV）
疫苗干粉购自北京中海保健科技有限公司 ；猪瘟病
毒（Classical swine fever virus，CSFV）、猪繁殖与呼
吸 综 合 征 病 毒（Porcine reproductive and respiratory
syndrome virus，PRRSV）、猪流感病毒（Swine influe-
nza virus，SIV）、猪圆环病毒 1 型（Porcine circovirus
type 1，PCV1）及其他相关菌株均由本实验室保存。
118 份临床样品（58 份血清样品和 60 份组织样品），
其中血清样品收集自湖北、福建、安徽、广东、河南、
浙江及天津等地猪场 ；组织样品包括猪肺、淋巴结、
肝及肾等收集自杭州市下沙附近的 5 个猪肉市场。
1.1.2 主要试剂与仪器 Taq DNA 聚合酶、dNTPs、
蛋 白 酶 K 等 购 自 上 海 生 工 生 物 工 程 有 限 公 司 ；
pMD18-T vector、Agarose、DNA Marker DL2000、
MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.3.0
等 购 自 TaKaRa 公 司 ；EB 固 体 购 自 Boehringer
Mannheim 公 司 ；EvaGreen 购 自 Biotum 公 司。DNA
Gel Extraction Kit 及 Plasmid Mini Kit 购 自 Axygen 公
司。PCR 扩增仪 Bio-Rad S1000 ；凝胶成像分析系统
Tanon 1600 ；紫外分光光度计 Nanodrop 2000 ；离心
机 Fresco 21 ；荧光定量 PCR 仪 ABI 7300。
1.2 方法
1.2.1 引物设计与合成 根据 GenBank 中已发表的
PCV2（GQ996404）ORF4 基因核苷酸序列用 Primer
Premier 5.0 软件设计一对引物 1，其相应 PCR 产物
（371 bp）用于构建重组质粒，并在此扩增产物序列
范围内（299-669 bp）再设计一对用于 EvaGreen 实
时荧光定量 PCR 的引物 2，其对应扩增产物长度为
71 bp。引物由上海生工生物工程有限公司合成。
引物 1 上游（F1）：5-CGAGAAAGCGAAAGGA-
ACMGA-3，下游（R1）：5-GGTAACCATCCCACCA-
CTT-3 ；引物 2 上游（F2）：5-CGAGAAAGCGAAA-
GGAA-3，下游（R2）：5-ACTCGATCAGTAAGTTG-
CC-3。
1.2.2 PCV2 重组质粒标准品制备
1.2.2.1 PCV2 核酸提取及普通 PCR 扩增 参照病毒
RNA/DNA 小量制备试剂盒说明书，从感染 PCV2 的
细胞株中提取 PCV2 的病毒 DNA。以提取的总 DNA
为模板进行 PCR 反应，依次加入 10×Buffer 2.5 μL，
25 mmol/L MgCl2 2 μL，0.5 μL 的上下游引物 1，2.5
mmol/L dNTPs 0.5 μL，Taq DNA（5 U/μL）0.3 μL，1
μL 的模板 DNA（约 100 ng），加入 ddH2O 至总体积
为 25 μL。反应程序 ：95℃ 3 min ；94℃ 30 s，56℃
30 s，72℃ 30 s，30 个循环；72℃ 10 min。反应结束后，
使用 DL2000 Marker 对目的片段进行 1% 的琼脂糖凝
2014年第6期 77蔡晔等 ：EvaGreen 实时荧光定量 PCR 检测猪圆环病毒 2 型方法的建立
胶电泳检测。
1.2.2.2 标准品模板构建 用引物 1 进行常规 PCR
反应扩增 PCV2 完成后，PCR 产物回收纯化后克隆
到 pMD18-T 载体中，构建重组质粒，将重组质粒转
化入 DH 5α 感受态细胞内，通过 Amp+ 培养基筛选，
提取重组质粒 DNA 进行 PCR 鉴定，并将电泳检测
正确的重组质粒委托上海生工生物工程公司进行序
列测定，将经测序验证后，序列正确的重组质粒用
紫外分光光度计 Nanodrop 2000 测定 OD260，根据阿
弗加德罗常数将浓度转换为拷贝数，再按 10 倍梯
度进行系列稀释，制备成 1.0×100-1.0×107 拷贝/μL
的 PCV2 重组质粒标准品。
