全 文 ：蛋白质组学研究中的新技术
王阳梦 何聪芬* 董银卯
(北京工商大学北京市植物资源研究开发重点实验室,北京 100037)
摘 要: 随着后基因组时代的到来, 蛋白质组研究日益受到密切关注。蛋白质组学的发展需要有先进的技
术平台作支撑。除了蛋白质组研究中的三大核心技术- 双向电泳、质谱和生物信息学技术, 近几年又不断涌现出
许多新技术。本文对同位素标记亲和标签、酵母双杂交、多维色谱 ) 质谱联用等新技术作一概述。
关键词: 蛋白质组 同位素标记亲和标签技术 酵母双杂交技术 串联亲和纯化技术 多维色谱 ) 质谱联
用技术 蛋白质芯片技术
Review of Some new Technologies for Proteomic Research
Wang Yangmeng He Congfen* Dong Yinmao
( B eij in g K ey lab of P lant Re sour ces Resear ch and Dev elopment , Bei j ing Te chnology and
Business Univ er si t y , Bei j ing 100037)
Abstract: Proteomics is one of the most active r esseach fields in the po st- genomic era. It is generally acknow -l
edged that the r eseach of prot eomics was based much on the development and improvement of techniques and meth-
ods. Nowadays, the three main techniques are two dimensional electrophor esis( 2-DE) , mass spectrometry ( MS) and
proteom ic databases. Besides the thr ee techniques, there ar e many new technolog ies come fo rth in t he past few
years. Here, some of t he new technolog ies were summar ized such as isotope-coded affinity tag ( ICAT ) , yeast two
hybrid system, mult-i chromato gr aphy etc in t his paper.
Key words: Proteom ics Iso tope-coded affinit y tag Yeast t wo- hybr id system Tandem affinity pur ification
Multidimentional chr omato gr aphy-M S Pro tein biochip
人类基因组计划的完成标志着生命科学已进入
后基因组时代。蛋白质组学的研究被提升到了前所
未有的高度。
蛋白质组学是随着研究技术的不断完善而发展
的。O. Farrel等于 1975 年建立了双向电泳技术
( tw o dimensional electr ophor esis, 2-DE) ,可同时分
离数千种蛋白质。20世纪 80年代, pH 梯度胶条代
替了载体两性电解质, 改善了双向电泳的重复性和
加样量 [ 1] ; 80 年代后期研发的电喷雾电离质谱
( ESI-M S)和基质辅助激光解吸电离质谱( MALDI-
MS) , 可以精确测定生物大分子的相对分子质量及
多肽序列,使得微量快速的蛋白质测定得以实现; 生
