全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第9期
收稿日期 : 2012-02-14
作者简介 : 谢昕 , 女 , 本科 , 研究方向 : 生物制药技术 ; E-mail: xx822000@163.com
通讯作者 : 黄继翔 , 男 , 硕士 , 研究方向 : 应用微生物和发酵食品 ; E-mail: program9527@163.com
化学合成农药是目前控制农业真菌病害的主要
手段，但随着人们对环保和健康关注程度的提高，
化学合成农药的毒性、污染、残留、生态破坏等问
题日益受到关注，其使用受到越来越严格的控制，
而安全性高、绿色环保的微生物农药则成为一种新
兴的替代方法。在目前病原真菌拮抗微生物研究中，
芽孢杆菌是主要研究对象，具有多种拮抗机制，包
括产生多种类型的抗菌成分、定殖和营养竞争、诱
导系统抗性等，可形成对高温、干燥等不利环境条
件具有高耐受性的芽孢，因此在生防微生物制剂的
生产成本、剂型开发上具有优势。但微生物农药的
不足之处也很明显，如见效速度慢、作用范围较窄、
耐候性差、效果不稳定等。针对微生物农药的不足，
本研究从广谱拮抗和不同温度下抗菌能力两方面对
芽孢杆菌菌株进行了筛选和鉴定，并初步确定了抑
菌物质的发酵条件，旨在为菌株的进一步利用提供
参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株来源 供试芽孢杆菌菌株 196 株，来自本
实验室建立的抗真菌芽孢杆菌库。植物病原真菌：Ce-
ratocystis fimbriata，Fusarium oxysporu，Colletotrichum
capsici，Verticillium dahliae，Ceratobasidium cornige-
植物病原真菌广谱拮抗菌的筛选鉴定及
发酵条件初步研究
谢昕1 杨英歌1 黄继翔2
（1 徐州生物工程职业技术学院生物工程系，徐州 221000 ；2 德州昂立达生物技术公司，德州 253000）
摘 要： 通过对峙培养法筛选到对 8种植物病原真菌具有拮抗作用的芽孢杆菌菌株，通过测量 10-30℃下的抑菌圈直径发现
AFB037菌株在不同温度下抑菌效果最好。通过表型和 16S rDNA序列分析将 AFB037菌株鉴定为多粘类芽孢杆菌。AFB037菌株抗
菌成分的产生需要真菌菌体成分的诱导，提示其有效成分可能为细胞壁降解酶类。
关键词： 植物病原真菌 广谱拮抗 鉴定 发酵条件
Identification and Fermentation of a Strain with Broad-spectrum
Antifungal Activity to Plant Pathogenic Fungi
Xie Xin1 Yang Yingge1 Huang Jixiang2
（1Department of Bioengineering，Xuzhou Bioengineering Polytechnic College，Xuzhou 221000；
2Onlystar Biotechnology Co.，Ltd，Dezhou 253000）
Abstract: 23 strains of spore-forming bacteria were screened by dual-culture with broad-spectrum antifungal activity to plant pathogenci
fungi. A strian named AFB037 had the best antifungal activity in temperature from 10℃ to 30℃. The AFB037 strain was identified as
Paenibacillus polymyxa by phenotypic properties and 16S rDNA sequence. Its activity was induced by some component in fungal cell and
depressed by glucose and ammonium sulphate. A elementary optimization was studied，including the concentration of Ceratocystis fimbriata
hypha，nitrogen source and concentration，the culture time.
