全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 2期
猪圆环病毒 2型福建株的全基因组克隆与序列分析
陈琼
(厦门市农产品质量安全检验测试中心,厦门 361012 )
摘 要: 根据 GenBank上公布的猪圆环病毒 2型全基因序列设计一对扩增 PCV2全基因的引物, 建立扩增 PCV2全序
列的 PCR方法, 并应用此方法从福建省不同地区采集的疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征 ( PMW S)的仔猪肺组织病料中扩增
出 PCV2全基因组 ( 1 767 bp), 将此基因片段克隆入 pMD 18T载体,筛选获得重组质粒 pMDPCV2, 并对其进行序列测定,然
后对全基因组进行同源性和遗传进化分析。结果表明 ,福建省不同地区采集的猪肺组织扩增出的 PCV2全序列与 GenBank
上公布的的全基因组同源性介于 94. 9% - 99. 8%之间, ORF1的同源性介于 97. 2% - 99. 9% , ORF2的同源性也很高, 介于
97. 7% - 99. 8%之间。其中福州株、福清株和漳州株与中国农大报道的 12株、郑州株 5株、杭州 4株、武汉株 3株、上海株 2
株、扬州 2株、南京 1株和兰州 1株共 30株在一个进化分支上, 同源性也高达 99. 3%。本研究有助于监测 PCV2的疫源和进
化关系, 为进一步深入研究福建省生猪猪圆环病毒来源奠定一定基础。
关键词: 猪圆环病毒 2型 基因组 克隆 序列分析 福建株
Cloning and Sequence Analysis of Complete Genomes
of Porcine C ircovirus Type 2( PCV2) Fujian Strains
Chen Q iong
(X iamen AgriculturalP roductQ uality and Safety T esting Center, X iamen 361012)
Abstrac:t Accord ing to the pub lished genom ic sequences o f porcine c ircov irus type 2( PCV2 ) published in GenBank, a pa ir of
spec ific prim ers we re designed and synthesized to amp lify the full leng th genom ic sequences of PCV2 Fujian stra ins from c linically sus
pected postw ean ing m ult isystem ic w asting syndrom e ( PMWS ) sam ples. The full length genom ic fragments amp lified w ere cloned into
pMD18T vector and the recom b inant plasm ids w ere sequenced and dete rm ined, as 1 767 bp for the result. Then, the homo logy and evo
lu tiona1 relationsh ip of PCV2 genom es and re ference stra in sequences w ere ana lyzed. The results of hom ology ana lysis showed tha t the
full length genom ic sequences o f PCV2 Fu jian strains from different districts shared 94. 9% - 99. 8% homo logy w ith reference se
quences pub lished in GenBank. The ORF1 exh ibited 97. 2% - 99. 9% sequence s im ila rity, and the ORF2 show ed h igher hom o logy,
977% - 99. 8% . In five Fujian strains, Fuq ing stra in, Fuzhou stra in and Zhang zhou strain be long to the sam e evo lv ing embranchm ent
as 30 native stra ins, higher hom o logy am ong them, 99. 3% . Phy logenetic ana lys is revealed that the Fujian stra ins are c lustered in the
PCV2. The study w ou ld play a founda tion to understand the sources o f PCV2 Fujian strains.
