全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(12):158-166
低温会严重影响高纬度地区生活的热带和亚热
带水生动物［1］。渔业养殖中，低温往往会影响和限
制不耐寒鱼类的饲养，甚至造成喜温鱼类大量死亡
而带来巨大的经济损失。此外，热带观赏鱼养殖过
程中需要消耗大量热能，这不仅提高了饲养成本，
还不利于节能减排。如果经过分子水平育种，能够
降低热带观赏鱼类生活水温要求，无疑对实现绿色
养殖、降低饲养成本具有重要的意义。目前鱼类抗
冻相关研究主要集中在抗冻蛋白、神经系统，如
脑 AchE 活力等方面。然而喜温鱼类，如罗非鱼在
收稿日期 ：2015-03-22
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31171198）
作者简介 ：张萍，女，硕士研究生，研究方向 ：动物分子细胞遗传学 ；E-mail ：zkswrjp2009@163.com
通讯作者 ：刘江东，男，副教授，研究方向 ：动物分子细胞遗传学 ；E-mail ：liujd@whu.edu.cn
锦鲤 Δ6 脂肪酸去饱和酶基因克隆及表达研究
张萍  薛伟伟  蒋雪薇  朱双  刘江东
（武汉大学生命科学学院，武汉 430072）
摘 要 ： 旨在揭示变温鱼类合成 HUFAs 过程中的关键酶及其功能，以锦鲤（Cyprinus carpiokoi）为材料，通过 RT-PCR 扩增
获得了一段长度为 854 bp 的 Δ6 脂肪酸去饱和酶基因的 cDNA 序列片段，并对其进行了序列分析和蛋白产物结构预测。结果显示，
该片段与南亚野鲮（Labeo rohita）Δ6 脂肪酸去饱和酶基因有 93.5% 的同源性，编码的蛋白产物具有典型的 Δ6 脂肪酸去饱和酶结
构特点，包含 2 个组氨酸保守区（HDFGH、HFQHH）和 2 个跨膜结构域。荧光定量 PCR 表明，Δ6 脂肪酸去饱和酶在锦鲤肝脏
中的表达量最高，在肠、脑和心脏中表达量依次降低，而在肌肉和鳃的表达量相对较低。幼鱼在不同培养水温下，各组织中该基
因的表达量均随温度的下降而升高，以适应低温环境。
关键词 ： 锦鲤 ；高不饱和脂肪酸 ；△ 6 脂肪酸去饱和酶 ；鱼类抗冻
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.023
The Cloning and Gene Expression of Delta 6 Fatty Acid Desaturase of
Koi Carp（Cyprinus carpiokoi）
Zhang Ping Xue Weiwei Jiang Xuewei Zhu Shuang Liu Jiangdong
（College of Life Sciences，Wuhan University，Wuhan 430072）
Abstract: Highly unsaturated fatty acids（HUFAs）are important constituents of cell membrane, and the unsaturated degree of carbon
chain is an important factor in resisting to low temperature, maintaining and regulating the fluidity of cell membrane. In order to discover the key
enzymes of synthetizing HUAs and their functions, using koi carp（Cyprinus carpiokoi）as studying materials, a 854 bp cDNA of delta 6 fatty
acid desaturase（Fad6）was amplified by RT-PCR, their sequences were analyzed and the structures of proteins were predicted. Results showed
that the amplified fragment had great homology（93.5%）with that of rohu（Labeo rohita）. The encoded protein possessed the features of
typical Fad6, containing two histidine boxes（HDFGH and HFQHH）and two transmembrane regions. Real time PCR results demonstrated that
Fad6 was expressed in all tissues, and the order of their expression levels was as follows ：liver > intestine > brain > heart > muscle > gill. The
expressions of the Fad6 gene in different tissues of koi carp larva, while exposing to different water temperatures, increased as water temperature
decreasing for adapting to the lower temperature environment.
