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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第8期
倍半萜烯类化合物（sesquiterpene）在自然界分
布广泛，是植物精油的重要组分，具有良好的生物
活性。圆柚酮［（+）-nootkatone］，又名诺卡酮，是
倍半萜烯类化合物瓦伦西亚烯［（+）-valencene］的
酮类衍生物，20 世纪 60 年代首次被发现于阿拉斯
加黄柏油和柚皮油的挥发性组分中，具有柚子、柑
橘、橙子的芳香气味，并带有甜的果皮、木香香韵，
作为香精香料可广泛应用于食品、化妆品、日用品
以及烟草等行业，具有极高的市场价值［1］。
圆柚酮在天然柚皮油中含量很低，一般很难从
中直接分离获得。目前，工业上最常用的方法是直
接氧化价格相对便宜的瓦伦西亚烯来获得。但是，
化学催化过程中往往采用一些非环境友好的氧化剂，
如三氧化铬、铬酸叔丁酯、乙酰丙酮酸钴或其他一
些重金属盐类，对环境造成严重的危害。近几十年来，
采用生物技术催化瓦伦西亚烯生成圆柚酮已成为这
一领域研究的新趋势［2，3］。
来源于巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）的
细胞色素 P450BM-3（cytochrome P450BM-3，CYP450BM-3）
是 CYP450 蛋白家族中特殊的一员，因其负责电子
转移的 FAD/FMN 还原酶结构域和亚铁血红素氧化
酶结构域都包含在同一条肽链中［4］，使得它具备
了成为工业用酶的独特优势。CYP450BM-3 能高效催
化其天然底物中长链饱和脂肪酸亚末端的羟基化
收稿日期 : 2012-01-06
基金项目 : 国家自然科学基金项目（81001475）, 杭州市科技发展计划项目（20101131N05）, 国家重大科技专项子课题（2008ZX07101-006-
05-KLNSPC2010A02）
作者简介 : 孟飞 , 男 , 硕士研究生 , 研究方向 : 分子遗传与基因工程 ; E-mail: quxiang06@yahoo.com.cn
通讯作者 : 俞春娜 , 女 , 博士 , 研究方向 : 分子生物学与药物代谢 ; E-mail: yuchunna@hznu.edu.cn
谢恬 , 男 , 博士 , 研究方向 : 中药天然药物与绿色化学 ; E-mail: tianxie.hznu@gmail.com
生物酶法催化瓦伦西亚烯生成圆柚酮
孟飞1， 2 俞春娜1 李海峰1 谢恬1
（1 杭州师范大学生物医药与健康研究中心，杭州 311121 ；2 杭州师范大学生命与环境科学学院，杭州 310036）
摘 要： 在体外，利用野生型 CYP450BM-3对瓦伦西亚烯进行催化，酶 -底物复合物催化 NADPH氧化的速率为 31±1.0 nmol
（nmol P450） -1min-1，但催化产物中没有检测到圆柚酮的生成。突变体 R47L/Y51F/F87A与底物复合物催化 NADPH氧化的速率高于
野生型，为 79±6.5 nmol（nmol P450）-1min-1，并在催化产物中检测到圆柚酮的生成，但其产物选择性较差，圆柚酮的含量仅占总
产物的 6.8%。与此同时，检测了另一个突变体 A74G/F87V/L188Q对瓦伦西亚烯的催化效果，发现其与底物复合物对 NADPH的氧
化速率与突变体 R47L/Y51F/F87A相当，但产物中圆柚酮的比率更高，达 8.0%。
关键词： 圆柚酮 瓦伦西亚烯 细胞色素 P450BM-3 突变体 生物催化
Production of （+）-Nootkatone from （+）-Valencene by Biocatalysis
Meng Fei1， 2 Yu Chunna1 Li Haifeng1 Xie Tian1
（1Centre for Biomedicine and Health，Hangzhou Normal University，Hangzhou 311121；2School of Life and Environmental Science，
Hangzhou Normal University，Hangzhou 310036）
Abstract: Wild-type CYP450BM-3 showed NADPH oxidation rate of 31±1.0 nmol （nmol P450）-1min-1 in vitro, however, （+）-nootkatone
could not be detected in the products. The R47L/Y51F/F87A mutant had higher activity of 79±6.5 nmol （nmol P450）-1min-1. However, it was
much less selective and （+）-nootkatone constituted 6.8% of the total products. Meanwhile, another mutant A74G/F87V/L188Q was found to
have similar NADPH oxidation activity with the R47L/Y51F/F87A mutant but a higher （+）-nootkatone ratio of 8.0% was generated.
