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金振口服液抗甲型 H1 N1 流感病毒作用实验研究
萧 　伟1 ,郑丽舒2 ,尚 　强1 ,刘 　涛1 ,孙 　兰1 ,王振中1 3
(11 江苏康缘药业股份有限公司 ,江苏 连云港 　222001 ; 21 中国疾病预防控制中心病毒病研究所 ,北京 　100052)
摘 　要 :目的 　观察金振口服液对甲型 H1N1 流感病毒抑制作用。方法 　采用体外抗病毒实验 ,观察金振口服液
对流感病毒的抑制作用 ;采用体内实验 ,以流感病毒感染小鼠 ,观察小鼠生存时间、死亡率及肺组织病变程度。
结果 　金振口服液体外对甲型 H1N1 流感病毒有一定抑制作用 ,体内则能明显延长感染小鼠的生存时间 ,显著降
低肺湿质量 ( P < 0105、0101) ,减轻肺组织病变程度。结论 　金振口服液体内外均有一定的抗甲型 H1N1 流感病
毒作用。
关键词 :金振口服液 ; 甲型 H1N1 流感病毒 ; MDCK 细胞
中图分类号 :R28515 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 0921443204
　　流感是一种传染性强、传播速度快的疾病。流
感所引起的并发症和死亡非常严重。据世界卫生组
织 ( W HO) 发布的公告 ,全球每年流感病例为 6～
12 亿例 ,死亡 50～100 万人[ 1 ] 。目前市场上的抗流
感药物主要以化学药为主 ,但化学药通常有不同程
度的不良反应 ,在临床应用上受到一定限制。而中
医药临床防治流感具有独特效果 ,不良反应少 ,药源
丰富 ,价格低廉 ,通过调节整体免疫功能抑制病毒复
制 ,阻止病毒致细胞病变 ,改善临床症状快等 ,在治
疗流感方面显示了了独特的优势[2 ] 。本实验观察金
振口服液对流感病毒 A/ PR/ 8/ 34 (甲型 H1N1 流
感病毒) 抑制作用 ,为临床应用提供理论依据。
1 　实验材料
111 　细胞与病毒 : MDC K 细胞 (犬肾细胞) ,流感
病毒 A/ PR/ 8/ 34 (甲型 H1N1 流感病毒) ,均由病
毒生物技术国家工程研究中心北京金迪克生物技术
研究所提供。
112 　药物与试剂 :金振口服液 ,江苏康缘药业股份
有限公司 ,规格 :生药 1184 g/ 10 mL (用蒸馏水稀 释 50 倍用于体外试验 ,生药 3168 mg/ mL ) ,批号 :080115 ;病毒唑注射液 ,天津药业集团新郑股份有限公司 ,规格 :10 mg/ mL ,批号 :080219 ;达菲 ,上海罗氏制药有限公司 ,规格 :75 mg ,批号 :080121 ;DMEM培养基 ,北京清大天一生物技术有限公司 ;小牛血清 ,杭州四季青药物试剂有限公司 ;胰酶、MTT 均购自Amresco 公司 ;DMSO 购自 Sigma 公司。113 　受试动物 : BALB/ c 小鼠 ,清洁级 ,体质量 :14～16 g ,购自北京维通利华实验动物技术有限公司 ,质量合格证 :SCXK (京) 200720001。114 　仪器 :96 孔细胞培养板 ,Corning 公司 ;超净工作台 ,北京瑞泽康生物科技有限公司 ;CO2恒温培养箱 ,日本 Sanyo 公司 ;倒置显微镜 ,日本 Olymp us 公司 ;酶标仪 ,美国伯乐公司。2 　方法211 　药物对 MDC K 细胞毒性实验 :96 孔细胞板中每孔接种约 5 ×104 个 MDC K 细胞 ,于 37 ℃、5 %CO2培养箱中培养过夜 ,弃去细胞培养液 ,加入金振口服液 20μL (生药 3168 mg/ mL ) 于 37 ℃、5 %