Key words: koi carp ；highly unsaturated fatty acids ；delta 6 fatty acid desaturase ；fish antifreeze
2015,31(12) 159张萍等：锦鲤Δ6脂肪酸去饱和酶基因克隆及表达研究
15℃就会处于休眠状态，远未到达血液冰点。因此，
如何提高鱼类抗冻能力，除了上述抗冻蛋白等因素
外，可能还需要寻找更多的突破口。
当环境温度降低时，细胞膜脂会倾向于凝固，
而淡水鱼类往往通过合成高不饱和脂肪酸（Highly
unsaturated fatty acids，HUFAs） 来 维 持 质 膜 的 有
效流动。HUFAs 是指碳链长度≥ 20 个原子且含有
≥ 3 个双键的多不饱和脂肪酸，如二十二碳六烯
酸（Docosahexaenoicacids，DHA）和二十碳五烯酸
（Eicosapentaenoicacid，EPA）等。研究发现 HUFAs
不仅是细胞膜的重要组成部分，同时在维持机体的
正常机能、促进生长发育和繁殖，以及提高成活率
和抵御低温环境等方面都发挥着重要的作用［2，3］。
动物 HUFAs 是在去饱和酶与碳链延伸酶的催化作
用下，在单烯分子或从植物获得的多烯衍生物的近
双键端（即从所在双键至羧基），插入另外的双键，
通过缩合、还原、脱水、再还原 4 个步骤完成碳链
的去饱和及延伸［4-6］。在三类去饱和酶中，Δ6 脂肪
酸去饱和酶（Δ6 fatty acyl desaturase，Fad6）属于酰
基 -CoA 去饱和酶类，是 HUFAs 合成过程中的限速
酶，主要催化第一步的去饱和反应，将 18∶3n-3（α-
亚麻酸，LNA）和 18∶2n-6（亚油酸，LA）分别转
化成 18∶4n-3 和 18∶3n-6［7，8］。此外该酶还参与了
20∶5n-3（EPA）到 22∶6n-3 的合成［9，10］。在不同
鱼类物种中 Fad6 的活性和底物特异性存在较大差
异，迄今为止只从少数几种鱼类克隆了脂肪酸去饱
和酶 cDNA，且主要集中在海水鱼类，淡水鱼类也
仅在斑马鱼、建鲤和草鱼中开展了相关研究［11-13］。
锦鲤（Cyprinus carpiokoi）属鲤形目（Cyprinifo-
rmes）、鲤科（Cyprinidae）、鲤属（Cyprinus），因色
彩鲜艳丰富深受人们喜爱［14］，具有重要的经济价值
和观赏价值［15，16］。作为变温淡水鱼，锦鲤可以耐受
4℃的低温而不会冻死。本研究对锦鲤 Fad6 基因的
结构和表达进行分析，旨在为研究变温鱼类耐寒能
力，探索其高不饱和脂肪酸的合成机制，以及抗冻
鱼类育种提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
锦鲤购于武汉元宝山花鸟市场，按照形态、解
剖进行物种鉴定。
1.2 方法
1.2.1 锦鲤组织的获取和总 RNA 的提取 随机选取
锦鲤幼鱼 6 尾（4-5 g）。解剖后分别迅速取少量肝、
心、脑、肌肉、肠和鳃组织，编号后放入液氮中速
冻，然后置于 -80℃冰箱中备用。另随机选取锦鲤
幼鱼 18 尾（4-5 g），分成 3 组，分别饲养于带有冷
却设备的鱼缸中。3 组鱼缸温度分别为 20℃、14℃
和 8℃。幼鱼在各自水温条件下适应 96 h 后，分别
解剖，迅速取出肝、心、脑、肌肉、肠和鳃等组织，
用 TRIZOL® Reagent 试剂盒快速提取 3 组幼鱼各组织
总 RNA。
1.2.2 锦 鲤 Fad6 cDNA 片 段 的 扩 增、 克 隆 和 分
析 取 -80℃保存的锦鲤肝脏 30-50 mg，迅速转入
预冷的玻璃匀浆器中充分匀浆，然后使用 TRIZOL®
Reagent 试 剂 盒 提 取 肝 脏 总 RNA， 再 用 紫 外 分 光
光 度 计 检 测 A260/A280 值， 最 后 用 M-MLV Reverse
Transcriptase 试剂盒进行反转录合成第一链 cDNA。
在 NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）数据库中
参考斑马鱼（Danio rerio AF309556）、鲤鱼（Cyprinus
carpio AF309557.1）和南亚野鲮（Labeo rohita EF63-
4246.2）的 Fad6 基因保守序列，应用 primer 5.0 和
DNAman 序列分析软件进行分析，并设计如下 PCR
引 物 ：正 向 引 物 5-TTAATCGGGGAGCTTGAG-3，
反 向 引 物 5-TTGAGGTGTCCGCTGAAC-3。 以 上 述