物信息学的建立使得分析复杂的蛋白质图谱变得更
容易。双向电泳、质谱和生物信息学技术被称为蛋
白质组研究的三大核心技术。除此以外, 新的蛋白
质组研究技术也不断出现,如用于定量蛋白质组学
研究的同位素标记亲和标签技术和双色荧光技术;
用于蛋白质 ) 蛋白质相互作用研究的酵母双杂交技
术、蛋白质复合物免疫分离与质谱鉴定技术;用于大
规模蛋白质分离与鉴定的多维色谱 ) 质谱联用技
术;用于翻译后修饰的蛋白质图谱展示与检测技术
及蛋白质芯片技术。
本文对近些年蛋白质组研究中涌现出的一些新
技术做一概述。
1 同位素标记亲和标签技术( ICAT)
传统的双向电泳 ) 质谱分析方法在定量方面的
准确度、可靠性和重复性尚不尽如人意。Gygi等[ 2]
发展了一种小分子量试剂, 即同位素编码的亲和标
收稿日期: 2005-6-27
作者简介:王阳梦( 1982- ) ,女,在读硕士研究生,研究方向:植物生物技术
生物技术通报
# 技术与方法# BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2005年第 5期
签( isotope-coded af finity tag , ICAT )。ICAT 试剂
分为 D0和 D8两种,相差 8个质量单位, 均包括3个
部分:与巯基反应的基团、可与同位素连接的部位及
与生物素结合的基团。用 D0 和 D8试剂分别与不
同的蛋白质样品反应,试剂选择性与半胱氨酸反应,
然后把两种反应产物混合,酶解, 用亲和色谱等色谱
手段分离被标记的肽段, 进行 LC/ M S/ MS 或 MAL-
DI-T OF 测定。若一对峰相差 8个质量数,则为同一
种蛋白质。由 D0 和 D8峰的相对强度可得到此蛋
白质在两种样品中的相对丰度(图 1)。
图 1 ICAT技术流程
这是一种全景式蛋白质差异表达分析新技术,
可有效分析 2-DE 不易检测的膜蛋白和低丰度蛋白
质,是蛋白质研究又一里程碑,其优点及意义在于:
( 1)混合样品(来自正常和病变细胞或组织等)
可直接测试。
( 2)快速定性和定量鉴定低丰度蛋白、疏水性蛋
白等。
( 3)结合液相色谱和串联质谱技术, 使高通量,
自动化蛋白质组分析更简单、准确和快速。
( 4)快速找出重要功能蛋白质(与疾病相关蛋白
质等)及生物标志分子,进而用于疾病快速诊断。
但 ICAT 的分子量约为 500Da, 对一些小肽段
来说是一个很大的修饰物,会增加数据库搜索算法
的复杂性;无法分析不含 Cys 的蛋白质。但这一不
足可以通过合成对其他蛋白质基团专一的 ICAT 试
剂来弥补, 这一思想会有力的推动对蛋白质翻译后
修饰的研究[ 3]。
最近,人们根据不同的实验目的衍生出其它一
些 ICAT 技术和试剂, 如: M ichael 等[ 4] 在 ICAT 试
剂基础上发明了磷酸化蛋白同位素亲和标签试剂
( pho sphoprotein isotope-coded aff inity tags, PhI-
A T) ,为研究和鉴定磷酸化蛋白的磷酸化位点提供
了一条新途径; Huilin Zhou等 [ 5]将传统的 ICAT 技
术进行改进,提出了固相同位素标签( so lid phase -i
sotope tag ging reagent )技术。
2 酵母双杂交系统
酵母双杂交系统是研究蛋白质间相互作用的有
力工具。其基本原理是: 真核生物转录激活因子都
由两部分独立的功能域组成, 即 DNA 结合功能域
( DNA-BD)和激活功能域( AD)。DNA-BD 的作用
是与特异的启动子结合, AD的作用是引导 RNA 聚
合酶Ⅱ复合物, 两者靠近并协同作用,才能使下游的
基因得以转录。若将待测蛋白之一与 DNA-BD 融
合,蛋白之二与 AD融合,若待测的两种蛋白有相互
作用,则 DNA-BD和 AD 靠近并激活报道基因的转