Key words: （+）-Nootkatone （+）-Valencene Cytochrome P450BM-3 Mutant Biocatalysis
2012年第8期 195孟飞等 ：生物酶法催化瓦伦西亚烯生成圆柚酮
反应，但它也可氧化结构不同于天然底物的某些
物质。目前，定点突变和定向进化技术已被用于
对 CYP450BM-3 进行蛋白结构改造，以便获得对目标
底物具有良好催化活性的突变体［5-10］。已有文献报
道，野生型 CYP450BM-3 对瓦伦西亚烯具有氧化活性，
但产物中没有圆柚酮，而其突变体则能有效氧化瓦
伦西亚烯生成圆柚酮（图 1）［11］。本研究旨在寻找
对瓦伦西亚烯具有更高催化效率和产物特异性的
CYP450BM-3 突变体。
识别序列），反向引物 ：5-GGAATTCTTA（ATG） 6
CCCAGCCCACACGTC-3（下划线处为 EcoR Ⅰ酶切
识别序列）。用限制性内切酶 NcoⅠ和 EcoR Ⅰ双酶
切表达载体 pET-28a（+），分别连接入目的基因，
构建重组表达质粒。PCR 引物合成及 DNA 测序由上
海生物工程有限公司完成，重组表达质粒 pET28a-
A74G/F87V/L188Q 由宝生物工程（大连）有限公司
构建。
1.2.2 CYP450BM-3 及其突变体的表达和纯化 将
重组质粒转化 E. coli BL21（DE3），使用含卡那霉
素（50 μg/mL）的 LB 培养液进行目的蛋白的诱导表
达。诱导条件 ：接种量 1‰（体积分数），于 37℃
下 180 r/min 振荡培养，直至培养液 OD600 约为 0.5，
加入 IPTG 至终浓度为 0.5 mmol/L，于 30℃下 120
r/min 诱导表达 16 h。离心收集菌体，用 pH7.5 的磷
酸盐缓冲液进行重悬，超声破碎并再次离心，取上
清采用固相金属亲和层析（immobilized metal affinity
chromatography，IMAC）进行纯化，亲和配体为 Ni-
NTA［13］。纯化后的蛋白溶液经过透析脱盐和浓缩处理
后，加 50%（V/V）甘油 -80℃保存。蛋白表达和纯
化的效果采用 SDS-PAGE 电泳检测，Bradford 法用
于测定蛋白浓度。
1.2.3 NADPH 氧化速率的测定 将下列溶液混匀
（总体积 1.5 mL）：100 mmol/L 的磷酸钾溶液（pH8.0）、
1 μmol/L CYP450BM-3 和过氧化氢酶（25 μg/mL），加
入瓦伦西亚烯乙醇溶液（10 mmol/L）至终浓度为
200 μmol/L。将混合液置于 30℃温浴 2 min，加入
NADPH 溶液（20 mg/mL）至 250 μmol/L，在 340 nm
处进行监测。用 ε340（6.22 mmol-1 cm-1）计算 NADPH
的氧化速率。
1.2.4 瓦伦西亚烯氧化产物的气相色谱分析 当
反应液中所有 NADPH 都已被氧化消耗后，加入内
标物香芹酮乙醇溶液（10 mmol/L），至终浓度为 50
μmol/L，再加入 300 μL 氯仿，充分混匀，4℃离心并
分离出有机层，用于气相色谱分析。色谱条件 ：岛
津 Rtx-1 毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；柱
温程序 ：起始温度 150℃，以 5℃/min 的速率升温至
230℃ ；载气为氦气，流速 1 mL/min，分流比 20 1 ；
进样口和检测器温度均为 250℃。
图 1 CYP450BM-3突变体氧化瓦伦西亚烯生成圆柚酮