Key words: Plant pathogenic fungi Broad-spectrum antifungal activity Identification Fermentation condition
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第9期144
rum，Phytophora capsici，Penicillium expansum，Botry-
tis cinerea，本实验室保存。
1.1.2 试剂和培养基 所有试剂均为市售分析纯。
GYP 培养基（g/L）：葡萄糖 5，蛋白胨 3，酵母浸粉 3，
pH 自然，121℃灭菌 15 min，根据需要加入琼脂 10 g。
1.2 方法
1.2.1 菌株筛选 利用对峙培养法进行筛选，8 种指
示菌分别接种至 GYP 斜面，25℃培养 6 d，加入 0.1%
（W/V）Tween80 溶液 5 mL，剧烈震荡 2 min 得菌悬
液，取 0.1 mL 菌悬液涂布 GYP 平板，点种芽孢杆菌
菌株，30℃培养 3 d，观察芽孢杆菌菌落周围抑菌圈
的有无，选择对 8 种指示菌均可产生抑菌圈的芽孢
杆菌菌株，以 C. fimbriata为指示菌，培养基和接种
方法同上，分别在 10℃、20℃、30℃下培养 6 d、4 d、
3 d，测量抑菌圈直径，选择不同温度下抑菌圈直径
最大的菌株。
1.2.2 拮抗菌株的鉴定 菌体形态观察和生理生化
试验参照《常见细菌系统鉴定手册》［1］，16S rDNA
序列测定由北京华大基因技术有限公司完成。测序
结果使用 Blastn 比对初步确定种，利用有关种的公
认标准序列数据，使用 MEGA4.0 对齐、计算序列间
距离并做系统发育分析，参数为 NJ 法、Kimura2、
Pairwisedeletion。
1.2.3 发酵条件初步研究
1.2.3.1 发酵液抑菌能力的测量 以 C. fimbriata为
指示菌，菌悬液制备及平板涂布同 1.2.1。芽孢杆菌
菌株发酵液 6 000 r/min 离心 15 min，取上清液经 0.22
μm滤膜过滤后，取150 μL滤液用杯碟法测定抑菌性。
指示菌培养条件为 25℃，培养时间 3 d。测量抑菌
圈直径。
1.2.3.2 芽孢杆菌接种液制备 300 mL 锥形瓶内装
入 GYP 液体培养基 50 mL，接入 1 环芽孢杆菌菌体，
30℃下 140 r/min 震荡培养 48 h 为接种液，用于以下
各项试验。
1.2.3.3 碳源种类的影响 培养基组成（g/L）：蛋白
胨2、酵母浸粉2、碳源10。使用的碳源种类为葡萄糖、
蔗糖、乳糖、麦芽糖、纤维二糖、棉籽糖、胶体几
丁质、葡甘露聚糖、木聚糖、葡聚糖、可溶性淀粉。
300 mL 锥形瓶装液量 50 mL，接种量 2%，30℃下
140 r/min 震荡培养 24 h，按 1.2.3.1 方法测抑菌能力。
1.2.3.4 植物病原真菌菌体的影响 500 mL 锥形瓶
内装入 GYP 液体培养基 100 mL，分别接入 8 种植
物病原真菌菌悬液 0.2 mL，25℃下 140 r/min 震荡培
养 4 d 至菌丝球充分形成，双层纱布过滤得湿菌体，
放入 50℃烘箱内热风干燥 24 h，粉碎后得菌体粉末。
培养基组成（g/L）：蛋白胨 2、酵母浸粉 2，菌体粉
末 5。培养条件同 1.2.3.2。以未接种芽孢杆菌的空白
培养基作为对照。
1.2.3.5 真菌菌体浓度的影响 培养基组成（g/L）：
蛋白胨 2、酵母浸粉 2，C. fimbriata菌体粉末分别为 0、
1.0、2.0、5.0、10.0、15.0、20.0。培养条件同 1.2.3.3，
测量发酵液抑菌能力。
1.2.3.6 氮源种类的影响 基本培养基（g/L）为：C.