反转录产物为模板，通过 PCR 反应扩增获得锦鲤
Fad6 cDNA 片段。扩增程序为 ：预变性 95℃ 5 min ；
变性 95℃ 45 s，复性 54℃ 45 s，延伸 72℃ 1 min，
共 30 个 循 环 ；最 后 72℃ 延 伸 8 min。 用 DNA Gel
Extraction Kit 纯化回收 PCR 产物，连接至 pMD18-T
Vector 载体，转化感受态大肠杆菌细胞 DHα，蓝白
斑筛选阳性克隆，用 Plasmid Miniprep Kit 提取纯化
重组质粒后，委托武汉天一辉远生物技术有限公司
进行序列测定。
1.2.3 常温及不同水温培养下锦鲤幼鱼 6 种组织中
Fad6 的表达情况的检测 分别取 -80℃条件下保存
的常温饲养锦鲤幼鱼的肝脏、心、脑、肌肉、肠和
鳃组织各约 50 mg，迅速转入预冷的玻璃匀浆器中
充分匀浆后，用 TRIZOL® Reagent 分别提取不同组织
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.12160
的总 RNA。各取 5 μg 总 RNA 为模板，采用 M-MLV
Reverse Transcriptase 反转录合成第一链 cDNA。根
据上述克隆获得的 Fad6 cDNA 片段设计定量 PCR 正
向引物 5-ATCGGACACCTGAAGGGAGCG-3 和反向
引 物 5-CGCGTTGAGCATGTTGACATCCG-3 ；以 鲤
鱼 β-actin 为 内 参 基 因（GenBank 登 录 号 M24113），
设 计 正 向 引 物 5-GCACTGCTGCTTCCTCCTCCTC-3
和 反 向 引 物 5-ACCGCAAGACTCCATACCC-3。 使
用 SYBR premix Ex Taq II 试剂盒，对锦鲤 6 种组织
的 Fad6 cDNA 样品进行荧光定量 PCR，每个样品
重复做 3 次，以空模板为阴性对照。PCR 扩增程序
为 ：95℃预变性 15 s；95℃变性 20 s，56℃复性 20 s，
72℃延伸 15 s，共 39 个循环 ；最后 72℃延伸 30 s。
其公式为 2-ΔΔC t［17］。
1.2.4 生 物 信 息 学 分 析 利 用 NCBI 数 据 库 查 询
人、家鼠和各鱼类基因和蛋白序列 ；运用 Vector
NIT 7.0 软件进行蛋白序列比对 ；系统进化分析采用
MEGA5.1 和 Clustal X 软件。
1.2.5 分析和统计 实时荧光定量 PCR 结果先采
用 SPSS17. 0 中 单 因 素 方 差 法 进 行 分 析（one-way
ANOVA）［18］， 再 用 Tukey’s 法 进 行 多 重 比 较， 设
定分析显著差异水平为 P<0.05，差异极显著水平为
P<0. 01，数据采用平均值 ± 标准误（x
-
±s）表示。
2 结果
2.1 锦鲤Fad6 cDNA片段及氨基酸同源性分析
DNA 测序表明克隆获得的锦鲤 Fad6 cDNA 片
段长度为 854 bp，编码 284 个氨基酸片段。氨基酸
分析表明，该片段包含 2 个组氨酸富集区（HDFGH
和 HFQHH）和 2 个跨膜结构域，与其他鱼类 Fad6
氨基酸序列的相似性如图 1 所示。锦鲤与南亚野
鲮（Labeo rohita EF634246.2）、 斑 马 鱼（Danio rerio
AF309556）、鲤鱼（Cyprinus carpio AF309557.1）、军
曹 鱼（Rachycentron canadum FJ440238.1）、 长 鳍 篮
子 鱼（Siganus canaliculatus EF424276.2）、 金 枪 鱼
（Thunnus thynnus HQ214238.1）、虹鳟（Oncorhynchus
mykiss AF301910）、 金 头 鲷（Sparus aurata AY0557-
49）和大西洋鲑（Salmo salar AY458652）等 9 种鱼
类和人（Homo sapiens AF126799）Fad6 保守片段的
同源相似性，见表 1。
2.2 锦鲤与其他12种脊椎动物Fad6基因系统进化
关系
对 锦 鲤 和 人（Homo sapiens AF126799）、 家 鼠
（Mus musculus AF126798）、 南 亚 野 鲮（Labeo rohita
EF634246.2）、 鲤 鱼（Cyprinus carpio AF309557.1）、
斑 马 鱼（Danio rerio AF309556）、 金 枪 鱼（Thunnus