·3441·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 9 期 2009 年 9 月
3 收稿日期 :2009205214　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
作者简介 :萧　伟 (1959 —) ,男 ,山东昌乐人 ,高级工程师 ,博士 ,研究方向为中药新型制剂的研究与开发。
CO2培养箱中培养 5 d ,光学显微镜下观察细胞形
态 ,同时设立病毒唑 (40μg/ mL) 和无药物的阴性
对照。于第 5 天每孔中加入 10μL 5 mg/ mL M T T
溶液 ,继续培养 4 h ,弃去培养液后加入 100 μL
DMSO ,37 ℃振荡 10 min ,测定 570 nm 处吸光度
( A) 值。设立 4 孔平行 ,取 4 个孔的吸光度平均值
进行计算 ,观察金振口服液对细胞的毒性。试验重
复 3 次。
212 　体外抗病毒实验
21211 　抗病毒病变观察 : 在 24 孔板中培养的
MDC K 细胞上加入流感病毒 ( A/ PR/ 8/ 34 ) 5
TCID50 [3 ,4 ] ,在 33 ℃、5 % CO2 温箱内孵育 1 h ,
Hanks 液洗去病毒液 ,加入细胞维持液 (金振口服
液 :3168 mg/ mL , 100 μL ;病毒唑 : 40 μg/ mL , 100
μL) ,同时设病毒对照、细胞对照 ,置 33 ℃、5 % CO2
培养箱内培养 ,连续观察 5 d。
21212 　空斑形成抑制实验 :在 6 孔板中刚长满的
单层 MDC K 细胞 ,弃去生长液 ,用 Hanks 液洗涤两
遍 ,根据流感病毒 A/ PR/ 8/ 34 的预实验空斑滴定
结果 ,每孔加入 10 - 6倍稀释的流感病毒 015 mL ,于
33 ℃、5 % CO2温箱内孵育 1 h ,洗去病毒液 ,加入适
量病毒唑 (终质量浓度 40、20、10、5、215μg/ mL ,一
孔为空白对照) ,金振口服液 (终质量浓度 368、
184、92、46、23μg/ mL ,一孔为空白对照) ,加入含
1 % 琼脂糖、5μg/ mL L2苯甲磺酰苯丙氨酰氯甲酮
处理的胰酶、215 % Herp s 缓冲液、p H 712～714 的
DM EM 琼脂糖第一层覆盖液覆盖细胞 ,继续在
33 ℃、5 % CO2温箱内孵育。培养 72 h 后 ,加入含
3133 % 中性红的第 2 层覆盖液过夜染色 ,直接观察
空斑。根据空斑数目计算每一浓度相对于阴性对照
的抑制率 ,计算其 IC50 。以病毒唑作为空斑形成抑
制活性的阳性参照。
213 　体内抗病毒实验 :首先通过预实验测定流感病
毒 (A/ PR/ 8/ 34) 的 LD50 80 只小鼠随机分为 4 组 ,
每组 20 只 ,即对照组 ig 给予蒸馏水 ;模型组 ig 给
予蒸馏水 ;阳性组 ig 给予达菲水溶液 ,剂量为 20
mg/ kg ;金振口服液组 ig 给予金振口服液 ,剂量为
生药 3122 g/ kg ,给药体积均为 10 mL/ kg。分别于
攻毒前 4 h 给药 1 次及攻毒后连续给药 5 d ,每天 1
次。造模时小鼠乙醚麻醉后 ,10 LD50剂量鼻腔接种
流感病毒 50μL 。每组取 10 只连续观察 14 d ,记录
小鼠死亡情况 (计算死亡率及平均生存时间) ,另外
10 只分别于首次给药后 4、8 d 将小鼠处死 ,无菌取
肺 测定鼠肺湿质量 鼠肺研磨成肺悬液后测定肺内
病毒滴定 ( TCID50 ) ,肺经甲醛固定后制作组织切
片 , H E 染色 ,光镜下观察肺组织形态学变化。
