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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(5):78-83
环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal
amplification，LAMP）是一种新型的核酸扩增技术，
该方法针对靶基因的 6 个区域设计 4 种引物，在等
温 60-65℃条件下利用 Bst 聚合酶即可进行 109-1010
倍的核酸扩增［1，2］。LAMP 产物通过浊度或者荧光
变化可用肉眼观察，具有操作简便、特异性强、灵
敏度高等优点［3，4］。自 2000 年环介导等温扩增技
术问世以来，该方法在病原体检测、疾病诊断等领
域广泛应用［5-8］。如何在现有的 LAMP 技术基础上，
发掘更高效快速的等温扩增方法，成为重要的研究
方向，目前最快速的 LAMP 反应方法是加入环引
物［9，10］。本研究设计一种新型快速的等温扩增方法，
改变其现有的引物设计方法，使环介导等温反应扩
增完成的时间比加入环引物所用的时间更短。
流行性感冒病毒，属于正黏液病毒科，是一种
造成人类及动物患流行性感冒的 RNA 病毒，它会造
成急性上呼吸道感染，并在空气中迅速传播，在世
界各地常会有周期性的大流行［11，12］。人流感病毒分
为甲（A）、乙（B）、丙（C）三型，其中甲型流感
病毒是变异最为频繁的一个类型［13］。2009 年起源
于墨西哥的的甲型 H1N1 流感病毒爆发流行造成全
球数千万人大流行，死亡人数达到 1 800 多人［14， 15］。
收稿日期 ： 2014-08-14
基金项目 ：国家质检公益性行业科研专项项目（201010043），国家质检总局科技项目（2013IK245）
作者简介 ：吕沁风，女，硕士，副主任技师，研究方向 ：传染病检测 ；E-mail ：fionallll@163.com
甲型 H1N1 流感病毒 FAST-LAMP 检测方法的建立
吕沁风  罗鹏  何蕾  杨永耀  郑伟  李莉  吴忠华 
（浙江国际旅行卫生保健中心，杭州 310003）
摘 要 ： 建立一种新型等温扩增检测方法，用于提高等温扩增反应的检测速度，应用于甲型 H1N1 流感病毒检测。根据 HA
基因设计一组引物，包括外引物、内引物、环引物及套内引物，套内引物的加入增加了引物与模板的接触位点，提高扩增效率，
缩短检测时间。结果显示，FAST-LAMP 检测法比普通 LAMP 检测法时间缩短 45 min 左右，比加入环引物的 LAMP 检测方法缩短
20 min，大大缩短了反应的检测时间。检测灵敏度可达到 1×102 拷贝。FAST-LAMP 是一种高效、更快的检测方法。
关键词 ： FAST-LAMP ；甲型 H1N1 流感病毒 ；检测
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.013
The Establishment of FAST-LAMP Method for Detecting Influenza A
（H1N1）Virus
Lü Qinfeng Luo Peng He Lei Yang Yongyao Zheng Wei Li Li Wu Zhonghua
（Zhejiang International Travel Healthcare Center，Hangzhou 310003）
Abstract: It was to establish a new loop-mediated isothermal amplification（FAST-LAMP）for rapidly detecting influenza A（H1N1）
virus. A set of primers were designed according to HA gene, including the outer primers, internal primers, loop primers and nest internal primers.
The nest internal primers increased the contact sites of primers and nucleic acid template, so that the amplification efficiency could be improved
and detection time reduced. The FAST-LAMP method could be 45 less than LAMP method, and 20 minutes less than LAMP method with loop
primers, i.e. detection time reduced significantly detecting sensitivity reached 1×102 copies cDNA template/tube. It proved that the established
FAST-LAMP method is an efficient and reliable method for detecting influenza A（H1N1）virus.