thynnus HQ214238.1）、军曹鱼（Rachycentron canad-
um FJ440238.1）、长鳍篮子鱼（Siganus canaliculatus
EF424276.2）、 虹 鳟（Oncorhynchus mykiss AF3019-
10）、金头鲷（Sparus aurata AY055749）和大西洋鲑
（Salmo salar AY458652）12 种动物的 Fad6 序列进行
了比较分析，并以此构建了 NJ 系统进化树。结果（图
2）表明，锦鲤 Fad6 与南亚野鲮和鲤鱼的进化关系
最近，系统进化树分析结果与传统分类学结果基本
一致。
2.3 Fad6基因在锦鲤各组织中的表达
实时荧光定量 PCR 分析了锦鲤 Fad6 在肝、心、
脑、肌肉、肠和鳃 6 种组织中的表达情况。结果
（图 3）表明，Fad6 在肝脏中的表达量最高，在肠、
脑和心脏表达量依次降低，而在肌肉和鳃的表达量
相对较低。
2.4 锦鲤各组织中Fad6的表达与培养水温的相关性
实时荧光定量 PCR（图 4）表明，锦鲤肝、心、
脑、肠、肌肉和鳃中 Fad6 在 20℃、14℃和 8℃下的
表达量均随水温的下降而升高。
3 讨论
3.1 关于锦鲤Fad6 cDNA片段序列
Fad6 是一种膜结合脂肪酸去饱和酶（Membrane-
bound fatty acid desaturase），它以 NADH、细胞色素
b5 氧化还原酶作为电子供体，催化甘油脂中的脂肪
酸脱氢，是 HUFAs 生物合成的限速酶，在生物合成
HUFAs 的 n-6 或 n-3 途径中起关键作用［19］。
分析显示，本研究得到的锦鲤 Fad6 基因片段长
854 bp，编码 284 个氨基酸，具有典型的 Fad6 结构，
包 含 2 个 组 氨 酸 富 集 区（HDFGH、HFQHH） 和 2
个跨膜结构域。对锦鲤和其他 9 种鱼类比较研究发
现，与南亚野鲮和斑马鱼的同源性达到了 91.9% 和
90.8%。即使进化地位相差甚远的鱼类，其组氨酸富
集区和跨膜结构域等功能结构区也都具有高度的相
2015,31(12) 161张萍等：锦鲤Δ6脂肪酸去饱和酶基因克隆及表达研究䭖勔ইӊ䟾勞ᯁ傜劬勔劬ߋᴩ劬䮯勽㈞ᆀ劬䠁ᷚ劬㲩匏䠁ཤ勧བྷ㾯⌻勁䭖勔ইӊ䟾勞ᯁ傜劬勔劬ߋᴩ劬䮯勽㈞ᆀ劬䠁ᷚ劬㲩匏䠁ཤ勧བྷ㾯⌻勁䭖勔ইӊ䟾勞ᯁ傜劬勔劬ߋᴩ劬䮯勽㈞ᆀ劬䠁ᷚ劬㲩匏䠁ཤ勧བྷ㾯⌻勁䭖勔ইӊ䟾勞ᯁ傜劬勔劬ߋᴩ劬䮯勽㈞ᆀ劬䠁ᷚ劬㲩匏䠁ཤ勧བྷ㾯⌻勁䭖勔ইӊ䟾勞ᯁ傜劬勔劬ߋᴩ劬䮯勽㈞ᆀ劬䠁ᷚ劬㲩匏䠁ཤ勧བྷ㾯⌻勁䭖勔ইӊ䟾勞ᯁ傜劬勔劬ߋᴩ劬䮯勽㈞ᆀ劬䠁ᷚ劬㲩匏䠁ཤ勧བྷ㾯⌻勁
1
92
92
92
90
91
93
102
93
102
51
142
142
142
140
141
143
152
143
152
101
192
192
192
190
191
193
202
193
202
151
242
242
242
240
241
243
252
243
252
201
292
292
292
290
291
293
302
293
302
251
342
342
342
340
341
343
352
343
352
下划线部分表示 Fad6 的两个跨膜结构 ；黑色阴影表示两个组氨酸的富集区域 ；灰色阴影部分表示锦鲤与其他鱼类和人之间相同的氨基酸残基
图 1 用 Vector NIT 7.0 对锦鲤和其他鱼类 Fad6 氨基酸序列的同源性比对
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.12162
似性。相关研究文献表明，2 个跨膜区对于它们的
细胞定位和形成适合的空间结构十分重要，而 2 个
保守的组氨酸簇与铁离子结合形成脂肪酸去饱和酶
的催化中心，任何一个组氨酸的突变或缺失均可能
导致脂肪酸去饱和酶的失活［11］。这两个组氨酸富集
区和跨膜结构域中每个氨基酸对其功能都极为重要，
故表现出高度的保守性。
对锦鲤、人、家鼠和其他鱼类 Fad6 构建系统进
化树发现，锦鲤与南亚野鲮的 Fad6 进化关系最近，
其次是鲤鱼和斑马鱼，并与南亚野鲮、鲤鱼和斑马
鱼形成进化单独小分支，再与海水鱼（军曹鱼、金
枪鱼、金头鲷、长鳍篮子鱼）和溯河洄游型鱼（虹
鳟、大西洋鲑）形成鱼类进化较大分支，最后与人、
家鼠形成脊椎动物最大进化分支。系统进化树分析
结果与根据传统分类学结果基本一致。因此，今后
对鱼类的 Fad6 序列的分析可以作为物种系统进化分
析的一个参考依据。
关于锦鲤和斑马鱼等热带鱼的 Fad6 氨基酸序列
存在的差异，究竟仅仅是因为物种差异，还是同其
生活环境相关，我们后续不仅要进一步在更多变温