214 　统计学处理 :结果用 SPSS 统计学软件处理 ,
计数资料用χ2 检验 ,计量资料采用 t 检验进行组间
比较 ,结果用 x ±s 表示。
3 　结果
311 　药物对 MDC K 细胞毒性实验 :3 次试验结果
显示 ,在本实验条件下 ,金振口服液 20 μL (生药
3168 mg/ mL) 时 ,细胞状态和阴性对照组一致 ,没
有细胞毒性 ;阳性对照药物病毒唑 40μg/ mL 对细
胞无任何毒性 ,选此质量浓度进行体外试验。
312 　体外抗病毒实验
31211 　抗病毒病变观察 :结果表明 ,金振口服液在
体外具有一定抑制流感病毒致细胞病变作用。结果
见表 1。细胞病变程度判定标准如下 :“ - ”:无细胞
病变 ;“±”:延缓细胞病变 ;“ + ”: 1/ 4 以下细胞病
变 ;“ + + ”: 1/ 4～1/ 2 的细胞有病变 ;“ + + + ”:
1/ 2～3/ 4 的细胞有病变 ;“ + + + + ”: 3/ 4 以上的
细胞有病变。
表 1 　金振口服液对 H1 N1 病毒致细胞病变作用的影响
Table 1 　Effect of Jinzhen Oral Liquid on H1 N1
virus induced cytopathic lesions
组别 病变效应 组别 病变效应
金振口服液 + 细胞对照 -
病毒唑 ± 病毒对照 + + + +
31212 　空斑形成抑制实验 :在本实验条件下 ,金振
口服液的 IC50 为 75μg/ mL ,说明在体外可以抑制
流感病毒生长 ,具有一定的抗流感病毒作用。病毒
唑的 IC50为 510μg/ mL 。
313 　体内抗病毒实验
31311 　对小鼠生存率和平均生存时间的影响 :模型
组动物在攻毒后的第 5 天开始死亡 ,到第 10 天存活
率为 0 ,平均生存时间为 711 d ;金振口服液组在攻
毒后的第 6 天开始死亡 ,到第 8 d 存活率降以最低 ,
存活率为 50 % , 与模型组比较差异显著 ( P <
0101) ,平均生存时间为 1016 d ;达菲阳性组及对照
组存活率均为 100 % ,平均生存时间大于 14 d ,与模
型组比较差异显著 ( P < 0101) 。结果见表 2。
31312 　染毒后小鼠肺内病变情况 :实验结果表明 ,
与模型组比较 ,金振口服液组的小鼠肺湿质量及肺
内病毒滴度均显著下降 ( P < 0105) 。结果见表 3。
31313 　对病毒感染小鼠肺病理变化的影响 :病理组
织学观察发现 :模型组动物肺组织有大面积的肺实
变 肺泡间隔明显增宽 有大量淋巴细胞浸润 ,可见
·4441· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 9 期 2009 年 9 月
表 2 　金振口服液对 H1 N1 染毒小鼠生存率和平均
生存时间的影响 ( n = 10)
Table 2 　Effect of Jinzhen Oral Liquid on mice survival
rate and average survival time ( n = 10)
组别 剂量/ (g ·kg - 1 ) 存活动物/ 只 存活率/ % 平均生存时间/ d
对照 - 10 100 3 3 > 14
模型 - 0 0 71 1
达菲 0102 10 100 3 3 > 14
金振口服液 3122 5 50 3 3 101 6
　　与模型组比较 : 3 3 P < 0101
　　3 3 P < 0101 vs model group
表 3 　金振口服液对 10 LD50 H1 N1 染毒小鼠肺组织病变的
影响 ( n = 5)