1.2.3 PCV2 EvaGreen 实时荧光定量 PCR 方法建立
反 应 总 体 积 为 10 μL， 反 应 体 系 组 成 为 ：25
mmol/L Mg2+ 1.2 μL，10×Buffer 1 μL，2.5 mmol/L
dNTPs 0.8 μL，20×EvaGreen 0.5 μL，0.5 U Taq
酶， 上 下 游 引 物 2 各 0.2 μL， 质 粒 模 板 1 μL， 补
充 ddH2O 至 10 μL。反应扩增程序为 ：95℃ 3 min ；
95℃ 15 s，60℃ 1 min，40 个 循 环 ；扩 增 完 成 后，
制作熔解曲线。熔解曲线程序为 ：95℃ 15 s，60℃
1 min，95℃ 15 s，60℃开始收集荧光信号制作熔解
曲线。
1.2.4 PCV2 EvaGreen 实时荧光定量 PCR 方法评价
1.24.1 特异性 按照 EvaGreen 实时荧光定量 PCR
反应体系配制 9 份，l 份加入 PCV2 的 DNA 1 μL（约
100 ng），其余 8 份作为对照组，模板分别加入其他
7 种猪病毒包括 PRV、JEV、PPV、CSFV、PRRSV、
SIV 和 PCV1 的 DNA/cDNA 1 μL（约 100 ng），还有
1 份加入 ddH2O 1 μL 为阴性对照，按实时荧光定量
PCR 反应程序扩增，验证其特异性。
1.2.4.2 灵敏度 将 PCV2 标准品质粒进行 10 倍梯
度系列浓度稀释，进行 EvaGreen 实时荧光定量 PCR
反应。通过能够检测出阳性结果的最高稀释度的拷
贝数，确定 PCV2 在 EvaGreen 实时荧光定量 PCR 中
灵敏度。
1.2.4.3 重复性 选取 PCV2 的 3 个浓度梯度（104、
103、102 拷贝 /μL）的质粒标准品分别进行批内、批
间重复试验。批内重复试验是将每个浓度在同一次
EvaGreen 实时荧光定量 PCR 中重复 3 次 ；批间重复
试验是在 3 次不同时间段进行试验对 3 个梯度进行
EvaGreen 实时荧光定量 PCR 反应。
1.2.5 临床样品检测 对 118 份临床样品分别进行
EvaGreen 实时荧光定量 PCR 和常规 PCR 检测，比
较其检测结果。
2 结果
2.1 PCV2 ORF4基因的PCR扩增、克隆及鉴定
取 PCR 产物 5 μL 于 1% 琼脂糖上电泳，结果
表明扩增产物为 371 bp 左右的 DNA 片段（图 1）与
预期的片段长度相一致。经鉴定，该片段与连接前
的 PCR 产物片段长度一致。测序结果显示，所获序
列与 GenBank 上 PCV2 的 ORF4 基因序列完全一致，
表明重组质粒中含有该基因核苷酸序列。
2000
bp
M 1 2
1000
750
500
250
100
M ：DL2000 Marker ；1 ：PCV2 扩增产物 ；2 ：阴性对照
图 1 PCV2 ORF4 基因的 PCR 扩增
2.2 PCV2 EvaGreen实时荧光定量PCR检测标准曲
线的建立
通过多次重复试验，按优化的反应条件，以
PCV2 重组质粒稀释成系列浓度标准品（106、105、
104、103、102 和 50 拷 贝 /μL） 进 行 实 时 荧 光 定 量
PCR 反应，得到 PCV2 荧光定量 PCR 扩增动力学曲
线（图 2）。
根据 PCV2 荧光定量 PCR 扩增动力学曲线，以
lg 浓度值（lgCo）为横坐标，相应 Ct 值为纵坐标，
在 ABI7300 上生成相应标准曲线（图 3），其中斜率
为 -3.37，截距为 37.66，扩增效率为 0.980（相关系
数为大于 0.99），从而可以得出拷贝数与 Ct 值之间
的线性关系曲线表达式 Ct= -3.37×lgCo+37.66，而
待测样品的 Ct 值可以从仪器读取，把待测样品的 Ct
值代入表达式就可以算出其初始拷贝数。
2.3 实时荧光定量PCR检测方法的特异性
将 PCV2、PPV、PRRSV、JEV、CSFV、PCV1、
SIV 和 PRV 及阴性对照（ddH2O）在优化好的实时
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第6期78
荧光定量 PCR 条件下进行荧光定量 PCR 检测，结
