全 文 ：·综述与专论· 2014年第8期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
生物体通过各种蛋白互作（Protein-protein inte-
ractions，PPIs）来传递信息，PPIs 是生物体每个细胞
生命活动的基础和特征［1，2］，研究 PPIs 有助于揭示
在分子水平上蛋白质的未知功能以及深入了解复杂
的蛋白互作网络。该研究已成为蛋白组学研究的重
要内容之一，也是蛋白质功能分析研究领域的热点。
目前已建立多种研究方法用于探索 PPIs，包括串联
亲和纯化法（Tandem affinity purification，TAP）、免
疫 共 沉 淀 法（Immunoprecipitation，IP）、 酵 母 双 杂
交（Yeast Two-Hybrid，Y2Z）、 噬 菌 体 展 示（Phage
display）、 亲 和 印 迹（Affinity blotting）、 表 面 等 离
子 共 振 技 术（Surface plasmon resonance technology，
SPR）和蛋白质芯片（Protein array）等［1-5］。随着超
灵敏和高通量的质谱（Mass spectrometry，MS）技术
的出现，蛋白复合物的原位亲和纯化方法逐渐得到
收稿日期 ：2014-01-03
作者简介 ：张志飞，女，博士，副教授，研究方向 ：牧草及草坪草抗性分子生物学 ；E-mail ：zzf0917@ aliyun.com
TAP 亲和标签选择及其在植物蛋白互作研究中的应用
张志飞  赵志丽  文昭竹
（湖南农业大学草业科学研究所，长沙 410128）
摘 要 ： 串联亲和纯化法（TAP）是一种纯化生理条件下蛋白复合物的技术，已广泛应用于鉴定蛋白相互作用和揭示蛋白复
合物互作网络。近年来，随着 TAP 新型标签的不断出现以及与其他技术的联用，TAP 技术正逐渐应用于植物蛋白质互作研究中。
综述了 TAP 亲和标签选择，并介绍其在植物蛋白互作研究中的成功应用。
关键词 ： 串联亲和纯化 亲和标签 植物 蛋白质相互作用
Tag Selection of Tandem Affinity Purification and Its Application in
Plant Protein-Protein Interactions
Zhang Zhifei Zhao Zhili Wen Zhaozhu
（Grassland Science Institute，Hunan Agricultural University，Changsha 410128）
Abstract:  Tandem affinity purification（TAP）is a technology for the purification of protein complex under the normal physiological
conditions, which has been extensively utilized to identify protein-protein interactions（PPIs）and reveal interaction network of protein
complexes. In recent years, TAP technology has been improving in the PPIs study, with the development of new labels, TAP method
improvements and jointed use with other technologies associated. TAP technology is also being increasingly used in the studies of plant PPIs.
This paper reviews the selection of TAP affinity tag and advance of research that TAP has been successful used in the study of plant PPIs.
Key words:  Tandem affinity purification Tag Plant Protein-protein interactions