Key words: FAST-LAMP ；H1N1 influenza virus ；detection
2015,31(5) 79吕沁风等：甲型H1N1 流感病毒 FAST-LAMP 检测方法的建立
在大流行后期，该病毒仍在流行，实验室检测证实
该病毒在 2013 年仍为欧洲、亚洲等地流感的流行
株［16-23］。2013 年美国、中国内地仍有死亡病例报
道［24-27］。本试验以甲型 H1N1 流感为例研究新型快
速等温扩增检测，旨在为了建立新型等温扩增方法，
提高检测速度提供帮助。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂 RNA 提取试剂盒和胶回收试剂盒购用
QIAGEN 公 司，AMV 逆 转 录 酶 购 自 Promega 公 司，
Bst-DNA polymerase 购自 NEB 公司。TaKaRa Ex Taq
酶和 dNTP 购自 TaKaRa 公司，RNase Inhibitor 购自
Fermentas 公司，MgSO4 和 Betain 为 Sigma-Aldrich 公
司产品，EVA Green 购自 Biotium 公司、DNA Marker
DL2000 和 琼 脂 糖 Agrose 购 自 TaKaRa 公 司。 甲 型
H1N1 流感病毒、甲型 H3N2 流感病毒、乙型流感病
毒、水痘病毒、副流感病毒、人偏肺病毒等为本室
保存。
1.1.2 仪 器　2720 型 PCR 仪 和 7500 型 荧 光 定 量
PCR 仪购置购自 ABI 公司，电泳仪购自 Bio-Rad 公司。
1.2 方法
1.2.1 引物设计　常规 LAMP 技术含有一对外引
物，一对内引物，选择加入一对环引物，可在等温
条件下进行核酸扩增。本研究根据甲型 H1N1 流感
病毒血凝素（hemagglutinin，HA）基因保守区设计
一组引物族［20，27］，引物的设计是在带有环引物的
外 FIP1 和外 BIP1 的扩增产物区域再次设计内 FIP2
和内 BIP2 引物，使得 FIP1 和 BIP1 的产物能再次成
为 FIP2 和 BIP2 的 LAMP 扩 增 模 板，FIP1 和 BIP2、
FIP2 和 BIP1 也同时形成正常的 LAMP 扩增系统。
即本套引物同时形成了 4 套独立的 LAMP 扩增系统，
从而使扩增速率增加。引物序列，见表 1。
1.2.2 病毒 RNA 的提取　严格按 QIAGEN RNA 抽
提 试 剂 盒 说 明 书 提 取 病 毒 RNA， 溶 于 100 μL 无
RNase 水中，-70℃保存。
1.2.3 反应体系及反应条件 FAST-LAMP 反应体系
如下 ：10×buffer 2.5 μL，引物混合物 1 μL（引物混
合物中各引物浓度分别如下 ：F3、B3 各 1 μmol/L，
FIP、BIP 各 15 μmol/L，Loop-f、Loop-r 各 5 μmol/L，
FNP、BNP 各 15 μmol/L），模板 RNA 1 μL，8 U Bst-
DNA 聚合酶 1 μL，10 U AMV 逆转录酶 1 μL，甜菜
碱（8 mol/L）2 μL，dNTP（10 mmol/L）2 μL，MgSO4
（100 mmol/L）1.2 μL，1.25 μL 20× 的 Eva green 加
入 DEPC-H2O 补足 25 μL。普通 RT-LAMP 反应体系
除引物混合物为（引物混合物中各引物浓度分别如
下 ：F3、B3 各 1 μmol/L，FIP、BIP 各 15 μmol/L），
加入环引物的引物混合物为（F3、B3 各 1 μmol/L，
FIP、BIP 各 15 μmol/L，Loop-f、Loop-r 各 5 μmol/L），
其他与 FAST-LAMP 一致，反应条件为 ：63℃，55 s，
荧光采集 5 s，100 个循环在荧光定量 PCR 仪（Chr-
omo4-Bio-Rad 公司）中进行。引物混合物中各引物
浓度，见表 2。
1.2.4 灵敏度试验 利用反转录试剂盒中的随机引