Key words: Porc ine c ircov irus type 2 Genom e C lon ing Sequence ana lys is Fu jian stra ins
收稿日期: 20091027
作者简介:陈琼,女,高级兽医师,主要从事动物疫病检疫和研究; Em ai:l chenq66@ 163. com
猪圆环病毒 ( porcine c ircov irus, PCV )为无囊膜
单股环状 DNA病毒, 属圆环病毒科圆环病毒属成
员,病毒粒子直径 17- 20 nm,是目前已知的最小动
物病毒之一 [ 1]。该病 1991年首次报道于加拿大,而
后美国、法国、英国、西班牙、日本、印度和中国等美
洲、欧洲和亚洲国家相继报道此病的发生。 PCV有
两种血清型 (或称基因型 ) , 即最早发现的 PCV1,
其基因组全长为 1 759 bp,无致病性, 可在血清中检
测到抗体,广泛存在于正常猪体内各器官组织及猪
源细胞,其次为能引起猪发病的 PCV2,其基因组含
有 1 767 bp或 1 768 bp, 是引起断奶仔猪多系统衰
竭综合征 ( postweaning multisystem ic w asting syn
drome, PMWS)的主要病原体 [ 1 - 5]。PCV2主要侵害
6- 12周龄仔猪, 主要表现为淋巴系统疾病、渐进性
2010年第 2期 陈琼:猪圆环病毒 2型福建株的全基因组克隆与序列分析
消瘦、贫血、呼吸道症状及黄疸,剖检可见淋巴结肿
大、肝硬变、多灶性黏液脓性支气管炎、间质性肺炎,
造成患猪免疫机能下降、生产性能降低。该病死率达
50%左右,存活猪成为僵猪, 并常和猪繁殖与呼吸综
合征病毒、细小病毒、伪狂犬病毒混合感染, 造成猪的
免疫接种失败,给养猪业带来重大经济损失。鉴于本
病给世界养猪业造成的巨大危害, 现国际兽疫局
(O IE)已明文规定各成员国需及时汇报 PMWS疫情。
研究表明该病毒含有 11个阅读框, 其中 ORF1
和 ORF2为主要阅读框, ORF1编码病毒复制相关蛋
白 ( R ep) ,而 ORF2编码病毒主要结构蛋白 ( C ap) ,
与病毒的抗原性相关 [ 6 - 11]。同一血清型 (基因型 )
内部各毒株间基因组序列非常保守, 同源性均在
90%以上, 而 2种血清型毒株之间的序列相似性低
于 80% [ 13, 14]。它们细胞培养均不产生细胞病变。
PCV2虽然基因组相对稳定, 但不同地区的 PCV2
毒株仍有一定的差异。本试验主要根据已公开发表
的 PCV2( AY256460)基因序列, 设计了一对扩增
PCV2全基因序列的引物, 并进行了核苷酸序列测
定及分析,同时与国内外毒株进行核苷酸同源性分
析,为福建地区 PCV2的分子流行病学调查和防治
措施研究打下基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
福建省不同地区采集的疑似断奶仔猪多系统衰
竭综合征 ( PMWS )并经 ELISA检测 PCV2抗体阳
性的仔猪肺样品 (未注射组织灭活疫苗 ) , Taq酶、胶
回收试剂盒、DNA M arker、dNTPs、pMD18T 载体、
DNA抽提试剂、琼脂糖凝胶回收试剂盒、小量质粒
抽提试剂盒等均为大连宝生物工程有限公司产品。
其他试剂为国产或进口分析纯。工程菌大肠杆菌
DH5a为本中心保存备用菌。引物扩增片段长为
1 767 bp, 引物由大连宝生物工程有限公司合成,为
冻干粉,用前溶解于灭菌超纯水,浓度为 20 mo l/L,
- 20 分装保存。
上游引物 ( 18 bp, 1270 - 1287 ): GGAGAAGG
GCTGGGTTAT, 下游引物 ( 18 bp, 1256 - 1273 ) :
CTCCTACCACTCCCGCTA。
1. 2 病毒 DNA提取
取抗体检测阳性猪场仔猪猪肺组织, 用无菌手
术剪刀剪成 1mm3小块后加液氮进行研磨成分, 然
后加入消化液 (蛋白酶 K浓度为 200 g /mL, SDS浓
度为 1% ),溶解后继续研磨使其混匀,再放入 56
水浴 2 h, 然后用苯酚、苯酚 !氯仿 !异戊醇 ( 25!24!
1)和氯仿各抽提 1次, 最后吸取上层水相, 加 1 /10
体积的 3mo l /L乙酸钠和 2倍体积的无水乙醇沉淀
核酸, 4 过夜或反复混匀后 12 000 r /m in离心
15m in,沉淀溶于 30 L灭菌超纯水, 用于病毒全基
因扩增的模板或 - 20 冻存备用。
1. 3 PCV2全基因序列 PCR扩增
采用进口硅化 PCR管, 50 L反应体系,依次加
入下列试剂, 10 ∀ PCR (不含 M g2 + )缓冲液 5 L,
M gC l2 ( 25 mmo l/L ) 4 L, dNTPs( 10 mmol /L ) 1 L,
上游引物和下游引物各 1 L, 猪肺组织中提取的
PCV2全基因 DNA模板 3 L, Ex Taq聚合酶 ( 5 U /
L) 0. 5 L,灭菌超纯水 34. 5 L,加样完后将 PCR
管作瞬时离心混匀,然后进行 PCR反应, 反应条件
为 95 预变性 8m in, 94 变性 45 s, 56 退火 45 s,
72 延伸 15 m in, 35 个循环, 然后 72 延伸
10m in, 最后设置为 4 。反应结束后取 5 L的
PCR产物用 1. 0%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。
1. 4 PCV2全基因克隆
将 PCR扩增的 PCV2全基因产物用胶回收试
剂盒进行回收并纯化,然后用 pMD18T载体进行克
隆, 再转化大肠杆菌 DH5a, 挑选克隆菌落进行培养
增殖,提取质粒,进行 PCR扩增和质粒酶切鉴定, 若
均为阳性,则该菌为 PCV 2全基因克隆菌。
1. 5 克隆菌序列测定和分析
将经鉴定含有克隆载体的工程菌送上海生工生
物工程服务有限公司测序部测序, 测序结果应用