录,借此可研究蛋白质间的相互作用[ 6]。
酵母双杂交系统同以往研究蛋白质相互作用的
手段相比,具有以下优点:
( 1)检测蛋白质之间相互作用在细胞内进行,不
需要额外的纯化步骤;
( 2)所证实的蛋白质间的相互作用更接近体内
的真实水平;
( 3)可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时
的相互作用。
此技术也有一些局限性, 人们相应地做了一些
改进,主要有:
( 1)分析蛋白质间相互作用定位于细胞核内,而
许多蛋白质间相互作用在核内无法进行。另外有些
蛋白质的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋白质
的辅助,这限制了某些胞外蛋白质和细胞膜受体蛋
白质等的研究。为此初步建立了哺乳动物双杂交系
统作为酵母双杂交系统的辅助手段[ 7]。另外还构建
了 SOS 恢复系统 [ 8]和泛素专一性蛋白酶系统[ 9] , 针
对膜受体、细胞外分泌蛋白质等进行研究。
( 2)为了解决/ 假阳性0的问题, M arso lier [ 10] 等
人提出了建立在 RNA 聚合酶Ⅲ转录基础上的双杂
交系统。James[ 11]等人还构建了含三种不同的报告
基因( ADE2, H IS3和 LacZ)的酵母 PJ69-4A 菌株,
472005年第 5期 王阳梦等:蛋白质组学研究中的新技术
可灵敏地检测出很弱的结合作用, 显著消除假阳性。
近年来,在原有的酵母双杂交的基础上又发展
了反向双杂交体系[ 12] ( reverse tw o-hybrid sy stem)
和三杂交体系[ 13] ( three-hybrid system)。
1996年 Vidal 等[ 12] 建立了反向酵母双杂交系
统,提供了简便的鉴定阻断蛋白间相互作用的方法。
它能发现可导致相互作用的蛋白质间发生解离的小
分子物质。许多疾病与蛋白质异常的相互作用有
关,这对于疾病的治疗非常有意义。
三杂交系统主要用于研究多蛋白质复合体之间
的相互作用。在单个酵母细胞中, 传统的双杂交体
系只能研究两个蛋白质之间的相互作用, 易造成假
阳性或假阴性。而在三杂交体系中, 加入受表达调
控的第三种蛋白质能使蛋白质复合体的相互作用更
符合生理状态。三杂交体系是对双杂交体系的一个
有益补充。以此为基础甚至可再构建四杂交体系和
反向三杂交体系, 以研究更广泛的蛋白质间相互作
用[ 14]。
由于双杂交系统并不能解决所有的蛋白质相互
作用问题。因此,在对其进一步改进的同时, 其他研
究蛋白质相互作用的手段也是必不可少的。
3 串联亲和纯化技术( tandem affinity purif-i
cation, TAP)
串联亲和纯化是一项新的纯化蛋白质混合物的
技术。此方法的巧妙之处在于设计了一个双重分子
标签,由金黄色葡萄球菌蛋白质 A 的两个 IgG结合
结构域( P rotA)及一个钙调蛋白结合多肽 ( CBP)组
成,结构域与多肽间由一个 TEV 蛋白酶切位点隔开
(图 2)。
图 2 C末端 TAP标签
操作时,将靶蛋白与 T AP 标签融合于合适的表
达质粒,并将构建好的质粒导入相应的细胞或生物
体表达,若融合蛋白能以天然水平或接近天然水平
表达,则可形成稳定的复合物。温和裂解细胞得到
的细胞裂解液在非变性条件下与 IgG 基质一起温
育,复合物中的靶蛋白可通过 ProtA 标签和 IgG特
异结合,洗脱掉杂蛋白后,用 T EV 蛋白酶切割标签,
洗脱下仍带有 CPB 标签的复合物, 这是第一步纯
化。在钙离子存在的条件下, 将第一步纯化后的产
物与钙调蛋白包被的珠子一起温育, 复合物通过
CBP 标签又一次结合于珠子上,然后洗弃杂蛋白及
残余的 TEV 蛋白酶,温和条件下用 EGTA 洗脱,就