物法将提取好的 RNA 反转录成 cDNA，以 cDNA 为
模板，用 PCR 引物进行扩增，将 PCR 产物纯化回
收试剂盒进行纯化回收，对纯化后的 PCR 产物测定
OD 值，根据产物长度和 OD 值进行 copies 数计算。
将 cDNA 进行 10 倍递进稀释，取 1 μL 作为模板加
入反应体系中，在 63℃恒温条件下，反应 60 min。
在荧光定量 PCR 仪上观察实时荧光反应图，并取 2
μL 反应产物进行 1％琼脂糖凝胶电泳。
1.2.5 特异性试验 利用 FAST-LAMP 反应体系，以
H3N2、乙型流感、水痘病毒、人偏肺病毒、副流感
病毒等核酸作为待测样品进行检测，观察实时荧光
反应，并将扩增产物进行电泳分析。
1.2.6 重复性试验 根据灵敏度试验结果选择阴
表 1 甲型 H1N1 流感病毒核酸 FAST-LAMP 扩增引物
引物 序列（5-3）
F3 AAGACAAGTTCATGGCCCAATC
B3 CGGCTGCATATCCTGACCC
FIP1 CCGGCTTGAACTTCTTGCTGTAGGGGCATTCACCAT-
CCATCT
BIP1 GTGCTATAAACACCAGCCTCCCAGGCCAGTCTCAAT-
TTTGTGCTT
Loop-f GCATTCTGATAGAGACTTTGTTGGT
Loop-r TTCAGAATATACATCCGATCACAAT
FIP2 TGGACACTAGTAGAGCCGGGAGACAGACCCAAAGT-
GAGGGATCAAGAA
BIP2 TCATTTCAGATACACCAGTTCACGATTGCCTTGGGTG-
TCTGACAAGTTGTATTG
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.580
性、1×102 copies/μL、1×104 copies/μL 和 1×106
copies/μL 浓度的 cDNA 模板分别进行 FAST-LAMP，
每份样本各取 1 μL 重复 3 次，采用实时荧光定量
PCR 仪进行检测，观察反应的 Ct 值，根据 Ct 值计
算变异系数，对该方法的重复性进行考核。
1.2.7 扩增方法反应时间比较 将普通 LAMP、加
入环引物 LAMP 和 FAST-LAMP 反应采用同一样本
同时检测，反应条件为 63℃，55 s，荧光采集 5 s，
100 个循环。
1.2.8 产物测序分析 将 FAST-LAMP 的扩增产物胶
回收后进行序列分析，分别采用内引物和套内引物
为测序引物。
1.2.9 样本检测 收集浙江口岸机场发热人员鼻
咽拭子 35 份，根据说明书提取 RNA，采用 FAST-
LAMP 技术进行检测。将检测结果与荧光定量 PCR
结果进行比对。
2 结果
2.1 不同扩增方法反应时间的比较
根据实时荧光检测的结果（图 1）可见，FAST-
LAMP 的反应时间控制在 40-45 min 左右，加入环引
物的 LAMP 反应时间为 65 min 左右，普通 LAMP 反
应时间在 90 min 左右。
0.9
1.0
0.8
0.7
0.6
0.5Fl
u
0.4
0.3
0.2
0.1
0
25
1 2 3
75 10050
Cycle
1 ：FAST-LAMP reaction ；2 ：loop-primer LAMP reaction ；
3 ：Ordinary LAMP reaction
图 1 甲型 H1N1 流感病毒不同扩增方式实时荧光检测
2000
bp
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
1000
750
500
250
100
M ：DNA marker ；1 ：positive ；2，3 ：H1N1（2009）；4，5 ：H3N2 ；6，7 ：
Influenza B ；8 ：Varicella-zoster virus ；9 ：Respiratory syncytial virus ；10 ：