鱼类、冷水鱼类、热带鱼类之间进行对比研究，而
且要在 Fad6 基因全序列基础上进行对比研究。此外，
如果通过基因重组，将锦鲤的 Fad6 基因转入斑马鱼
表 1 锦鲤、其他鱼类及人类的 Fad6 氨基酸序列同源性比对分析单位矩阵表
物种 南亚野鲮 斑马鱼 鲤鱼 军曹鱼 长鳍篮子鱼 金枪鱼 虹鳟 金头鲷 大西洋鲑 人
锦鲤 91.9% 90.8% 90.5 % 70.8% 69.4% 69.0% 67.6% 67.6% 66.9% 65.3%
南亚野鲮 91.0% 89.9% 70.3% 71.7% 68.5% 66.7% 68.3% 66.3% 64.4%
斑马鱼 89.4% 70.5% 71.2% 69.0% 65.9% 68.1% 65.4% 64.9%
鲤鱼 68.2% 69.2% 66.7% 64.5% 66.5% 64.5% 62.8%
军曹鱼 80.6% 87.2% 75.6% 86.7% 75.8% 65.3%
长鳍篮子鱼 79.6% 72.7% 80.4% 73.1% 65.5%
金枪鱼 77.8% 87.9% 77.8% 65.4%
虹鳟 76.2% 94.5% 64.8%
金头鲷 76.7% 65.2%
大西洋鲑 65.2%
79
87
100
73
90
99
86
100
100
䭖勔Cyprinus carpiokoiƸ6ইӊ䟾勞Labeo rohitaƸ6ᯁ傜劬Danio rerioƸ6勔劬Cyprinus carpioƸ6ߋᴩ劬Rachycentron canadumƸ6䮯勽㈞ᆀ劬Siganus canaliculatusƸ6䠁ᷚ劬Thunnus thynnusƸ6㲩匏Oncorhynchus mykissƸ6ӪHomo sapiensƸ6ᇦ啐Mus musculusƸ6䠁ཤ勧Sparus aurataƸ6བྷ㾯⌻勁Salmo salarƸ6
图 2 锦鲤、其他部分鱼类、人和家鼠的 Fad6 系统进化关系图
0 㛍 ᗳ 㝁 㚼㚹 㛐 勳123⴨ሩ㺘䗮
䟿
4
5
6
7
图 3 Δ6 去饱和酶基因在锦鲤 6 种组织中的相对表达量
2015,31(12) 163张萍等：锦鲤Δ6脂肪酸去饱和酶基因克隆及表达研究
受精卵中，能否引起斑马鱼对低温耐受能力的提升，
我们也正在做相关的实验探索。
3.2 Fad6在锦鲤各组织中的表达
Fad6 是脂肪酸生物合成途径的限速酶，其表达
受到多种因素的调控［20-24］。Zheng 等［25］和 Bell 等［26］
研究认为，Fad6 基因在肝脏中大量表达与肝脏参与
脂肪酸的新陈代谢有关，而在肠道中高表达则与肠
道中的食物所含脂肪酸的类型相关 ；此外在脑中表
达量也相对较高。而 Tocher 等［27］发现 Fad6 基因在
大西洋鳕鱼的脑中表达量最高，Seiliez 等［12］发现该
酶在虹鳟的脑、肝脏和肠中表达量较高，推测高不
饱和脂肪酸在幼鱼神经组织发育过程中起着重要的
10A B
C D
E F
9
8
7
6
5
4⴨ሩ㺘䗮䟿
3
2
1
0
20ć 14ć 8ć
9
8
7
6
5
4⴨ሩ㺘䗮䟿
3
2
1
0
20ć 14ć 8ć
7
6
5
4⴨ሩ㺘䗮䟿 3
2
1
0
20ć 14ć 8ć
6
5
4⴨ሩ㺘䗮䟿 3
2
1
0
20ć 14ć 8ć
8
7
6
5
4⴨ሩ㺘䗮䟿 3
2
1
0
20ć 14ć 8ć
6
5
4⴨ሩ㺘䗮䟿 3
2
1
0
20ć 14ć 8ć
A ：肝 Fad6 ；B ：心 Fad6 ；C ：脑 Fad6 ；D ：肌肉 Fad6 ；E ：肠 Fad6 ；F ：鳃 Fad6
图 4 锦鲤 6 种组织中 Δ6 去饱和酶基因在水温 20℃、14℃和 8℃的相对表达量
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.12164
作用。在幼鱼生长发育的关键阶段，鱼体内神经组织，
特别在脑和视网膜中含有高浓度的 DHA，n-3 类高
不饱和脂肪酸和 DHA 总含量均高于其他组织，故
需要合成或摄取大量的高不饱和脂肪酸，以维持其
正常的功能和代谢［28］。本研究中发现锦鲤 Fad6 基
因在肝脏中表达量最高，其次是肠和脑，而在心脏、
肌肉和鳃中表达量较低，这与上述研究者的发现基
本一致。至于在脑中的表达量较低，这可能与鱼类
自身合成高不饱和脂肪酸的能力有关［29］，锦鲤可能
具有较强合成高不饱和脂肪酸的能力，能够通过肝
脏和肠合成高不饱和脂肪酸来满足脑的需求。
3.3 锦鲤各组织中Fad6的表达同水温的关系
温度是 Fad6 表达的重要影响因素。Bell 等［30］和
Tocher 等［22，31］认为，水温的降低能提高硬骨鱼类