可以得到高纯度的天然构象的靶蛋白(图 3)。洗脱
好的蛋白可用 EDMAN 降解法或 Wester n 印记处
理, 经指数梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后即可用
于质谱分析。
TAP 技术在低浓度情况下, 也能高效富集目的
蛋白,且纯化多在温和天然条件下进行。与酵母双
杂交技术相比其优势在于可用于分析反应中蛋白间
的瞬时相互作用; 鉴定与靶蛋白发生直接或间接作
用的配体。目前, 此技术已在酵母蛋白质组研究中
广泛应用。
图 3 TAP技术基本原理
此技术也有局限性: 少数靶蛋白会在 T EV 蛋白
酶处理后被破坏; 细胞裂解时有时会破坏 TAP 标
签;细胞内源钙调蛋白会与 CBP 结合, 影响第二次
纯化等。为此, 人们主要从标签系统和纯化方法上
改进 T AP 技术。在对标签系统的改进中 Puig 等发
48 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2005年第 5期
展了 N 末端标签,差减式标签和分离式标签[ 15] 。在
纯化方法的改进中可采用省略透析, 加入非离子去
垢剂,提高盐浓度等手段,以提高表达蛋白浓度。准
备细胞抽提物时, 为了排除降解的可能性, 可采用
Wester n印记技术检测融合蛋白的 ProtA 部分, 从
而确定抽提效果及 T AP 标签的稳定性[ 16 ]。
4 多维色谱 ) 质谱联用技术
近年来,液相色谱( LC)和毛细管电泳( CE)的发
展为蛋白质和多肽的分离分析提供了新的手段。然
而一维分离模式所能提供的分辨率和峰容量十分有
限。多维色谱包括体积排阻色谱( SEC)、离子交换
色谱( IEC)、亲和色谱( AC)和反相液相色谱( RPLC)
等, 可以采用多种不同的液相分离模式之间或液相
分离模式与 CE 之间以及不同 CE 模式之间偶联,从
而实现对复杂样品的分离。多维色谱 ) 质谱联用技
术可以弥补 2-DE 分离能力有限, 重复性较差, 操作
程序较复杂,而且难以自动化的不足。
目前,常用的二维LC有离子交换色谱 ) 体积排
阻色谱( 2D-IEC-SEC)、离子交换色谱 ) 反相液相色
谱( 2D-IEC-RPLC)和亲和色谱- 反相液相色谱( 2D-
AC-RPLC)等。
2D-IEC- SEC 与质谱联用技术中, 样品在第一维
根据各组分离子交换性能的不同而分离, 在第二维
中依据分子量的不同进一步分离, 并通过 MS/ M S
对多肽进行序列分析, 最后在计算机上利用数学算
法对所获得的序列与从基因组翻译的蛋白质序列进
行比较,确定出多肽所对应的蛋白质。
2D-IEC-RPLC 与质谱联用是根据电荷和疏水
性差异,对样品进行离子交换色谱分离后, 再进行反
相液相色谱分离。Yates 研究组在此基础上加以改
进:将 IEC和 RPLC 的色谱柱以串联分离的方式合
并于同一色谱柱中。该方法被称为多维蛋白质鉴定
技术 ( mult idimensional protein ident if ication tech-
nolo gy, M udPIT ) ,可对样品量较少的蛋白质进行快
速分析,适用于蛋白质组学中大规模蛋白质的分离
鉴定。Yates研究组利用这一技术分析啤酒酵母的
酶解产物,鉴定出 1 484个蛋白, 其中包括许多低丰
度蛋白和跨膜蛋白[ 17] 。
2D-A C-RPLC 与质谱联用技术是用亲和色谱柱
对某一类具有特异性亲和力的蛋白质进行提取, 然
后进行 LC-MS 或 MS/ MS 鉴定,确定出蛋白质的种
类和修饰位点。此方法对研究翻译后蛋白质修饰,
特别是磷酸化蛋白质组的研究具有重要意义。另
外,亲和色谱与质谱联用可以分析蛋白质复合物,同
时对蛋白质相互作用网络进行研究。
除了上述的二维液相色谱分离系统, 多维色谱
