全 文 ：·90· 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45卷 第 1期 2014年 1月
热毒宁注射液抗甲型 H1N1 流感病毒作用机制研究
王振中 1, 2，鲍琳琳 3，孙 兰 1, 2，毕宇安 1, 2，周 军 1, 2，萧 伟 1, 2*
1. 江苏康缘药业股份有限公司，江苏 连云港 222001
2. 中药制药过程新技术国家重点实验室，江苏 连云港 222001
3. 中国医学科学院 医学实验动物研究所，北京 100021
摘 要：目的 研究热毒宁注射液体内抗甲型 H1N1 流感病毒的作用及其机制。方法 采用甲型 H1N1 流感病毒滴鼻感染
BALB/c小鼠制备肺炎模型，观察热毒宁注射液对甲型 H1N1流感病毒感染小鼠平均存活时间、存活率、肺指数、病毒载量
及细胞因子的影响。结果 与模型组比较，热毒宁注射液显著提高病毒感染小鼠的存活率、延长小鼠平均存活时间（P＜0.05、
0.01）；显著降低病毒感染小鼠肺指数、肺组织病毒载量（P＜0.05、0.01）；提高肺组织 γ 干扰素（IFN-γ）水平，降低白细
胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子 α（TNF-α）水平。结论 热毒宁注射液对甲型 H1N1流感病毒感染小鼠具有一定的保护作
用，其作用机制可能与提高 IFN-γ水平，降低 IL-6、TNF-α水平有关。
关键词：热毒宁注射液；甲型 H1N1流感病毒；病毒载量；肺指数；细胞因子
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)01 - 0090 - 04
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.01.018
Mechanism of Reduning Injection against influenza A/H1N1 virus
WANG Zhen-zhong1, 2, BAO Lin-lin3, SUN Lan1, 2, BI Yu-an1, 2, ZHOU Jun1, 2, XIAO Wei1, 2
1. Kanion Pharmaceutical Co., Ltd., Lianyungang 222001, China
2. State Key Laboratory of New-tech for Chinese Medicine Pharmaceutical Process, Lianyungang 222001, China
3. Institute of Laboratory Animal Science, Chinese Academy of Medical Sciences & Comparative Medicine Centre, Beijing
100021, China
Abstract: Objective To investigate the effect of Reduning Injection (RI) on the resistance to influenza A/H1N1 virus and its mechanism.
Methods The pneumonic model of BALB/c mice was established by influenza A/H1N1 virus, and the average survival period, survival
rate, lung index, viral load, and cytokine level of mice infected by influenza A/H1N1 virus were observed. Results Compared with the
model group, RI significantly increased the survival rate and prolonged the average survival period of mice infected by influenza A/H1N1
virus (P < 0.05, 0.01). RI significantly reduced the lung index, viral load, contents of IL-6 and TNF-α, while increased the content of IFN-γ
(P < 0.05, 0.01). Conclusion RI has the certain protective effect on mice infected by influenza A/H1N1 virus. Its mechanism may be
related to the improvement of the content of IFN-γ and the decrease of the contents of IL-6 and TNF-α.