DNA Star软件对福建省不同地区扩增的 PCV2全
基因序列和 ORF1以及 ORF2进行分析, 与国内外
已发表的参考基因全序列进行分析比较。
2 结果
21 PCV2全基因序列 PCR扩增
猪肺提取的 DNA模板,经 PCR扩增后,其产物
经 1. 0%琼脂糖凝胶电泳, 紫外灯观察可以清楚地
看到一条与预期大小相符的 DNA条带, 大小均为
1 800 bp左右 (图 1)。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 2期
图 1 PCV2福建株全基因的 PCR扩增产物电泳图
2. 2 PCR扩增产物测序
经上海生工测序部测序和并接, 结果从猪肺提
取的 DNA模板扩增出的 PCV2全基因长度与预期
的相符, 均为 1 767 bp。说明该猪肺中确实存在
PCV2, 采集的 5份猪肺均扩增出特异的 PCV2全
基因条带 (每份样品重复电泳一次 )。
2. 3 PCR产物的序列分析
将猪肺样品经 PCR扩增产物后测得的全基因
序列与 GenBank中的 42株 PCV2全基因序列 (表
1),应用 DNA Star分析软件进行核苷酸同源性分
析, 结果与福建福清株、福州株和漳州株同源性最高
的为与郑州 ( EU780074) , 达 99. 8% ; 福建南平株与
42株 PCV2全基因序列的总体同源性最低,为 94.
9%。说明福建 PCV2毒株在不同地区存在较大差
异 (图 2)。
表 1 GenBank公布的部分 PCV2分离物和序列号
编号 GenB ank序列号 分离地和分离时间、株型 编号 G enB ank序列号 分离地和分离时间、株型
1 AY035820 武汉 ( 2001) 148 FJ608545 北京 ( 2009, LN08)
4 GQ359008 上海 ( 2009, GX08142) 151 FJ608542 北京 ( 2009, H uB08)
5 GQ359007 上海 ( 2009, GX0853) 153 FJ608540 北京 ( 2009, B J07)
11 AY256460 匈牙利 ( 2003, 375 ) 155 FJ608538 北京 ( 2009, SC07)
15 GQ358997 上海 ( 2009, SH 0710) 161 FJ440338 郑州 ( 2008, Puyang)
39 AY188355 浙江 ( 2002, H Z0201 ) 180 EU921255 北京 ( 2008, B J0802)
47 AY556473 南京 ( 2004, SD) 192 EU057185 巴西 ( 2007, P0404 c/03)
57 AY556477 南京 ( 2004, H unan ) 197 EU257513 杭州 ( 2007, ZJU0601 )
59 AY556475 南京 ( 2004, GX) 199 EU555439 郑州 ( 2008, Luoyang)
69 AY686765 南京 ( 2004, JXIII) 200 EU780074 郑州 ( 2008, KF)
70 AY686764 南京 ( 2004, ZJ) 202 EU780073 郑州 ( 2008, Jaozuo)
71 AY686763 南京 ( 2004, SH ) 216 EU647557 郑州 ( 2008, X ingyang)
72 AY686762 南京 ( 2004, JXI) 231 EU545545 斯洛伐克 ( 2006, Vos 13964- 65 /06)
73 FJ870975 武汉 ( 2009, SDrc- 1b) 233 EU545543 斯洛伐克 ( 2007, Vos 6630- 31 /07)
74 FJ870974 武汉 ( 2009, HNyy- 6b ) 237 EU450590 南韩 ( 2005, K13 )
79 FJ870969 武汉 ( 2009, Shenzhen) 238 EU450589 南韩 ( 2005, K398 )
118 FJ660971 北京 ( 2009, DBN- 13) 239 EU450588 南韩 ( 2007, K378- 2 )
120 FJ660970 北京 ( 2009, DBN- 12) 240 EU450587 南韩 ( 2007, K378- 1 )
123 FJ660967 北京 ( 2009, DBN- 02) 241 EU450586 南韩 ( 2006, K368- 3 )
146 FJ608547 北京 ( 2009, TJ08) 242 EU450585 南韩 ( 2006, K368- 2 )
147 FJ608546 北京 ( 2009, HN08 ) 243 EU450584 南韩 ( 2006, K349 )
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2010年第 2期 陈琼:猪圆环病毒 2型福建株的全基因组克隆与序列分析
( 1Fuq ing.福清株; 2Longyan.龙岩株; 3Nanping.南平株;
4Zhangzhou.漳州株; 5Fuzhou.福州株 )
图 2 PCV2福建株全基因比较系统进化树结构图
2. 4 PCV2福建株的系统进化树分析
PCV2福建株 5株之间的全基因序列同源性为
98. 1%,其中福清株、福州株和漳州株之间的同源性
高达 99. 7%;与其它 42株 PCV2全基因序列同源性
为 94. 9% - 99. 8%,其中福建龙岩株与上海 (GQ359000),
江苏 ( AY686764, FJ644559, FJ644920, FJ644921,
FJ644923, FJ644925 ), 和斯洛伐克 ( EU545543 -
EU 545549 )的全序列同源性为 99. 7%, 与南韩
( EU450587和 EU450588)的全序列同源性为 99.