果（图 4）发现除 PCV2 能够显示正常扩增曲线外，
其他病毒和阴性对照（NTC）均不能检测到正常扩
增曲线（荧光信号未达到阈值），表明所建立的方法
具有较强的特异性。
2.4 实时荧光定量PCR检测方法的灵敏度
将 PCV2 重组质粒标准品 10 倍梯度稀释进行实
时荧光定量 PCR，经实时扩增完成后，通过熔解曲
线分析，所能产生熔解峰的最低拷贝数即为 PCV2
的检测极限，其在 106、105、104、103、102、50、25
及 10 拷贝 /μL 时均有明显熔解峰，在 100 拷贝 /μL
时没有熔解峰，即 EvaGreen 实时荧光定量 PCR 检
测 PCV2 的灵敏度可达 10 拷贝 /μL（图 5）。
29 31
123456
33 35 37 39
5.000e+005
4.000e+005
D
el
ta
R
n
3.000e+005
2.000e+005
1.000e+005
0.000e+000
Cycle Number
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27
32.107
30.500
28.500
26.500
24.500
22.500
20.500
18.500
17.411
1.699 2.0 2.5 3.5
Log Co
C
t
4.5 5.5 6.05.04.03.0
6、5、4、3、2、1 分别对应于 PCV2 标准品的 106、105、104、103、102 和
50 拷贝 /μL
图 2 PCV2 EvaGreen 实时荧光定量 PCR 扩增曲线
图 3 PCV2 EvaGreen 实时荧光定量 PCR 标准曲线
D
el
ta
R
n
PPV
PCV2
PRRSV
CSFV
JEV
PRV
SIV
PCV1
NTC293133353739
Cycle Number
1 3 5 7 9 11 1315171921232527
3.000e+005
2.000e+005
1.000e+005
0.000e+000
-4.000e+004
5.000e+004
1.500e+005
2.500e+005
图 4 PCV2 EvaGreen 实时荧光定量 PCR 特异性
D
er
iv
at
iv
e
10ᤧ䍍/μL
3.200e+004
2.800e+004
2.400e+004
2.000e+004
1.600e+004
1.200e+004
8.000e+003
4.000e+003
-4.000e+003
60 70 80 90 95857565
Temperatureć
0.000e+000
图 5 PCV2 EvaGreen 实时荧光定量 PCR 灵敏度
2.5 实时荧光定量PCR检测方法的重复性
为 了 验 证 实 时 荧 光 定 量 PCR 检 测 结 果 的 重
复性，选取 104、103 及 102 拷贝 /μL 3 个浓度进行
批内和批间重复性试验。在批内重复中变异系数
（Coefficient of variation，CV） 分 别 为 0.81%、1.90%
和 1.49%， 批 间 重 复 中 CV 分 别 为 1.19%、2.32%
和 2.46%，两种重复试验的变异系数均小于 2.5%
（表 1），表明实时荧光定量 PCR 检测方法具有较高
的重复性，从而保证了不同样品间检测结果的可靠
性和稳定性。
2.6 临床样品检测
对 118 份样品进行处理，利用病毒 RNA/DNA
抽提试剂盒从样品中提取 DNA。应用本研究所建立
的 EvaGreen 实时荧光定量 PCR 方法和常规 PCR 方
法同时对样品进行 PCV2 检测，其中用实时荧光定
量 PCR 方法共检测出 25 份 PCV2 阳性样品（11 份
阳性血清样品和 14 份阳性组织样品），阳性率为
21.2%，而经普通 PCR 方法只检测出 24 份 PCV2 阳
2014年第6期 79蔡晔等 ：EvaGreen 实时荧光定量 PCR 检测猪圆环病毒 2 型方法的建立
性样品（11 份阳性血清样品和 13 份阳性组织样品），
阳性率为 20.3%，实时荧光定量 PCR 检测灵敏度明
显高于普通 PCR，能检测出普通 PCR 不能检测出的
感染病毒样品。
3 讨论
近年来，PCV2 及其相关疾病在猪群中广泛流行，
给养猪业造成了巨大经济损失。由于 PCV2 感染主