Key words: Reduning Injection; influenza A/H1N1 virus; viral load; lung index; cytokines

甲型 H1N1流感病毒包含有猪流感、禽流感和
人流感 3 种流感病毒的基因片段[1]。该病毒通过空
气、飞沫和体液接触传播，潜伏期一般 1～7 d，普
遍易感，以青壮年为主。早期症状与普通流感相似，
包括发热、咳嗽、喉痛、身体疼痛、头痛、发冷和
疲劳等，有些还会出现腹泻或呕吐、肌肉痛或疲倦、
眼睛发红等。部分患者病情可迅速进展，来势凶猛、
突然高热、体温超过 39 ℃，甚至继发严重肺炎、
急性呼吸窘迫综合征、肺出血、胸腔积液、全血细
胞减少、肾功能衰竭、败血症、休克及 Reye 综合
征、呼吸衰竭及多器官损伤，导致死亡，病死率约
为 1%[2-3]。从发病情况来看，多数确诊患者有发热
表现，体温升高，病性属“温热”，故甲型流感的中
医病名应诊断为瘟疫，属于新发温病。相比抗病毒

收稿日期：2013-11-25
基金项目：现代中药创新集群与数字制药技术平台（2013ZX09402203）
作者简介：王振中，硕士生导师，研究方向为中药新药研究与开发。E-mail: wzhzh-nj@tom.com
*通信作者 萧 伟，教授，博士生导师，研究方向为中药新剂型的研究与开发。Tel: (0518)85521956 E-mail: wzhzh-nj@163.com

中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45卷 第 1期 2014年 1月 ·91·
药物，中药具有整体调节、多靶点治疗的特点，不
仅能退热、消炎、抗病毒，而且具有提高人体免疫
功能的作用，并且比单一抗病毒药物治疗退热、消
炎、减轻上呼吸道症状更具优势[4-5]。
热毒宁注射液是由青蒿、金银花、栀子组成的
现代中药制剂，具有清热、解毒、疏风功效。临床
上主要用于治疗上呼吸道感染、急性支气管炎，对
社区获得性肺炎也显示较好疗效。研究表明热毒宁
注射液对禽流感病毒（H5N1）、柯萨奇病毒 3
（CVB3）、单纯疱疹病毒（HSV）、腺病毒 3（ADV3）、
人鼻病毒（N36）等均有一定程度的抑制作用[6-8]。
本实验研究热毒宁注射液对甲型 H1N1流感病毒滴
鼻感染小鼠肺炎的影响及作用机制，为临床应用提
供实验依据。
1 材料
1.1 药品及试剂
热毒宁注射液，批号 090210，江苏康缘药业股
份有限公司；阳性对照药达菲，批号 090121，上海
罗氏制药有限公司；白细胞介素-6（IL-6）ELISA
试剂盒（批号 09051206）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）
ELISA试剂盒（批号 082112190）、γ干扰素（IFN-γ）
ELISA 试剂盒（批号 09071105），欣博盛生物科技
有限公司。
1.2 动物
雌性 BALB/c小鼠，SPF级，体质量 14～17 g，
北京维通利华公司，动物许可证号：SCXK（京）
2006-0009。
1.3 病毒
甲型 H1N1A/California/07/2009（WHO）。
1.4 仪器
Beckman Allegra 64R低温离心机，ABI 7000
实时荧光定量 PCR仪，SIGMA6K15离心机，美国
Thermo Forma 生物安全柜。CO2 培养箱 NUAIR
USAUTOFLOW、倒置可视显微镜（OLYMPUS）
由华美公司提供；Fluostargalary微板光学测定仪及
配套荧光测定 96孔板购自德国 BMG公司。
1.5 实验室
SPF 级环境，ABSL-3 级实验室，许可证号：
No. L2607。
2 方法
2.1 甲型 H1N1 流感病毒对小鼠滴鼻感染的半数
致死量（LD50）测定
将 50只 BALB/c小鼠采用乙醚轻度麻醉，将甲
型H1N1A/California/07/2009流感病毒稀释为 5个稀
释度：原液、10−1～10−4 TCID50，每个滴度 10只小
鼠。每只小鼠鼻孔内均匀滴入 50 μL 病毒液，感染
小鼠。感染后观察 2周，并计算小鼠 LD50。结果甲
型H1N1流感病毒对小鼠滴鼻感染的LD50为 10−1.24。
2.2 热毒宁注射液对甲型 H1N1 流感病毒感染小
鼠肺炎的影响
BALB/c小鼠 110只，体质量 14～17 g，雌性，
随机分为 6组：对照组，模型组，达菲（0.03 g/kg）
组，热毒宁注射液高、中、低剂量（生药 20.22、
10.11、5.05 g/kg）组，除对照组 10 只外，其余每
组 20只。除对照组外，其余各组小鼠以病毒 10 LD50
滴鼻感染，2 h后分别给药，对照组 ip生理盐水，
模型组病毒感染后 ip生理盐水，热毒宁注射液高、
中、低剂量组 ip热毒宁注射液生理盐水稀释液，达
菲组 ig给药，各组给药体积为 0.2 mL/只，每天给
药 1次，连续给药 5 d。末次给药后 4 h，存活小鼠
每组随机取 10 只脱颈椎处死，称体质量，解剖取
全肺称质量，计算小鼠肺指数（肺指数＝肺质量/
体质量×100），肺组织进行病毒载量分析。
2.3 热毒宁注射液对甲型 H1N1 流感病毒感染小
鼠死亡的保护作用
BALB/c小鼠 180只，体质量 14～17 g，雌性，
随机分 6 组，每组 30 只。具体分组及给药方法同
“2.2”项。共观察 2 周，记录小鼠的死亡数及生存
时间，计算存活率及生命延长率 [生命延长率＝（给
药组平均生存时间－模型组平均生存时间）/模型
组平均生存时间]。
2.4 热毒宁注射液对甲型 H1N1 病毒感染小鼠肺
组织细胞因子的影响
动物分组及给药方法同“2.2”项。末次给药 4
h后，存活小鼠每组随机取 10只脱颈椎处死，取肺
组织进行细胞因子 TNF-α、IFN-γ、IL-6分析。
2.5 统计处理方法
数据应用统计处理软件 SPSS 处理（Version.