5%和 99. 6% ,而福建福清株、福州株和漳州株与南
京 (AY556475)、兰州 ( FJ447482 )、上海 ( GQ359007、
GQ358997 )、扬 州 ( FJ158602、FJ158603 )、武 汉
( FJ041151、FJ870969、FJ870975)、杭州 ( AY678532、
EU727546、EU257514、EU257515 )、郑州 ( FJ440338、
EU656143、EU 780073、EU 780074、EU647557)和北京
( FJ608538、FJ608540、FJ608542、FJ608545、FJ608546、
FJ608547、 FJ660967、 FJ660970、 EU921254 -
EU921257)的同源性也高达 99. 3%,只有福建南平株
与其它 42株中的部分序列相差较大, 同源性为 94.
9%。同时也验证了 PCV2的全基因组核酸序列比较
保守的说法,同时也说明分离株的同源性高低与国别
并无特别的联系。
3 讨论
本试验首次对福建部分地区猪圆环病毒 2型进
行核酸序列分析, 说明福建各地区普遍存在猪圆环
病毒 2型。该病毒是从发病仔猪肺组织中检测到,
先后采集了福建福州、福清、龙岩、南平和漳州等地
采集的发病仔猪肺组织均扩增出 PCV2全基因序
列。本研究为开展福建各地区猪圆环病毒分子流行
病学和防治措施初步研究打下了基础。
从猪圆环病毒 2型福建株的全基因序列分析可
以看出, PCV 2福建株 5株之间的全基因序列同源
性为 98. 1% ,其中福清株、福州株和漳州株之间的
同源性高达 99. 7%。与其它 42株的序列比较, 龙
岩株与南京株 ( AY686764 )的全序列同源性高达
99. 7% ,与南韩 ( EU 450587和 EU450588)的全序列
同源性高达 99. 5%和 99. 6% , 福州株、福清株和漳
州株与中国农大报道的 12株、郑州株 5株、杭州 4
株、武汉株 3株、上海株 2株、扬州 2株、南京 1株和
兰州 1株共 30株在一个进化分支上,同源性也高达
99. 3%。而只有福建南平株与其它 42株中的部分
序列相差较大, 同源性为 94. 9%。由此也可以看
出, 目前国内分离或检测到的毒株的基因序列较为
复杂,各地差异较大。造成这种情况的原因可能是
我国养猪业规模庞大,疫病防制水平低,与欧美等国
家有频繁的种猪交流所致。从另一方面分析, 福建
毒株与国内 30株毒株较为独立的分布于一个分支
中, 这暗示 PCV2可能早已传入我国,且在我国经过
长期的适应过程后, 已经形成一个独立的种群。但
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 2期
总体来说,所有 PCV2毒株的核苷酸序列都有较高
的同源性, 说明 PCV2毒株间的亲缘关系很近,
PCV2病毒进化速度较慢。由于 PMWS不仅给养
猪业造成严重的经济损失, 同时其作为一种新的人
畜共患传染病, 也给人类健康构成了威胁 [ 1217] , 因
此加强生猪运输检疫和饲养管理, 应引起有关部门
的高度重视。
目前 PCV2已经在世界范围内广泛存在, 其全
基因组大小有 1 767 bp和 1 768 bp两种。近年出现
1 762 bp(美国, 2002年, AY099497) , 1 766 bp(黑龙
江, 2008年, EU420015; 杭州, 2007年, EU257511和
EU 257516;丹麦 2007年, EU148507; 英国, 2000年,
A J293869)和 1 769 bp的报道 (瑞典, 2008年,
EU 386606) ,可能是进化过程中出现的一些变异所
致。所以应加强生猪尤其仔猪 PCV2的检测力度,
形成一种定期监测制度, 以便及时了解 PCV2的感
染和变异动态。
参 考 文 献
[ 1] T ischer I, G elderb lom H, V etterm annW, et a.l A very sm all porcine
circovirus w ith singlestranded DNA. N ature, 1982, 295: 6466.