应用，特别是基于融合亲和标签（Affinity tag）诱饵
蛋白表达的 TAP 技术。
1999 年，TAP 蛋白质复合物纯化技术最早应
用于酵母细胞中蛋白质复合物的纯化［6］。目前，由
TAP 技术产生的 PPIs 实验数据正在不断填充或更
新蛋白质生物信息学数据库，TAP 与 MS 组合分析
已成为鉴定蛋白质复合物和解析其作用特性的一个
标准方法，也常用于蛋白质组装的系统研究［7，8］。
TAP 兼有标准亲和纯化和免疫共沉淀两种生化方法
的优点［9，10］，已成功应用于各种细胞和生物体［11-15］。
研究证明 TAP 灵敏度较高、错误率低，其主要特点
表现为［8，11，16］：TAP 确保高度特异性的蛋白复合物
分离，非特异蛋白量很低，有助于简化后续共纯化
蛋白的鉴定和验证 ；两步洗脱纯化法允许蛋白质复
合物在温和条件洗脱，不需要强烈冲洗。因此，可
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更好地保持蛋白复合物的自然修饰和结合状态，有
利于保持蛋白质成分的天然构象和蛋白复合物的完
整性及下游的蛋白组成和功能分析。利用 TAP 技术
大规模分析不同物种（如酵母和哺乳动物细胞等）
PPIs 的报道很多，但植物蛋白质复合物纯化的报道
相对较少。本文重点阐述 TAP 亲和标签的选择、与
其他技术联用及其在植物 PPIs 研究中的应用。
1 TAP 的原理
TAP 从内源性蛋白中分离纯化蛋白复合物，借
助 MS 技术研究 PPIs。TAP 标签融合蛋白的设计和
创建步骤包括亲和标签的选择、标签的相对顺序和
纯化方式等。经典 TAP 标签由 3 部分组成 ：金黄色
葡萄球菌 Protein A（蛋白 A 的 IgG 结合域）、烟草
蚀纹病毒蛋白酶（Tobacco etch virus，TEV）可剪切
序列和钙调蛋白结合肽（Calmodulin-binding peptide，
CBP）［17］。TAP 技术通过两个连续的亲和纯化步骤
来减少非特异性蛋白的结合［8，15］（图 1）。先将靶
蛋白和 TAP 标签（Protein A 和 CBP）融合表达为标
签靶蛋白（CBP 端与靶蛋白相连），在温和条件下
标签靶蛋白与内源蛋白质互作形成蛋白复合物。然
后 TAP 标签蛋白复合物通过第 1 个标签 Protein A 特
异性结合到 IgG 琼脂珠，并涤除大部分污染物，再
用 TEV 蛋白酶切割蛋白复合物的标签识别位点，以
释放结合的蛋白复合物。随后该蛋白复合物通过第
2 个标签 CBP 结合到钙调蛋白琼脂珠（Calmodulin
beads），经进一步洗涤，用 EGTA（乙二胺四乙酸）
钙螯合剂溶出钙调蛋白琼脂珠结合的蛋白复合物。
最后分离纯化的蛋白通过串联质谱（Tandem MS）、
双向电泳（2D-PAGE）或免疫杂交等方法鉴定分析。
2 TAP 亲和标签的选择
各种 TAP 标签性质和纯化介质各异，应根据自
身研究对象选择和设计合适的 TAP 标签。早期 TAP
技术采用基于 Protein A 的亲和标签，这允许融合蛋
白通过 IgG 的亲和层析进行一步法纯化［16］。此后，
逐渐开发出利用不同亲和作用模式的各种 TAP 标签，
相应的亲和纯化方法已被证明是有效的捕获重组蛋
白的方法。其中，短肽标签（Flag、HA、Myc 和 V5
等）有效地降低了 TAP 标签在与目的蛋白连接时对
靶蛋白结构和功能的干扰的可能性，可以被其特异
性抗体识别。而大片段 TAP 标签（如 GST 和 MBP
等）可扮演双重角色 ：除了作为亲和标签外，标签
与诱饵蛋白融合，增强的表达蛋白的溶解性和 / 或
促进标签融合蛋白质的正确折叠。根据亲和标签的
特异性，溶解度和结合 / 洗脱的条件会有不同。此外，
不同标签的纯化效率及相关成本差异显著［18，19］。很
多研究指出，没有完全满意的通用理想标签，特定
标签的好坏取决于实际应用效果。当为某个特定蛋
白互作研究项目选择亲和标签时，目标蛋白特性（如
稳定性和溶解性）、生产规模和所需纯度是首要考虑
的主要因素［16］。所以通常情况下，标签选择依赖于
TAP 纯化蛋白复合物的研究经验。
截止目前，关于通过 TAP 技术从植物中纯化蛋
白复合物的报道数量有限，一些已用于植物 PPIs 研
究的亲和标签，见表 1。植物 TAP 标签经常采用经