Table 3 　Protective effect of Jinzhen Oral Liquid
on lung tissue lesions of mice infected
by 10 LD50 H1 N1 virus ( n = 5)
组别
剂量/
(g ·kg - 1 )
染毒后第 4 天
TCID50 肺湿质量/ mg
染毒后第 8 天
TCID50 肺湿质量/ mg
对照 - 　　- 138 ±22 　　- 148 ±19
模型 - 5175 ±0187 340 ±32 3 3 5163 ±0175 371 ±38 3 3
达菲 0102 2194 ±0163 △△ 182 ±30 △△ 2175 ±0135 △△ 192 ±38 △△
金振口服液 3122 4106 ±0143 △ 275 ±33 △ 3194 ±0152 △ 306 ±32 △
　　与对照组比较 : 3 3 P < 0101
　　与模型组比较 : △P < 0105 　△△P < 0101
　　3 3 P < 0101 vs cont rol group
　　△P < 01 05 　△△P < 01 01 vs model group
肺泡上皮细胞增生和肺泡缩小 ,肺组织含气量显著减
少 ,肺泡腔有液体渗出与出血灶 ;金振口服液组小鼠肺
组织病变较模型组减轻 ,肺泡间隔略有增宽 ,可见淋巴
细胞浸润 ,显示出一定的保护效应。结果见图 1。
4 　讨论
　　本研究通过体外细胞培养法和体内建立病毒感
染动物模型研究了金振口服液的抗甲型 H1N1 流
感病毒作用。体内、外实验结果均显示金振口服液
具有一定的抗甲型 H1N1 流感病毒作用 ,体外细胞
实验证明金振口服液能直接抑制甲型 H1N1 流感
病毒 ;体内抗病毒实验通过存活率、平均存活时间、
鼠肺实变、鼠肺内病毒滴度 ( TCID50 ) 及鼠肺病理
切片等多个参数评定显示金振口服液具有一定的抗
甲型 H1N1 流感病毒活性。
　　经病理解剖观察 ,流感病毒所致的小鼠肺炎病
理改变为典型的间质性肺炎表现 ,肺泡间隔明显增
宽 ,肺间质内血管充血、水肿及淋巴细胞、单核细胞
等炎细胞浸润。通过肺部病理组织学观察比较分
析 ,流感病毒所致小鼠肺炎的直接致死原因是病毒
感染引发的免疫炎症病理损害。病灶处的肺泡由于
免疫炎症反应 ,弹性变差 ,通气功能减低甚至丧失 ,
当病变累及肺大部 ,大部分肺泡功能受损 ,无法代偿
图 1 　金振口服液对小鼠肺组织病理改变的影响
Fig. 1 　Effect of Jinzhen Oral Liquid on lung pathological changes of infected mice
时 ,小鼠则因呼吸障碍导致死亡。金振口服液能有
效控制肺部炎症反应的程度和范围 ,局限病灶的蔓
延 ,显著减轻小鼠肺部组织的病理损害 ,从而保护了
肺功能 ,这可能是应用金振口服液治疗后 ,小鼠死亡
率明显降低、生存时间明显延长的直接原因。
金振口服液为一种中药复方口服液 ,处方由黄
芩、石膏、人工牛黄、大黄等药物组成 ,具有清热解
毒 ,祛痰止咳的功效。前期研究表明该药对流感病
毒 PR3 株型、呼吸道合胞病毒、SARS 等有较好的
抑制、杀灭作用[5 ] 。有研究表明 ,抗病毒单味中药多
为清热解毒药[6 ] ,黄芩、石膏均属于此类中药。其组
方中甘草、大黄、黄芩等具有抗多种病毒的作用 ,并
具有调节机体免疫和抗炎作用[7 ,8 ] 。因此 ,推测金
振口服液发挥了几种抗病毒中药抗流感病毒的协同
作用 ,同时通过调控免疫反应及改善微循环 ,而达到
治疗的效果。
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