12.0），数据均以 ±x s表示，计量资料的组间显著
性比较采用单因素方差分析。
3 结果
3.1 热毒宁注射液对甲型 H1N1 流感病毒感染小
鼠肺炎的影响
结果表明，与对照组比较，模型组小鼠肺指数
显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，热毒宁注射
液高、中、低 3 个剂量组小鼠肺指数均有一定程度

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的降低，其中高、中剂量组差异显著（P＜0.05、0.01）；
与模型组比较，热毒宁注射液高、中剂量组显著降
低小鼠肺组织病毒载量（P＜0.01）。结果见表 1。
表 1 热毒宁注射液对甲型 H1N1 流感病毒感染小鼠
肺指数、病毒载量的影响 ( ± = 10x s , n )
Table 1 Effects of RI on lung index and viral load of mice
infected by influenza A/H1N1 virus ( ± = 10x s , n )
组别
剂量/
(g·kg−1)
病毒载量
(lgcopies·mg−1)
肺指数
抑制率
/ %
对照 — — 0.91±0.12 —
模型 — 5.70±0.16 3.18±0.32ΔΔ —
达菲 0.03 5.18±0.12** 2.25±0.59** 29.2
热毒宁 20.22 4.47±0.10** 2.43±0.56** 23.6
注射液 10.11 5.17±0.54** 2.61±0.42* 17.9
5.05 5.46±0.25 2.87±0.35 9.7
与对照组比较：ΔΔP＜0.01；与模型组比较：*P＜0.05 **P＜0.01
ΔΔP < 0.01 vs control group; *P < 0.05 **P < 0.01 vs model group
3.2 热毒宁注射液对甲型 H1N1 流感病毒感染小
鼠的保护作用
与模型组比较，热毒宁注射液高、中、低 3个
剂量组小鼠存活率显著提高（P＜0.05、0.01）；与
模型组比较，热毒宁注射液高、中、低 3个剂量组
小鼠平均存活时间延长，其中热毒宁注射液高、中
剂量组与模型组比较差异显著（P＜0.05、0.01）。
结果见表 2。
3.3 热毒宁注射液对甲流 H1N1 病毒感染小鼠肺
组织细胞因子的影响
与对照组比较，模型组小鼠肺组织 IL-6、
TNF-α、IFN-γ明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，
热毒宁注射液治疗后 IFN-γ 水平均显著升高（P＜
0.01），IL-6水平降低，其中热毒宁注射液高剂量组
有统计学意义（P＜0.05），热毒宁注射液高、中剂
量组 TNF-α水平降低，热毒宁注射液高剂量组有统
计学意义（P＜0.05）。结果见表 3。
表 2 热毒宁注射液对甲型 H1N1 流感病毒感染小鼠存活率、生存时间的影响 ( ± = 30x s , n )
Table 2 Effects of RI on survival rate and average survival period of mice infected by influenza A/H1N1 virus ( ± = 30x s , n )
组别 剂量 / (g·kg−1) 存活率 / % 生存时间 / d 生命延长率 / %
模型 — 0 6.0±1.4 —
达菲 0.03 43** 9.9±3.7** 66.47±0.02
热毒宁注射液 20.22 40** 9.7±3.8** 62.02±0.02
10.11 30** 8.2±4.0* 36.87±0.01
5.05 20* 7.5±3.5 19.59±0.05
与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01
*P < 0.05 **P < 0.01 vs model group