hMPV ；11 ：Negative
图 2 甲型 H1N1 流感病毒 FAST-LAMP 特异检测电泳图
2.2 特异性试验结果
采用甲型 H1N1 流感病毒 FAST-LAMP 方法进行
检测，电泳反应结果（图 2）显示，甲型 H1N1 流
感病毒出现与普通 LAMP 反应相似的阶梯状条带，
且条带比普通 LAMP 反应更多。此外，阴性对照、
H3N2 病毒、乙型流感病毒、水痘病毒、人偏肺病毒
和副流感病毒核酸的检测结果均为阴性，由此显示
了该方法具有较好的特异性。
表 2 各反应体系中的引物组成及引物浓度
引物体系 引物组成 引物浓度 /（μmol·L-1）
PCR 引物 F3 10
B3 10
常规 LAMP 引物 F3 1
B3 1
FIP1 15
BIP1 15
环引物 LAMP 引物 F3 1
B3 1
FIP1 15
BIP1 15
Loop-f 5
Loop-r 5
FAST-LAMP 引物 F3 1
B3 1
FIP1 15
BIP1 15
Loop-f 5
Loop-r 5
FIP2 15
BIP2 15
2.3 灵敏度试验结果
在荧光定量 PCR 仪上观察实时荧光反应图，结
果见图 2 ；并取 2 μL 反应产物进行 1％琼脂糖凝胶
2015,31(5) 81吕沁风等：甲型H1N1 流感病毒 FAST-LAMP 检测方法的建立
电泳，结果见图 3，1-5 泳道均出现细密的阶梯状条
带，表示出现有阳性扩增反应。可以判定本方法的
检测极限约为 1×102 copies/μL。
物 BNP，套内引物 FNP 和内引物 BIP 组合均能扩增
出相应的产物，环引物也能与 FNP 扩展出相应的产
物。由此可证明本检测方法中各引物之间确实能各
自组合扩增。
2.6 临床样本检测
采用 FAST-LAMP 技术进行检测结果发现，35
例机场口岸送检本实验室的鼻咽拭子样本中有 8 例
甲型 H1N1 流感病毒阳性，与荧光定量 PCR 检测结
果相符。
3 讨论
环介导等温扩增技术由于操作简单，无需昂贵
的实验仪器，反应在 1-1.5 h 内完成，灵敏度高，吸
引了大量的研究力量投入到了该领域的研究。目前
环介导等温扩增技术仅仅是在该方法建立基础上，
利用现有的引物设计方法检测目的基因，或是在产
物的检测方式上有所改变，在扩增方式上没有实质
性的创新［1-7］。在实时荧光定量 PCR 扩增仪中观察
LAMP 的扩增曲线从 Ct 值到平台期的时间非常短，
一般均在 2 min 之内［28］，即潜伏期的长短决定了整
个反应时间的长短。LAMP 反应是以产物的量为判
断依据，在普通 LAMP 中和模板接触的是一对引物，
4 个位点决定了 LAMP 反应的内在扩增效率，除此
之外，引物浓度等的条件优化、模板量和酶的量等
决定了外在的扩增效率，本研究的创新点在于提高
反应的内在扩增效率。在 LAMP 反应体系中加入环
引物增加了两个与核酸模板接触的位点［9］，提高了
扩增效率，但不改变产物的种类。如果把引物和模
板的结合位置由 4 个变为 8 个，那么反应的产物将
由 1 种变为 4 种，理论上能大幅增加扩增效率。
本研究的设计方案 ：在目的基因内两端设计常
规环介导等温扩增引物（一对外引物 F3、B3 和一对
内引物 FIP、BIP），并留出设计套内引物 FNP、BNP
1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
Fl
uo
re
s c
en
ce
0.4
0.3
0.2
0.1
0
25 50 75 100
6
7
4 5321
Cycle
1 ：1×106 copies/μL ；2 ：1×105 copies/μL ；3 ：1×104 copies/μL ；4 ：1×103
copies/μL ；5 ：1×102 copies/μL ；6 ：1×101 copies/μL ；7 ：Negative
图 3 甲型 H1N1 流感病毒 FAST-LAMP 灵敏度实时荧光
曲线
2000
bp
M 1 2 3 4 5 6 7
1000
750
500
250
100