fimbriata菌体粉末10.0，所使用的氮源种类及浓度为：
（NH4） 2SO4 0.01 mol/L、NH4Cl 0.02 mol/L、NaNO3 0.02
mol/L、蛋白胨 1.75 g/L、酵母浸粉 2.8 g/L。培养条
件同 1.2.3.3，测量发酵液抑菌能力。
1.2.3.7 酵母浸粉浓度的影响 培养基组成（g/L）：
C. fimbriata菌体粉末 10.0，酵母浸粉用量分别为 0、
1.0、2.0、3.0、4.0、5.0。培养条件同 1.2.3.3，测量
发酵液抑菌能力。
1.2.3.8 小分子碳氮源浓度的影响 培养基组成
（g/L）：C. fimbriata 菌 体 粉 末 10， 酵 母 浸 粉 2.0。
葡 萄 糖 浓 度 分 别 为 0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0，
（NH4） 2SO4 浓度分别为 0、0.5、1.0、1.5、2.0。培养
条件同 1.2.3.3，测量发酵液抑菌能力。
1.2.3.9 培养时间的影响 培养基组成（g/L）：C. fim-
briata菌体粉末 10.0，酵母粉 2.0。250 mL 锥形瓶装
液量 50 mL。芽孢杆菌接种培养条件同 1.2.3.2，接
种后每隔4 h取样测量发酵液抑菌能力，共测量48 h。
2 结果
2.1 菌株筛选
从保存的 196 个芽孢杆菌菌株中筛选到 23 株对
8 种植物病原真菌均具有一定拮抗能力的菌株。以
Ceratocystis fimbriata为指示菌测量了 23 个菌株在不
同温度下的抑菌能力，发现 AFB037 菌株在 10-20℃
下的抑菌圈直径显著高于其他菌株，而在 30℃下
培养时大部分菌株的抑菌圈直径约为 30 mm，结
2012年第9期 145谢昕等 ：植物病原真菌广谱拮抗菌的筛选鉴定及发酵条件初步研究
果见图 1。选择在 10-20℃范围内抑菌能力最好的 AFB037 菌株做进一步研究。
2.2 Bacillus sp. AFB037菌株的鉴定
Bacillus sp. AFB037 菌株在 GYP 平板上形成表
面光滑、凸起的白色菌落。芽孢椭圆、膨大，偏端生；
为兼性厌氧菌，过氧化氢酶阳性、氧化酶阴性、厌
氧条件下代谢葡萄糖产气，V.P. 反应阳性，不耐受 5%
NaCl，最低生长温度 2℃，最适生长温度 26-30℃，
37℃生长不良，40℃生长微弱，有氧条件下代谢以
下糖类产酸 ：甘露醇、山梨醇、木糖、麦芽糖、棉
籽糖、乳糖、半乳糖、纤维二糖、甘油。有氧条件
下代谢以下糖类不产酸 ：葡萄糖、海藻糖、松二糖。
图 1 不同温度下芽孢杆菌菌株抑菌圈直径
能够降解淀粉、酪蛋白、明胶、木聚糖、酵母细胞壁。
不能降解果胶、Tween80、卵磷脂、海藻酸钠、几丁
质、尿素，不能利用柠檬酸、乙酸、丙酸、丁二酸、
苯甲酸为唯一碳源。
系统发育结果（图 2）显示，Bacillus sp. AFB037
菌株的 16S rDNA 序列（GenBank 登录号 JF513085）
与 Paenibacillus polymyxa、P. azotofixans、P. peoriae、P.
jamilae、P. kribbensis具有最高相似度，均在 98.8%
以上。根据其表型特征和有关种［1］的比较（表 1），
鉴定 Bacillus sp. AFB0031 为 Paenibacillus polymyxa。
图 2 基于 16S rDNA序列构建的 Bacillus sp. AFB037与相关菌株的系统发育树
2.3 P. polymyxa AFB037产抑菌物质发酵条件的
确定
2.3.1 碳源种类和真菌菌体对发酵液抑菌能力的影
响 试验结果表明，以葡萄糖等 11 种物质为主要碳
源的发酵液均无抑菌性。但在涂有植物病原真菌的，
以葡萄糖为主要碳源的 GYP 平板上，P. polymyxa
AFB037 可产生明显抑菌圈，因此推测 P. polymyxa
AFB037 抑菌物质的合成可能需要某些真菌细胞成
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第9期146
分的诱导。通过液体培养获得 8 种病原真菌菌体，
经干燥粉碎后以 5 g/L 浓度加入培养基作为主要碳
源物质。结果显示，8 种病原真菌的菌体均可诱
导 P. polymyxa AFB037 发酵液抑菌能力的出现，对
C. fimbriata抑菌圈直径为 14.7-17.5 mm。未接种 P.
polymyxa AFB037 的培养基对 C. fimbriata无抑菌性，
排除了病原真菌自身代谢废物积累或自身毒素的影
响。在病原真菌菌体培养过程中发现 C. fimbriata生
物量最高，在随后的试验中均以干燥并粉碎的 C.