Fad6 基因的表达和酶的活性，而 Tocher 等［22］ 和
Hagar 等［32］认为，在一些淡水鱼体内，Fad6 的活
性会随着水温的升高而降低，在虹鳟肠上皮细胞和
肝细胞中 Fad6 的活性在 5℃或 7℃时要高于 15℃或
20℃。同样，Ninno 等［33］研究认为，在肝细胞微粒
体中，Fad6 在 16℃时的活性是 30℃时的两倍。在
本研究中，锦鲤各组织中 Fad6 表达量随水温的降低
而增高，结果与上述文献一致。
细胞膜的流动性受到温度、分子组成等多种因
素的调节。从分子结构角度看，当外界温度降低时，
细胞为保持质膜应有的流动性，往往通过以下 3 种
形式来进行调节，脂肪酸碳链的缩短、碳链分支增
加和提高不饱和度［34-36］。肽链的缩短和分支只能在
脂肪酸生物合成过程中实现［37］，而引入双键提高不
饱和度既可以发生于生物合成过程中［34，38］，也可以
通过去饱和酶对已有的脂肪酸进行催化实现［39，40］。
膜脂中不饱和脂肪酸含量增高，则膜脂相变温度会
降低，膜的流动性增强，从而使细胞乃至整个机体
的抗寒性相应提高［2］。
鱼类为了耐受低温从神经系统脑 AchE 活力的
变化到同工酶的多型性［41，42］，从抗冻蛋白类的适时
转录和翻译到代谢途径的转换［43，44］，以及从膜脂的
组成到结构改变等都发生着深刻的变化。本研究揭
示低温能够诱导 Fad6 基因的表达，进而增加膜脂中
脂肪酸的不饱和度，为深入研究鱼类抗寒机理提供
了依据。
4 结论
在锦鲤物种中研究了 Fad6 保守片段序列。该片
段长 854 bp，编码 284 个氨基酸，与已报道的其他
鱼类 Fad6 序列具有较高同源性。其中与南亚野鲮氨
基酸具有 91.9% 的同源性，该序列具有典型的脂肪
酸去饱和酶的结构特性。Fad6 基因在锦鲤各组织中
均有表达，其中在肝脏表达量最高，其次是肠和脑，
而在心、肌肉和鳃的表达量相对较低。锦鲤各组织
中 Fad6 表达量均随水温的降低而增高，即低温可以
促进 Fad6 基因的表达。
参 考 文 献
［1］Stoner AW, Ottmar ML, Copeman LA. Temperature effects on the
molting, growth, and lipid composition of newly-settled red king
crab［J］. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology,
2010, 393（1-2）：138-147.
［2］Xu YQ, Zhang YM, Ding ZK. Cloning and gene expression of
delta 6 fatty acid desaturase cDNA of cobia（Rachycentron
canadum）［J］. Journal of Fishery Sciences of China, 2010, 17（6）：
1183-1191.
［3］Lin P, Qi LW, Wang YD, et al. A review of advances in fatty acid
desaturase on cold-resistance in plants［J］. Molecular Plant
Breeding, 2006, 4（3）：404-410.
［4］Wen SH, Li XF, Ju B, Wang CH. Sutdies on polyunsaturated fatty
acid in microalgae［J］. Marine Science Bulletin, 2000, 19（4）：
86-91.
［5］Tang H, Pan ZX, Lu LZ, Wang JW. The function and expression
regulation of elongases of very long chain fatty acids［J］.
Chemistry of Life, 2009, 29（6）：898-902.
［6］Tocher DR, Bell JG, McGhee F, et al. Effects of dietary lipid level
and vegetable oil on fatty acid metabolism in Atlantic salmon（Salmo
salar）over the entire production cycle［J］. Fish Physiology and
Biochemistry, 2003, 29（3）：193-209.