[ 2] T ischer I, Rasch R, Toch term ann G. C haracterizat ion of papovavirus
and p icornav iru slike part icles in permanent p ig k idney cell lines.
ZB I Bak tH yg, I Ab tOv ig A, 1974, 226: 153167.
[ 3] Qu intana J, Segales J, Rosel lC, et a.l C l in ical and p athological obser
vat ion on p igsw ith postw ean ing m ult isystem icw ast ing syndrom e. Vet
Rec, 2001, 149 ( 12) : 357361.
[ 4] M cNeilly F, M cNair I. Isolat ion and character ization of a porcine cir
covirus 2 from cases of sow abortion and porcin e derm at it is and ne
phropathy synd rom e. A rch V iro,l 2001, 146 ( 4) : 835842.
[ 5] FenauxM, H albu r PG, H aqshenasG, et a.l C loned genom ic DNA of
type 2 porcine circovirus is infect iou swh en in jected d irect ly into the
liver and lymph n odes of pigs: ch aracterizat ion of clin ical d isease, vi
ru s d istribut ion and pathologic lesions. J V iro,l 2002, 76 ( 2 ) :
541551
[ 6] M ankertz A, M ankertz J, W olfK, et a.l Iden tif icat ion of a p rotein es
sent ial for rep lication of porcin e circovirus. J Gen V iro,l 1998, 79
( 2) : 381384.
[ 7] Naw agitgul P, M orozov I, B olin SR, et a.l Open read ing fram e 2 of
porcine circovirus type 2 encodes a m ajor cap sid protein. JG enV ir
o,l 2000, 9: 22812287.
[ 8] L iu Q, W illson P, AttohPoku S, et a.l Bacterial exp ress ion of an im
m unologically reactive PCV2ORF2 fu sion protein. Protein E xpr Pu
ri,f 2001, 21( 1 ): 115120.
[ 9] Naw ag itgu l P, H arm s PA, M orozov I, et a.l M od ified ind irect porcine
circoviru s ( PCV ) typ e 2b ased and recom b inan t cap sid protein
( ORF2) b ased enzym e linked imm un osorbent assays for detect ion of
ant ibod ies to PCV. C lin D iagn Lab Imm un o,l 2002, 9 ( 1) : 3340.
[ 10] M ahe D, B lanch ard P, T ruone C, et a.l D ifferent ial recogn ition of
ORF2 protein from type 1 and type 2 porcine circoviruses and iden
tif icat ion of imm un orelevan t ep itopes. J G en V iro,l 2000, 81 ( 7 ):
18151824.
[ 11] Truong C, M ahe D, B lanchard P, et a.l Iden tif icat ion of an immu
norelevant ORF2 ep itope from porcine circoviru s type 2 as a sero
logicalm ark er for experim ental and natural infect ion. A rch V iro,l
2001, 146 ( 6) : 11971211.
[ 12] Ann etteM , BerndH. Rep licat ion of porcine circovirus two encoded
by th e viral rep gen e. V irology, 2001, 279: 420438.
[ 13] H am elAL, L in LL, N ayar GP. Nu cleot ide sequ ence of porcin e cir
covirus associatedw ith postw ean ing mu lt isys tem icw asting synd rom e
in p igs. JV iro,l 1998, 72: 52625267.
[ 14] M eehan BM, M cNeilly F, Todd D, et a.l Characterisat ion of novel
circov iru ses associatedw ith w ast ing syndrom es in p igs. JGen V iro,l
1998, 79: 21712179.
[ 15] 王光祥,郑海学,刘湘涛,等.猪圆环病毒 2型河北株的全基因
组克隆与系统进化分析.动物医学进展, 2008, 29( 10 ): 14.
[ 16] 温国元,罗青平,杨峻,等.猪圆环病毒 2型 HBZX株的全基因
组克隆及序列分析.湖北农业科学, 2008, 47( 10 ) : 11171121.
[ 17] 刘方娜,刁有祥,高晓伟,等.猪圆环病毒 2型山东株全基因组
的克隆与序列分析.中国兽医学报, 2008, 28( 5 ) : 501505.
198