表 3 热毒宁注射液对甲型 H1N1 流感病毒感染小鼠肺组织中细胞因子的影响 ( ± = 10x s , n )
Table 3 Effects of RI on content of cytokines in lung tissue of mice infected by influenza A/H1N1 virus ( ± = 10x s , n )
组别 剂量 / (g·kg−1) IL-6 / (pg·mg−1) IFN-γ / (pg·mg−1) TNF-α / (pg·mg−1)
对照 — 54.36±6.90 28.00±6.05 24.91± 7.27
模型 — 70.02±5.43ΔΔ 35.96±6.18ΔΔ 59.61± 8.60ΔΔ
达菲 0.03 66.98±4.42 38.76±6.72 66.57± 9.74
热毒宁注射液 20.22 62.74±6.04* 51.98±6.80** 43.04±11.51*
10.11 65.85±5.92 54.52±9.83** 51.33± 8.89
5.05 69.57±5.09 49.98±5.19** 61.00± 6.38
与对照组比较：ΔΔP＜0.01；与模型组比较：*P＜0.05 **P＜0.01
ΔΔP < 0.01 vs control group; *P < 0.05 **P < 0.01 vs model group
4 讨论
甲型 H1N1流感病毒感染小鼠后，模型组肺指
数最高，与对照组比较有极显著差异，模型组小鼠
感染后死亡率 100%，以上结果表明甲型 H1N1 流
感病毒感染小鼠模型是成立的。热毒宁注射液组肺
指数低于感染模型组，提示受试药物能降低流感病
毒感染小鼠的肺指数，从而说明其有减轻感染小鼠
肺部炎症的作用。流感病毒感染机体后，机体免疫

中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45卷 第 1期 2014年 1月 ·93·
系统能对病毒产生免疫应答，从而产生一些超过生
理浓度的细胞因子。根据细胞因子的作用可分为：
介导炎性反应的细胞因子包括 TNF-α、IL-6等，介
导天然免疫的细胞因子 IFN-γ以及参与细胞介导的
其他免疫因子如 IL-2。有研究表明，TNF-α过度产
生是流感病毒肺病变的部分原因[9]。有研究报道通
过流感病毒感染人体实验发现，呼吸道局部和血清
中 IL-6、TNF-α水平，与临床症状密切相关。本实
验结果显示，病毒感染后血清中 IL-6、TNF-α水平
明显升高，同时肺组织病理变化程度严重。IFN-γ
可由 T 细胞与自然杀伤细胞（NK）产生。病毒感
染时 CD4+ T细胞和 CD8+ T细胞都能产生 IFN-γ[10]。
IFN-γ与 TNF-α一起协同 IFN2α/β活化诱导型一氧
化氮合酶，依赖巨噬细胞系介导抗病毒作用[11]。另
外，IFN-γ 有广泛的免疫调节作用，如诱导巨噬细
胞、B细胞的抗原呈递能力，活化 NK细胞，提高
其杀伤能力，活化的 NK 又能分泌 IFN-γ，从而使
机体内 NK细胞、IFN-γ和 IL-2相互作用，形成免
疫网络，增强了抗病毒和免疫调节作用[12]。IL-2主
要由 CD4+ T细胞产生，此外 CD8+ T细胞和 NK细
胞也可产生，小鼠体内 IL-2主要由 Th1亚群产生。
IL-2本身无直接抗病毒作用，能刺激 T细胞产生多
种淋巴因子，诱导 CTL、NK、LAK等多种杀伤细
胞的分化和效应功能，诱导杀伤细胞产生 IFN-γ等
细胞因子，而起到抗病毒作用。病毒感染后，IL-2
水平降低，引起机体免疫功能的抑制和失调[13]。
本实验考察了热毒宁注射液对流感病感染小
鼠肺组织中细胞因子的影响，探讨了其部分作用机
制。结果表明热毒宁注射液可能通过促进 IFN-γ分
泌水平，增强抗病毒能力而减轻病毒对机体的损伤
作用，另一方面 IL-6分泌水平降低，起到了减轻肺
组织炎症的作用
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