［7］Zeng SS, Jiang LM, Yuan DJ. Research and development of fatty acid
desaturase［J］. Chinese Bulletin of Life Sciences, 2008, 20（5）：
816-821.
［8］ Ren HT, Zhang GQ, Li JL, et al. Two Δ6-desaturase-like genes in
common carp（Cyprinus carpio var. Jian）：Structure characteriza-
2015,31(12) 165张萍等：锦鲤Δ6脂肪酸去饱和酶基因克隆及表达研究
tion, mRNA expression, temperature and nutritional regulation［J］.
Gene, 2013, 525 ：11-17.
［9］ Brenner RR, Garda H, de Gómez Dumm IN, Pezzano H. Early effects
of essential fatty acid deficiency on structure and enzymatic activity
of rat liver microsomes［J］. Progress in Lipid Research, 1981, 20 ：
315-321.
［10］Brenner RR. Nutritional and hormonal factors influencing
desaturation of essential fatty acids in animals［J］. Progress in
Lipid Research, 1981, 20 ：41-47.
［11］Zheng X, Seiliez I, Hastings N, et al. Characterization and
comparison of fatty acyl △6 desaturase cDNAs from freshwater and
marine teleost fish species［J］. Comp Biochem Physiol Part B,
2004, 139 ：269-279.
［12］Seiliez I, Panserat S, Kaushik S, et al. Cloning, tissue distribution
and nutritional regulation of a △6-desaturase-like enzyme in
rainbow trout［J］. Comp Biochem Physiol Part B, 2001, 130 ：
83-93.
［13］Seiliez I, Panserat S, Corraze G, et al. Cloning and nutritional
regulation of a △6-desaturase-like enzyme in the marine teleost
gilthead seabream（Sparus aurata）［J］. Comp Biochem Physiol
Part B, 2003, 135 ：449-460.
［14］Watson CA, Hill JE, Pouder DB. Species profile ：Koi and
goldfish［J］. Southern Regional Aquaculture Center, SRAC
Publication, 2004, 7201 ：1-6.
［15］Tamadachi M. The cult of the Koi［M］. Neptune City ：TFH
Publications Inc, 1990 ：288-289.
［16］苏建通 . 锦鲤的养殖与鉴赏［M］. 北京 ：中国农业出版社 ,
2011.
［17］Pfaffl MW. A new mathematical model for relative quantification in
real-time RT-PCR［J］. Nucleic Acids Research, 2001, 29（9）：
2003-2007.
［18］Steel R, Torrie J. Principles and procedures of statistics ：A
biometrical approach［M］. New York ：McGraw-Hill, 1980.
［19］Sprecher H, Luthria DL, Mohammed BS, et al. Reevaluation of the
pathways for the biosynthesis of polyunsaturated fatty acids［J］.
Journal of Lipid Research, 1995, 36（12）：2471-2477.
［20］Francis DS, Peters DJ, Turchini GM. Apparent in vivo delta-6
desaturase activity, efficiency, and affinity are affected by total
dietary C18 PUFA in the freshwater fish Murray cod［J］. Journal
of Agricultural and Food Chemistry, 2009, 57（10）：4381-4390.
［21］Izquierdo MS, Robaina L, Juárez-Carrillo E, et al. Regulation of
growth, fatty acid composition and delta-6 desaturase expression by
dietary lipids in gilthead seabream larvae（Sparus aurata）［J］.
Fish Physiology and Biochemistry, 2008, 34（2）：117-127.
［22］Tocher DR, Fonseca-Madrigal J, Dick JR, et al. Effects of water
temperature and diet containing palm oil on fatty acid desaturation
and oxidation in hepatocytes and intestinal enterocytes of rainbow
trout（Oncorhynchus mykiss）［J］. Comp Biochem Physiol Part B,
2004, 137 ：49-63.
［23］Vagner M, Robin JH, Zambonino Infante JL, Person-Le Ruyet J.
Combined effect of dietary HUFA level and temperature on sea bass
（D. labrax）larvae development［J］. Aquaculture, 2007, 266 ：
179-190.
［24］Vagner M, Zambonino Infante JL, Robin JH, Person-Le Ruyet J. Is
it possible to influence European sea bass（Dicentrarchus labrax）
juvenile metabolism by a nutritional conditioning during larval
stage?［J］. Aquaculture, 2007, 267 ：165-174.
［25］Zheng X, King Z, Xu Y, et al. Physiological roles of fatty acyl
desaturases and elongases in marine fish ：characterisation of
cDNAs of fatty acyl △6 desaturase and elovl5 elongase of cobia
（Rachycentron canadum）［J］. Aquaculture, 2009, 290（1-2）：
122-131.
［26］Bell MV, Dick JR, Porter AE. Pyloric ceca are significant sites
of newly synthesized 22 ：6n-3 in rainbow trout（Oncorhynchus
mykiss）［J］. Lipids, 2003, 38（1）：39-44.