要通过引起机体免疫抑制，进而导致继发性感染和
条件性感染而引起发病［12，13］。因此，进行病毒抗原
或核酸的早期检测尤为重要。实时荧光定量 PCR 技
术因其快速、特异、敏感等优点而在病毒早期检测
中越来越被广泛应用［14，15］。
本 研 究 通 过 构 建 PCV2 阳 性 重 组 质 粒， 用
EvaGreen 染料法进行 Real-time PCR，得到 Real-time
PCR 标准曲线，并计算出其直线回归方程，通过线
性回归方程可以对 PCV2 阳性样品进行准确定量。
从灵敏度试验结果可见，最高可检测稀释到 10 拷
贝 /μL 的病毒模板，通过对熔解曲线分析，产物的
熔解峰（Tm value）值相同，并未出现明显的非特异
性熔解峰。在特异性试验中除 PCV2 有扩增曲线外，
其他非靶标病毒基因和阴性对照均未出现扩增曲线
（荧光信号未达到阈值），说明本方法特异性强，而
且批内和批间重复试验的变异系数均小于 2.5%，也
同时证明了本方法具有高度可重复性，从而保证检
测结果的可靠性和稳定性。
在对 118 份临床样品的检测中，本研究结果显
示 25 份 PCV2 阳性，而普通 PCR 检测只有 24 份阳
性。通过分析阳性样品在扩增曲线上的对应的 Ct 值
在标准曲线上的位置，计算出所检测阳性样品病毒
量大都集中在 106-105 拷贝 /μL。实时荧光定量 PCR
检测呈阳性而普通 PCR 检测呈阴性的样品，其拷
贝数通过计算约为 103 拷贝 /μL，比较 103 拷贝 /μL
的 PCV2 阳性重组质粒标准品经普通 PCR 检测后也
为阴性，两者检测结果一致，再次验证本研究中的
方法，检测敏感性明显高于普通 PCR，表明该方法
能够用于 PCV2 的早期诊断中。应用该荧光 PCR 方
法的检测结果显示，在血清样品中 PCV2 检出率为
19.0%，与梁鹏帅等［16］利用套式 PCR 检测多个猪
场收集的 807 份血清样品，不同猪场间 PCV2 阳性
率为 15.83%-43.33% 检测情况相符 ；在组织样品检
测中 PCV2 检出率为 23.3%，与刁有祥等［17］ 应用
PCR 方法对 125 份临床健康猪肺脏进行 PCV2 的检
测，其阳性率为 16.8%，两者比较一致，证实了本
研究方法对样品的检测结果，符合 PCV2 的流行情况。
由于其中的组织样品取自猪肉市场，本研究方法检
测结果也表明 PCV2 存在很严重的亚临床感染，是
养猪业健康发展的一大潜在危险，应当引起足够的
重视。
本研究方法与普通 PCR 相比，扩增和检测都在
同一管内完成，不需 PCR 产物后处理，有效解决了
污染问题，还能利用 96 孔板同时检测 96 个样品，
能直接分析检测结果，既方便又省时 ；与一般使用
的 SYBR Green Ⅰ实时荧光定量 PCR 相比，具有更
好的特异性、稳定性，能显示更高的荧光信号强度。
本方法检测敏感性比 SYBR Green Ⅰ实时荧光定量
PCR 检测高 10 倍左右［18，19］；与探针法相比，更加
简便，只需在 EvaGreen 反应混合液中加入引物和待
测样品即可，成本相对低廉，且无须合成价格昂贵
的探针，同时检测敏感性能达到探针检测水平［20］。
4 结论
本研究建立的检测猪圆环病毒 2 型 EvaGreen 实
时荧光定量 PCR 方法是一种快速、准确、简便的检
测方法，同时为 PCV2 的定性或定量检测、致病机
理及其防控措施研究奠定了良好技术基础。
表 1 PCV2 的 EvaGreen 实时荧光定量 PCR 重复性
标准品（拷贝 /μL）
批内重复 批间重复
3 次试验 Ct 值 变异系数（%） 3 次试验 Ct 值 变异系数（%）
104 24.05 24.19 24.44 0.81 24.76 24.19 24.36 1.19
103 27.13 28.00 28.08 1.90 27.13 28.22 28.28 2.32
102 30.93 31.49 31.86 1.49 31.01 32.57 31.86 2.46
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第6期80
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（责任编辑 李楠）