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种与质粒 大肠杆菌 BL21（DE3）、pET-
28a（+）表达载体均由本实验室保藏。重组质粒 pM-
D19-CYP450BM-3 和 pMD19-R47L/Y51F/F87A已由本实
验室构建。
1.1.2 试剂与器材 限制性内切酶、Taq DNA 聚合
酶及 T4 DNA 连接酶等均购自宝生物工程（大连）有
限公司。IPTG购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司。
Ni Sepharose 6 Fast Flow 购自 GE Healthcare 公司。圆
柚酮、瓦伦西亚烯和香芹酮（（+）-carvone）购自
Sigma-Aldrich 公司，并都为色谱纯或最高纯度水平。
NADPH 氧化速率分析使用的是岛津 UV-2550 紫外
可见分光光度计。气相色谱分析使用的是岛津 GC
2010 气相色谱仪，配备火焰离子化检测器。
1.2 方法
1.2.1 重组表达质粒的构建 常规的分子生物学操
作根据分子克隆实验指南进行［12］。设计引物，在野
生型 CYP450BM-3 基因（GenBank 登录号 J04832）及
突变体 R47L/Y51F/F87A 的两端引入合适的限制性
酶切位点，并在终止密码子前插入 6 个组氨酸密码
子。正向引物 ：5-CATGCCATGGCAATGACAATTA
AAGAAATGCCTCAGCC-3（下划线处为 NcoⅠ酶切
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第8期196
2 结果
2.1 野生型和突变型CYP450BM-3蛋白的表达和纯化
野生型 CYP450BM-3 及 2 个突变体均采用了相同
的表达和纯化条件。取菌体破碎液上清和目的蛋白
纯化样品进行 SDS-PAGE 电泳，CYP450BM-3 的分子
量约为 119 kD（图 2）［4］。
所以试验中并未对瓦伦西亚烯氧化生成的其他产物
进行定性和定量分析，但这并不影响对圆柚酮生成
效率的评定。
瓦伦西亚烯氧化反应液中的圆柚酮浓度是以
内标物香芹酮浓度作为参照，采用氢火焰离子化检
测器进行测定。建立内标法标准曲线，对野生型
CYP450BM-3、R47L/Y51F/F87A 和 A74G/F87V/L188Q
催化产物进行气相色谱定量分析。
对 CYP450BM-3 氧化产物的气相色谱分析结果
（表 1）表明，野生型酶催化瓦伦西亚烯生成了
多种产物，但是没有发现圆柚酮的产生（图 3）。
R47L/Y51F/F87A 催化体系中圆柚酮的终浓度为 17.1
μmol/L，圆柚酮占总产物的比率为 6.8%（图 4）。
A74G/F87V/L188Q 催化体系中圆柚酮的终浓度为
20.1 μmol/L，目标产物与总产物的比率为8.0%（图5）。
上述比率被定义为圆柚酮终浓度比 NADPH 起始浓
度，并以百分比的形式表示，这一定义的前提是每
消耗掉一分子的 NADPH 即生成一分子的产物［11，14］，
即氧化反应产物的总浓度等于 NADPH 的起始浓度。
M. 蛋白质 Marker ；1-3. 分别为野生型 CYP450BM-3、R47L/Y51F/F87A
和 A74G/F87V/L188Q 上清液；4-6. 分别为经纯化的野生型 CYP450BM-3、
R47L/Y51F/F87A 和 A74G/F87V/L188Q 蛋白
图 2 野生型 CYP450BM-3及其突变体 SDS-PAGE