fimbriata菌丝体作为培养基成分。
2.3.2 真菌菌体浓度对发酵液抑菌性的影响 在含
有蛋白胨和酵母浸粉的培养基中加入不同浓度的 C.
fimbriata干燥菌丝体粉末，测试发酵液抑菌性，结
果（图 3）显示，培养基中不含真菌菌体时发酵
液无抑菌性，表明真菌菌体的存在是 P. polymyxa
AFB037 产生抑菌物质所必需的。真菌菌体浓度为
10 g/L 时发酵液抑菌性最高，浓度继续提高则发酵
液抑菌性缓慢下降。
酵母浸粉效果好于蛋白胨但差异不显著。对酵母浸
粉的浓度进行了测试，发现在 0-2.0 g/L 范围内发酵
液抑菌性与酵母浸粉浓度正相关，超过 2.0 g/L 后发
酵液抑菌性保持稳定。在后续试验中使用酵母浸粉
为氮源，浓度为 2.0 g/L。
表型 Bacillus sp. AFB037 P. polymyxa P. azotofixans P. peoriae P. jamilae
酪素水解 + + － + +
淀粉水解 + + － + +
甘油产酸 + + － － +
葡萄糖产气 + + + + －
表 1 Bacillus sp. AFB037与近缘种在生理特性上的比较
+. 阳性 ；－. 阴性
图 3 C. fimbriata菌体浓度对发酵液抑菌性的影响
2.3.3 氮源种类和浓度对发酵液抑菌性的影响 在
真菌菌体浓度为 10 g/L 下测量了不同氮源对发酵液
抑菌性的影响，结果（图 4）显示，有机氮源效果
显著优于 NH3、NO3- 形式的无机氮源。有机氮源中，
图 4 氮源种类对发酵液抑菌性的影响
2.3.4 小分子碳氮源对发酵液抑菌性的影响 分别
检测了葡萄糖和以硫酸铵形式存在的 NH3 对发酵液
抑菌性的影响，结果（图 5，图 6）显示，葡萄糖和
硫酸铵浓度与抑菌性负相关。
2.3.5 发酵时间对发酵液抑菌性的影响 P. polym-
yxa AFB037 发酵液在不同发酵时间的抑菌性，见图
7。在 0-20 h 内逐渐提高，20 h 后保持稳定。
图 5 葡萄糖浓度对发酵液抑菌性的影响
2012年第9期 147谢昕等 ：植物病原真菌广谱拮抗菌的筛选鉴定及发酵条件初步研究
3 讨论
针对拮抗菌株的抗菌谱和适用温度两个问题，
我们从本实验室的菌株库中筛选到 23 株对 8 种植物
病原菌具有拮抗性的芽孢杆菌菌株。在 10-30℃范
围内测定了菌株对 C. fimbriata的拮抗效果，所有菌
株的抑菌圈直径均与温度呈正相关。范青［2］和 Mari
等［3］也报道了生防菌株抑菌能力与温度的相关性，
在特定温度范围内，温度越高生防菌株抑菌效果越
好。认为从最低生长温度到最适生长温度范围内，
随温度提高，菌株的生长速度和物质合成速度逐渐
提高，所产生的抑菌物质逐渐增多，表现为抑菌能
力的增加。试验发现，AFB037 菌株的抑菌圈直径在
10℃、20℃下的抑菌能力显著高于筛选到的其他广
谱拮抗菌株。温度是影响微生物代谢的重要因素之
一，菌株在不同温度下的拮抗效果与其大田使用效
果密切相关，试验结果提示 AFB037 菌株更适合用
于开发微生物杀菌剂。
经生理生化性质和 16S rDNA 序列鉴定 AFB037
菌株为 Paenibacillus polymyxa，其他 22 个菌株分属
于 Bacillus属的 B. subtilis，B. lichenformis，B. pumilus，
B. amyloliquefaciens，与目前对植物病原真菌拮抗微
生物的研究主要集中在 Bacillus和 Paenibacillus属
中相吻合，菌株分布的广泛性和功能的多样性使
Bacillus和 Paenibacillus成为在农业生产中最具应用
潜力的微生物类群［4］。Paenibacillus属中菌株的最
适生长温度一般为 28-30℃，而 B. subtilis及其近缘
种的最适生长温度一般在 35-40℃范围内［1］。在农
业生产过程中，随季节、昼夜变化，环境温度难以
始终保持在 35℃以上，更多时间保持在 10-30℃范