典的酵母 TAP 标签或其对应的植物改良 TAP 标签
（Improved TAP tag，TAPi）［13］。后者以经典的酵母
TAP 标签为基础，加入植物优化的密码子序列和基
因高表达的内含子，没有隐秘性核定位信号（Nuclear
localization signals，NLS）。经典酵母 TAP 标签和改
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IgG
IgG
ProteinA
TEV㳻ⲭ䞦䞦࠷TEV㻲䀓ս⛩ ProteinA
Bait
Bait
Bait
Bait CBP
CBP
CBP
CBP
Bait ：诱饵靶蛋白 ；CBP ：钙调蛋白结合肽 ；TEV ：烟草蚀纹病毒蛋白酶 ；
IgG ：免疫球蛋白 G
图 1 串联亲和纯化法（TAP）原理示意图［8，15］
2014年第8期 25张志飞等 ：TAP 亲和标签选择及其在植物蛋白互作研究中的应用
良 TAP 标签已成功应用于拟南芥［20-22］和水稻［23］
的蛋白质复合物纯化。研究发现［24］，替代的 TAP
标签（Alternative TAP tag，TAPa）可以纯化拟南芥
的蛋白复合物，TAPa 的 CBP 域被 9 × Myc 和 6 ×
His 序列替换，从而防止内源性钙调蛋白结合蛋白
的非特异性纯化，并允许阳离子依赖型酶（Cation-
dependent enzyme） 复 合 物 的 纯 化。Rubio 等［24］ 用
TAPa 与 拟 南 芥 CSN3（COP9 Signalosome complex
subunit 3）融合表达，纯化出多亚基蛋白 COP9 复合
体，而 TEV 切割位点被替换成特异性更强，并具有
低温活性的人鼻病毒 3C 蛋白酶（Human rhinovirus
3C protease，HRV 3C Protease）切割位点。TAPa 标
签仅能纯化单个蛋白质复合物，常被用在蛋白质凝
胶印迹和免疫共沉淀或染色质免疫沉淀实验中［24］。
引入 TAP 标签会影响靶蛋白与亲和配基的结
合，从而影响蛋白质的表达，干扰靶蛋白的结构
和功能，给标签融合蛋白的鉴定带来一定的困难。
TAP 标签细胞内源蛋白与 TAP 标签的 CBP 结合影响
第 2 次亲和纯化效率 ；纯化试剂影响蛋白复合物的
完整性和活性。通过选择合适的标签、调整标签的
位置和研发标签纯化新方法等使 TAP 技术不断完善。
TAP 标签已被成功地应用于纯化拟南芥抗病性［29］、
细胞周期［20］、线粒体生物合成［30］、盐胁迫耐受性［31］、
核质运输［21］、胚胎发育［32］、蛋白磷酸酶抑制因子［33］
和水稻蛋白激酶［34］和开花基因［23］的相关 PPIs。近
几年陆续有新的标签组合和方法应用于植物 PPIs 研
究。Zenser 等［28］利用 Flag 和 HA 亲和标签组合到
诱饵蛋白的新 TAP 系统，成功验证植物蛋白质复合
物的分离。这个系统的主要优点是 ：Flag-HA 短肽
标签减少了蛋白质功能的干扰 ；标签与抗体亲和组
合的高特异性适用于各种植物物种 ；不使用蛋白酶
消化，也不需要 EGTA 作螯合剂，兼容质谱的洗脱
表 1 植物蛋白互作研究中使用的部分 TAP 标签
标签名 序列或分子量大小 剪切酶 参考文献
Prot A-CBP 20 kD TEV protease ［16］
Prot A-His-9×Myc 32 kD HRV 3C protease ［16］
Prot A-His 18 kD TEV protease ［16］
Prot G-SBP 19 kD TEV protease ［16］
His-HA 2 kD N.r. ［16］
HA-Biotinylation 11 kD PreScission protease ［16］
Strep-III 3 kD TEV protease ［25］
3×HA-Strep-III-2×PA 6 kD 3C protease ［25］
3×HA/Strep-tag III 3 kD 3C protease ［26］
3×Flag-Strep-Prot G（FSG） 23 kD TEV protease ［27］
3×Flag DYKDDDDKDYKDDDDKDYKDDDDK TEV protease ［16］
Strep II WSHPQFEK TEV protease ［17］