1 ：1×106 copies/μL ；2 ：1×105 copies/μL ；3 ：1×104 copies/μL ；4 ：1×103
copies/μL ；5 ：1×102 copies/μL ；6 ：1×101 copies/μL ；7 ：Negative
图 4 甲型 H1N1 流感病毒 Fast-LAMP 灵敏度电泳结果
2.4 重复性试验结果
根据实时荧光 RT-LAMP 的结果，记录各次试验
的 Ct 值。根据 Ct 值计算 SD 值及变异系数（CV%），
见表 3。结果表明强阳性及临界值样本的 CV 值均小
于 5%，重复性良好。
2.5 产物测序结果
由于产物组成的复杂性，出现了个别碱基错配，
各引物检测 FAST-LAMP 产物序列分析的整体结果
表明，套内引物 FNP 和 BNP、内引物 FIP 和套内引
表 3 甲型 H1N1 流感病毒 FAST-LAMP 重复性实验结果
理论值
Ct 值
Ct 平均值 SD CV/%
1 2 3
0 0 0 0 0 0 0
1×102copies/μL 63.86 64.24 62.73 63.61 0.79 1.23
1×104copies/μL 45.62 45.39 44.74 45.25 0.46 1.01
1×106copies/μL 32.34 32.51 32. 28 32.425 0.12 0.37
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.582
和环引物 Loop-f、环引物 Loop-r 的足够碱基 ；加入
环引物 Loop-f、环引物 Loop-r，可使 LAMP 反应中
引物和核酸模板接触的位置增加两个，提高了扩增
效率。在外侧内引物 FIP 和 BIP 之间设计一对套内
引物 FNP、BNP，此时等温扩增反应不但能用套内
引物 FNP 与 BNP 根据核酸模板进行扩增，同时也
可以和外侧常规 LAMP 引物扩增的产物结合并扩增，
使与核酸模板接触的位置又增加了 4 个。套内引物
FNP 不但可以和套内引物的 BNP 联合进行扩增反应，
同时也能与外侧的常规内引物 BIP 联合进行扩增，
增大了与核酸模板结合和扩增的机会 ；反之，套内
引物 BNP 也可以与套内引物的 FNP 联合进行扩增
反应，同时也能与外侧的常规内引物 FIP 联合进行
扩增反应。常规 LAMP 反应和加入环引物的 LAMP
的扩增产物只有 1 种产物的循环序列，加入环引物
不改变产物的序列 ；在加入套内引物后，产物就是
4 种扩增产物的循环序列，即内引物 FIP、BIP 的扩
增产物，套内引物 FNP、BNP 的扩增产物，内引物
FIP 和套内引物 BNP 的扩增产物，套内引物 FNP 和
内引物 BIP 的扩增产物。
在本次试验中 FAST-LAMP 的反应时间比普通
LAMP 反应时间缩短了 45 min 左右，比加入环引物
的 LAMP 反应时间缩短了 15 min 左右，在相同条
件的情况下大大提高了反应的扩增效率。本方法扩
增出的 LAMP 产物为 4 种不同 LAMP 组合的混合物
的倍数条带，阳性条带大小的差异很小，条带分布
比普通 LAMP 更加细密，故而梯度状条带不是很清
晰。本方法的产物经电泳割胶回收后测序结果符合
实验预期，各引物之间能相互扩增。相比用传统的
LAMP 检测技术，该方法在检测时间上大大缩短，
普通 LAMP 用于检测 H1N1 病毒仍需在 1.5 h 左右，
且灵敏度与本研究建立的检测方法相当［29，30］。由于
受病毒基因的限制，该检测方法的改进在细菌检测、
物种鉴定等检测中具有更大的发展前景，可将反应
时间控制更短。
4 结论
在相同的检测条件下，本研究建立的改良的环
介导等温扩增方法应用于甲型 H1N1 流感病毒检测，
具有更快的扩增速度。检测灵敏度可达到 1×102 拷
贝，特异性与重复性良好 ；具有简便、高效、准确
的特点。
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（责任编辑 李楠）