分离模式还包括 LC 与 CE 合理的组合并与各种质
谱在线联用, 以及二维毛细管电泳分离模式。这些
技术都是多维色谱研究的重要内容。LC 与 CE 具
有理想的互补性,而且分离速度快。因此, LC 与 EC
联用可实现各种复杂样品,特别是生物样品中不同
性质组分的高效、高分辨率和快速分离。
多维色谱 ) 质谱技术尚处于探索阶段, 目前无
法完全代替 2-DE,但可弥补 2-DE-M S的一些缺陷。
它是分离分析复杂体系很有前景的技术手段。
5 蛋白质芯片技术
蛋白质芯片是一种固相支持物表面预先固定大
量的探针蛋白, 形成高密度排列的探针蛋白点阵。
将带有特殊标记(如荧光染料标记)的样品蛋白质与
芯片上的探针杂交, 探针与待测蛋白结合, 然后通过
检测器检测标记物并用分析软件处理所得结果。
最近, 美国 Cipher gen 公司推出了一种基于蛋
白质芯片和质谱技术的分析平台 ) ) ) 表面加强激光
解吸电离 ) 飞行时间质谱( SELDI-T OF-M S) 蛋白
质芯片技术。它将蛋白质芯片与质谱技术结合在一
起。其核心是一系列具有多种特性的蛋白质芯片。
将蛋白质混合物与一系列不同特性的 Pr otenChip
结合,洗去不与芯片结合的蛋白, 将得到的复合物与
能量吸收分子结合成混合晶体, 利用激光脉冲辐射
使混合晶体解析成不同质荷比的离子, 根据它们在
仪器场中飞行时间的长短不一绘制出质谱图, 这样
就得到了基于不同相互作用的多维蛋白质图谱。此
方法可获得可重复的、统一的质谱图,因而可用于定
量蛋白质研究[ 18] 。
根据 SELDI芯片表面的不同成分, 可将其分为
化学表面芯片和生物表面芯片[ 19] 。此外, 新近还开
发了一种表面预活化的芯片( pre-act ivated surface,
PS) ,可根据实验需要偶联相应的分子如蛋白质和小
分子化合物等[ 20] 。
蛋白质芯片技术在蛋白质组学研究中有很多优
492005年第 5期 王阳梦等:蛋白质组学研究中的新技术
势:
①SELDI系统集分离、纯化、检测和分析为一
体,具有快速、简便、高通量的特点;
②可直接采用血液、尿、细胞裂解液等粗生物样
品进行分析而无需预先处理;
③可检测出< 1fmol的蛋白质, 因此每次分析只
需要 0. 5~ 5Ll或 2 000个细胞的超微量样本。可检
测出一些通常难以鉴定的低丰度、小分子量蛋白[ 21] ;
④鉴定所获得的信息量大, 可直观显示样品中
各种蛋白质的相对分子量、含量、等电点、糖基化位
点、磷酸化位点等。
SELDI 蛋白芯片技术在诸多领域得到广泛的应
用,特别是临床和实验室蛋白质组学的研究。用之
检测特异性的疾病相关蛋白已经在前列腺癌、卵巢
癌、乳腺癌等肿瘤及艾滋病、老年性痴呆等疾病中得
以证实[ 22~ 25] ,对其进一步优化有望在将来的临床实
践中发展成为一种对早期无症状癌症的新型低创、
灵敏特异、高通量、大规模的疾病筛查方法。另外,
此技术还可应用于药物研发, 例如进行药效学及药
代动力学的研究, 为确定药物作用的靶位提供了有
力的工具。
蛋白质芯片技术还有待进一步完善, 增强对靶
蛋白的结合特性而不与其他蛋白质发生交叉反应;
加大芯片摄取蛋白的数目和种类, 尽可能多的捕获
蛋白质组信息以及进一步向高度集成化、微型化和
自动化发展等。
6 前景与展望
蛋白质组学的兴起对技术有了新的需求和挑
战。它的发展既是技术所推动的, 也是受技术限制
的。发展高通量、高灵敏度、高准确性的研究技术平
台是现在乃至在今后相当一段时间内蛋白质组学研
究中的主要任务。此外, 在发展新技术的同时还要
强调各种技术方法之间的整合和互补, 以发挥各项
技术最大的潜能,推动蛋白质组学的发展。
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