围内［5］，认为 Paenibacillus属较低的最适生长温度
使其更适合作为生防微生物应用于农业生产。基因
组比较结果显示，同 Bacillus属相比，Paenibacillus
属在固氮、碳水化合物代谢、抗生素合成能力上占
优势［6］。Paenibacillus为兼性厌氧菌，而 B. subtilis
群中各种多为严格好氧菌，认为在土壤环境中
Paenibacillus更具优势。Hoon 等［7］对植物根际微生
物进行了研究，450 株产芽孢细菌中有 105 株在形
态上类似 Paenibacillus，最终鉴定为 Paenibacillus的
有 41 株，其中 23 株为 P. polymyxa、35 个菌株对植
物病原真菌具有拮抗能力。考虑到产芽孢细菌的多
样性，Paenibacillus属在根际微生物中的比例是相当
高的。目前对生防微生物的研究中，对 Bacillus属
的研究数量远高于 Paenibacillus属［8］，认为造成该
现象的原因是分离菌株时多采用较高的培养温度。
例如，37℃更容易分离出适应该温度的 Bacillus属
菌株而非 Paenibacillus属菌株。在今后研究中，可
考虑采用较低的培养温度以获得更为广泛的来自
Paenibacillus属的拮抗菌株资源。
P. polymyxa可产生多种类型的抗真菌成分，
包括小分子化合物［9］、以多黏菌株为代表的多肽
类［10，11］、抗菌蛋白［12］和酶类［13］，目前已报道的
酶类多为作用于真菌细胞壁多糖的降解酶类，如几
丁质酶、葡聚糖酶等［11］。研究发现，P. polymyxa
AFB037 在以葡萄糖为主要碳源的 GYP 培养基中单
独培养时不能合成抑菌物质，以病原真菌菌丝体为
主要碳源时发酵液具有抑菌活性，表明抑菌物质
的合成需要病原真菌细胞成分的诱导。Aktuganov
等［14］报道了 P. ehimensis IB-X-b 通过胞壁降解酶类
图 6 （NH4） 2SO4浓度对发酵液抑菌性的影响
图 7 发酵时间对发酵液抑菌性的影响
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第9期148
发挥拮抗作用，几丁质酶的合成需要底物的诱导，
而 β-1，3-葡聚糖酶的合成十分稳定，不受碳源种类
的影响。Nielsen 等［15］报道的两株 P. polymyxa的
细胞壁降解酶为组成型，其表达不受培养基成分的
影响。不同研究结果显示，培养基成分对抑菌物质
合成的影响在不同菌株间存在差异。在病原真菌菌
体培养基中加入葡萄糖可降低 P. polymyxa AFB037
发酵液抑菌性，葡萄糖浓度为 10 g/L 时发酵液抑菌
性基本消失，认为葡萄糖阻遏抑菌物质的产生。根
据本试验现象和其他研究报道，推测 P. polymyxa
AFB037 产生的抑菌物质可能为真菌细胞壁成分降解
酶类。真菌细胞壁成分以多糖为主，葡萄糖的存在
可阻遏多糖降解酶类的产生符合理论推测，但研究
中发现 NH4+ 也能降低发酵液抑菌性，其机理还有待
进一步研究。
4 结论
从广谱拮抗和宽泛作用温度两方面对植物病
原真菌拮抗芽孢杆菌菌株进行了筛选，获得一株在
10-30℃条件下抑菌效果最好的 AFB037 菌株，根据
表型和 16S rDNA 序列鉴定为 Paenibacillus polymyxa。
对 P. polymyxa AFB037 的抑菌成分发酵条件进行了
初步研究，抑菌成分的产生需要真菌菌丝体的诱导，
最适浓度 10 g/L，最适氮源为酵母浸粉，最适浓度
为 2 g/L，培养 20 h 后发酵液抑菌活性达到最大并保
持稳定。葡萄糖、NH4+ 等小分子碳氮源会可降低发
酵液抑菌活性，提示 P. polymyxa AFB037 菌株的抑
菌活性成分可能是胞壁降解酶类。
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（责任编辑 马鑫）