2.2 酶-底物复合物催化NADPH氧化速率的比较
CYP450BM-3 的天然底物是中长链脂肪酸，但除
天然底物外，对可进入其活性区域的物质可能也具
有催化活性。野生型 CYP450BM-3-底物复合体催化
NADPH 氧化的速率为 31 nmol（nmol P450）-1min-1，
两种突变体 R47L/Y51F/F87A 和 A74G/F87V/L188Q
与底物复合物对 NADPH 的氧化速率相近，分别
为 79 nmol（nmol P450）-1min-1 和 77 nmol（nmol
P450）-1min-1（表 1）。与野生型酶相比，两种突变
体的 NADPH 氧化速率均提高了一倍多。
表 1 CYP450BM-3及其突变体对（+）-valencene的氧化活性
CYP450BM-3 NADPH 氧化速率nmol（nmol P450）-1min-1
（+）-nootkatone
比率（%）
野生型 31±1.0 —
R47L/Y51F/F87A 79±6.5 6.8
A74G/F87V/L188Q 77±7.2 8.0
2.3 定量气相色谱分析
以氯仿为溶剂，建立香芹酮、瓦伦西亚烯和圆
柚酮标准品的气相色谱图，其保留时间分别为 3.2、
5.8 和 10.3 min。由于本研究的目标产物是圆柚酮，
图 4 突变体 R47L/Y51F/F87A氧化瓦伦西亚烯
产物的气相色谱
图 3 CYP450BM-3氧化瓦伦西亚烯产物的气相色谱
2012年第8期 197孟飞等 ：生物酶法催化瓦伦西亚烯生成圆柚酮
3 讨论
第 47 位精氨酸和第 51 位酪氨酸侧链共同位
于底物进入酶活性中心的通道入口处，根据文献报
道，R47L/Y51F 联合突变可增强 CYP450BM-3 对疏水
有机化合物的氧化活性，但对瓦伦西亚烯的催化效
率却没有明显的提高［11］。与野生型酶相比，突变体
R47L/Y51F/F87A 对瓦伦西亚烯的较高活性暗示了，
第 87 位苯丙氨酸在酶催化作用中扮演着重要的角
色。第87位苯丙氨酸突变为较小的丙氨酸后（F87A），
可以使底物更接近于血红素，促进了酶对复杂结构
化合物如多环芳烃的氧化［15］。
突变体 A74G/F87V/L188Q 在以往的研究中表现
出对多环芳香烃化合物具有良好的催化活性［16］。基
于同是 CYP450BM-3 非天然底物的催化反应，本研究
检测了该突变体对瓦伦西亚烯的氧化活性及其产物
选择性。F87V 对酶活性的影响和 F87A 相似，由于
同样是位于底物进入通道入口侧的第 74 位丙氨酸和
第 188 位亮氨酸发生突变，从而迫使酶活性区域构
象发生了有利于圆柚酮生成的变化。
对于野生型 CYP450BM-3 及其突变体 R47L/Y51F/
F87A 来说，圆柚酮都是比瓦伦西亚烯更合适的底
物［11］。为了尽量减少反应中生成的圆柚酮与酶结合
并被进一步氧化，本研究采取的策略是使底物瓦伦
西亚烯充分过量。此外，NADPH 的起始量对所有产
物的生成及比例也有重要的影响。在后续的研究中，
除了可对 CYP450BM-3 开展进一步的蛋白质结构改造
外，也可对植物中天然存在的圆柚酮合成酶［17］进
行研究，以期开发出具有更高活性和产物特异性的
催化酶。
4 结论
本研究成功获得了一个新的可催化瓦伦西亚烯
生成圆柚酮的 CYP450BM-3 突变体 A74G/F87V/L188Q，
其表现出迄今为止最好的产物特异性，同时兼具较
高的催化活性。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）