Flag-HA DYKDDDDKYPYDVPDYA enterokinase ［28］
条件。Stoppel 等［26］通过质体核糖核酸酶（RNase E，
RNE）在拟南芥 RNE 突变体与 TAP 标签 3 × HA 或
Strep-tag III 蛋白融合表达，并与质谱联用成功发现
维管植物特有的调控互作蛋白 RHON1（光合自养生
长的关键因子），RHON1 与 RNE 形成独特的蛋白复
合 体（800 kD）。Jeong 等［27］ 通 过 TAP 标 签 ProtA-
CBP 或 FSG（3 × Flag-Strep-Protein G）与 CPL1（Car-
boxyl-terminal domain phosphatase-like 1）融合表达，
在拟南芥悬浮培养细胞中纯化出 RCF3（Regulator of
Cbf Gene Expression 3），而且先后被酵母双杂交、荧
光素酶互补成像和双分子荧光互补分析证实了 CPL1
和 RCF3 在体内强烈互作。
3 TAP 与其他技术的联用
TAP 技术适用于生理条件下 PPIs 的分离及蛋白
质复合物活性检测。但与其他生物体相比，TAP 技
术在植物 PPIs 的应用上存在一定局限性。与酵母
不同，高等植物的高效同源重组是不可行的，内源
性蛋白质会在一定程度上干扰 TAP 标签融合蛋白与
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其互作蛋白的结合，从而降低了融合蛋白与其互作
蛋白的结合效率，导致提取率降低。因此，内源性
蛋白会在复杂的装配中与其对应的 TAP 标签融合蛋
白竞争。为了尽量避免此缺陷，TAP 标签蛋白可以
引入植物突变体，该突变体通过 RNA 干扰（RNA
interference）抑制或转移 DNA（T-DNA）插入消除
内源基因［1，3］。TAP 与这些技术联用能为标签蛋白
提供更多可利用的互作蛋白，增加纯化的成功率，
从而更准确地鉴定标签蛋白质的功能。此外，过表
达标签诱饵蛋白增强与内源性蛋白结合的竞争力，
也是植物 TAP 成功报道的常用方法［16，17］。但标签
诱饵蛋白的过量表达经常会导致蛋白的非特异性变
化或者蛋白与非自然蛋白的互作。所以最好使用目
的蛋白的自有启动子来控制其在宿主细胞中的表达。
该技术与大多数研究 PPIs 的技术一样，存在假
阳性的问题，需要在实验中仔细验证，尤其在低丰
度蛋白复合物和瞬时或微弱的 PPIs 研究中容易出现。
核苷酸可通过 PCR 扩增控制量的变化，使其量与细
胞蛋白质量一致，保持在 10-100 拷贝至 107 拷贝的
动态变化中，TAP 纯化成功率依赖于蛋白质复合物
的量和 MS 的灵敏度。多个洗脱组合或者增加植物
性样品的起始蛋白量可以减少假阳性干扰［1，16］。另
外，与整株植物相比，植物细胞悬浮液可以快速增
长，并提供无限量供应的同步生物材料，这意味着
提供更多的蛋白质给复杂的蛋白或复合物装配，可
以提高植物样品的起始蛋白量，并广泛用于参与初
级代谢、基因表达或细胞壁合成等生物过程的植物
蛋白复合物分离。低丰度蛋白质（如膜蛋白等）形
成的靶蛋白复合物量较少，有时很难通过 TAP 技术
检测。膜相关的抗病性蛋白（Membrane-associated
disease resistance protein）RPS2 是质膜低丰度蛋白，
利 用 TAP 与 交 联 试 剂 DSP（Dithiobis succinimidyl
propionate）联用纯化 RPS2 的 PPIs 时发现，与交联
试剂联用纯化获得的 RPS2 相互作用蛋白 RIN4 比单
独使用 TAP 获得的量更大，而且交联试剂在纯化过
程中使蛋白复合物更加稳定，此法可用于纯化膜蛋
白的相互作用蛋白或瞬时结合蛋白［35，36］。
新亲和标签的出现和质谱等技术联用的快速发
展，植物 TAP 将不断的快速“更新升级”，从而推
动植物生物大分子复合体结构及蛋白质相互作用的
深入研究。理想的蛋白质相互作用研究方法应该能
够具有高特异性，高度真实性和高分辨率等特点，
目前仅依靠单一研究方法很难实现。今后 TAP 会与
各种方法技术并存，相互间交叉互补联用，将成为
研究植物蛋白质相互作用的主要技术手段。
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（责任编辑 狄艳红）