［27］Tocher DR, Mourente G, Sargent JR. Metabolism of［1-14C］
docosahexaenoate（22 ：6n-3）, ［1-14C］eicosapentaenoate（20 ：
5n-3）and［1-14C］linolenate（18 ：3n-3）in brain cells from
juvenile turbot Scophthalmus maximus［J］. Lipids, 1992, 27（7）：
494-499.
［28］Naughton JM. Supply of polyenoic fatty acids to the mammalian
brain ：the ease of conversion of the short-chain essential fatty acids
to their longer chain polyunsaturated metabolites in liver, brain,
placenta and blood［J］. International Journal of Biochemistry,
1981, 13（1）：21-32.
［29］Ren HT, Yu JH, Xu P, et al. Cloning and expression of full length
gene recoding for two △6 fatty acyl desaturases of common carp
（Cyprinus carpio var. Jian）［J］. Chinese Journal of Biochemistry
and Molecular Biology, 2012, 28（7）：677-684.
［30］Bell JG, Tocher DR, Farndale BM, et al. The effect of dietary lipid
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.12166
on polyunsaturated fatty acid metabolism in Atlantic salmon（Sal-
mo salar）undergoing parr-smolt transformation［J］. Lipids,
1997, 32 ：515-525.
［31］Tocher DR, Bell JG, Henderson RJ, et al. The effect of dietary
linseed and rapeseed oils on polyunsaturated fatty acid
metabolismin Atlantic salmon（Salmo salar）undergoing parr-
smolt transformation［J］. Fish Physiology and Biochemistry,
2000, 23 ：59-73.
［32］Hagar AF, Hazel JR. Changes in desaturase activity and the fatty
acid composition of microsomal membranes from liver tissue of
thermally-acclimating rainbow trout［J］. Comp Biochem Physiol
Part B, 1985, 156 ：35-42.
［33］Ninno RE, de Torrengo MAP, Castuma JC, Brenner RR. Specificity
of 5- and 6-fatty acid desaturases in rat and fish［J］. Biochim
Biophys Acta, 1974, 360 ：124-133.
［34］de Mendoza D, Cronan JE. Thermal regulation of membrane fluidity
in bacteria［J］. Trends in Biochemical Sciences, 1983, 8 ：49-
52.
［35］de Mendoza D, Grau R, Cronan JE, et al. Biosynthesis and function
of membrane lipids［M］// Losick R, Sonenshein AL, Hoch JA.
Bacillus subtilis and other ram-positive bacteria ：physiology,
biochemistry and molecular biology. Washington ：American
Society for Microbiology Press, 1993 ：411-425.
［36］ Russell NJ. Mechanisms of thermal adaptation in bacteria ：bluep-
rints for survival［J］. Trends in Biochemical Sciences, 1984, 3 ：
108-112.
［37］Suutari M, Laakso S. Microbial fatty acids and thermal adaptation
［J］. Critical Reviews in Microbiology, 1994, 20（4）：285-328.
［38］de Mendoza D, Klages UA, Cronan JE, et al. Thermal regulation
of membrane fluidity in Escherichia coli effects of overproduction
of beta-ketoacyl-acyl carrier protein synthase I［J］. Journal of
Biological Chemistry, 1983, 258（4）：2098-2101.
［39］Fujii DK, Fulco AJ. Biosynthesis of unsaturated fatty acids
in bacilli ：hyperinduction and modulation of desaturase
synthesis［J］. Journal of Biological Chemistry, 1977, 252 ：3660-
3670.
［40］Fulco AJ. The biosynthesis of unsaturated fatty acids by bacilli,
temperature induction of the desaturation reaction［J］. Journal of
Biological Chemistry, 1969, 244 ：889-895.
［41］Boldwim J, Hochachra PW. Functional significance of isoenzymes
in thermal acclimatization-acetylcholimesterase from trout
brain［J］. Journal of Biological Chemistry, 1970, 116 ：883-887.
［42］ Beneden R, Cashon RE, Powers DA. Inheritance of isocitrate dehy-
drogenzse（Idh-A and Idlh-B）, 6 phosphogluconate dehydrogen-
ase（6 padh-A）and serum caterase polymorphisme［J］. Bioche-
mical Genetics, 1981, 19 ：701-714.
［43］Davies PL, Hew CL. Biochemistry of fish antifreeze proteins［J］.
The FASEB Journal, 1990, 4 ：2460-2468.
［44］Goldstein J, Pollite NS, Inouy M, et al. Major cold shock protein
of Escherchia coli［J］. Proceedings of the National Academy of
Sciences of the USA, 1990, 87 ：283-287.
（责任编辑 马鑫）