全 文 ：第 35 卷第 15 期
2015年 8月
生 态 学 报
ACTA ECOLOGICA SINICA
Vol.35,No.15
Aug.,2015
http: / / www.ecologica.cn
基金项目:国家自然科学基金项目(31270489, 30800137); 国家“973冶项目(2012CB416904); 江苏高校优势学科建设工程资助项目
收稿日期:2013鄄09鄄29; 摇 摇 网络出版日期:2014鄄10鄄16
*通讯作者 Corresponding author.E鄄mail: bai鄄lian.li@ ucr.edu
DOI: 10.5846 / stxb201309292390
于水强, 王文娟, B. Larry Li.环境 DNA技术在地下生态学中的应用.生态学报,2015,35(15):4968鄄4976.
Yu S Q, Wang W J, B. Larry Li.Applied environmental DNA technology to study underground ecology.Acta Ecologica Sinica,2015,35(15):4968鄄4976.
环境 DNA技术在地下生态学中的应用
于水强1,2, 王文娟1, B. Larry Li2,*
1 南京林业大学林业生态工程重点实验室, 南京摇 210037
2 加州大学河滨分校植物科学系, 加利福尼亚 美国摇 92521鄄0124
摘要:地下生态过程是生态系统结构、功能和过程研究中最不确定的因素。 由于技术和方法的限制,作为“黑箱冶的地下生态系
统已经成为限制生态学发展的瓶颈,也是未来生态学发展的主要方向。 环境 DNA 技术,是指从土壤等环境样品中直接提取
DNA片段,然后通过 DNA测序技术来定性或定量化目标生物,以确定目标生物在生态系统中的分布及功能特征。 环境 DNA技
术已成功用于地下生态过程的研究。 目前,环境 DNA技术在土壤微生物多样性及其功能方面的研究相对成熟,克服了土壤微
生物研究中不能培养的问题,可以有效地分析土壤微生物的群落组成、多样性及空间分布,尤其是宏基因组学技术的发展,使得
微生物生态功能方面的研究成为可能;而且,环境 DNA技术已经在土壤动物生态学的研究中得到了初步应用,可快速分析土壤
动物的多样性及其分布特征,更有效地鉴定出未知的或稀少的物种,鉴定土壤动物类群的幅度较宽;部分研究者通过提取分析
土壤中 DNA片段信息对生态系统植物多样性及植物分类进行了研究,其结果比传统的植物分类及物种多样性测定更精确,改
变了以往对植物群落物种多样性模式的理解。 同时,环境 DNA技术克服传统根系研究方法中需要洗根、分根、只能测定单物种
根系的局限,降低根系研究中细根区分的误差,并探索性地用于细根生物量的研究。 主要综述了基于环境 DNA 技术的分子生
物学方法在土壤微生物多样性及功能、土壤动物多样性、地下植物多样性及根系生态等地下生态过程研究中的应用进展。 环境
DNA技术对于以土壤微生物、土壤动物及地下植物根系为主体的地下生态学过程的研究具有革命性意义,并展现出良好的应
用前景。 可以预期,分子生物学技术与传统的生态学研究相结合将成为未来地下生态学研究的一个发展趋势。
关键词:环境 DNA; 地下生态学; 土壤微生物; 土壤动物; 物种多样性; 根系生态
Applied environmental DNA technology to study underground ecology
YU Shuiqiang1,2, WANG Wenjuan1, B. Larry LI2,*
1 Key Laboratory of Forestry Ecological Engineering, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China
2 Department of Botany & Plant Sciences, University of California, Riverside, CA, 92521鄄0124, U.S.A.
Abstract: Ecological processes below ground have the least understood factors in ecosystem structure, functions, and
processes. Due to technical and methodological limitations, the underground ecosystem ecology, as a “ black box冶, has
become a bottleneck in the development of modern ecology. With the recent development of new DNA methods, the
underground ecological research is becoming a hot topic in ecology. Environmental DNA technology includes extraction of
DNA fragments directly from environmental samples such as soil, qualitative and quantitative analyses of target organisms by
DNA sequencing, and determination of the distribution and functional characteristics of target organisms in the ecosystem.
The technology has been successfully applied to study underground ecological processes. Currently, environmental DNA
technology is relatively established in the study of microbial diversity and function, and overcomes the long and unsolved
issue that most soil microorganisms cannot be cultured. The environmental DNA technology can effectively analyze soil
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microbial community composition, diversity, and spatial distribution. Microbial function in underground ecological processes
can be determined by metagenomics technology. This technology has also been applied to study soil animals; it can quickly
analyze diversity and distribution of soil animals, more effectively identify unknown or rare species, and widen the
magnitude of the soil fauna identification. Some studies on plant biodiversity and plant taxonomy have utilized extraction and
analysis of DNA fragment information in soil. The results obtained by this technology have been more accurate than those
obtained by traditional methods. The environmental DNA technology has changed our knowledge about the pattern of plant
species diversity. Meanwhile, this technology can overcome the limitations in traditional studies of root systems by reducing
the error in root identification, and it can be applied to analyze complex roots involving several species. The environmental
DNA technology has also been used to estimate the fine root biomass. In this paper, we summarized the DNA鄄based
molecular methods applied in the study of microbial diversity and function, soil animal diversity, underground plant
diversity, roots ecology, and other underground ecological processes, and we believe that our results will provide new ideas
and inspiration for studies on complex underground ecology. Environmental DNA technology will be revolutionary in
identifying the underground ecosystem structure and function, especially in the ecological processes related to soil
microorganisms, animals, plant diversity, and plant roots studies. Future work should focus on three research aspects: (1)
ecological function of soil organisms, especially soil animals, by metagenomics technology; ( 2 ) application of
environmental DNA technology in roots ecology, such as fine root biomass estimation, underground configuration of plant
communities, distinguishing roots and rhizosphere, nutrient competition between plants and microbes in soil; and ( 3)
scaling up, from small鄄scale observations and experiments to the prediction of large鄄scale patterns as a key to unravel the
questions in molecular ecology. It is necessary to fully combine environmental DNA technology with the theory and methods
of traditional ecology, especially in the studies of community ecology and ecosystem ecology. Environmental DNA technology
has very broad application prospects in underground ecological research. Molecular biology techniques combined with
traditional ecological methods will be the future trend of underground ecology.
Key Words: environmental dna; underground ecology; soil microorganisms; soil fauna; biodiversity; root ecology
陆地生态系统包括地上和地下部分两大组分,二者相互作用共同影响生态系统的结构和功能[1]。 一直
以来,生态学的主流研究主要集中在生态系统地上部分,并已经有了相当深入的了解,而对于地下生态过程,
则了解甚少[2],如地上部分生物群落如何驱动地下生态过程? 地下生物群落又如何反馈于地上生态过
程[1,3]? 至今,由于技术与方法等方面的限制,地下生态过程的研究仍停滞不前,在土壤微生物、土壤动物、植
物多样性及根系生态方面还有很多难以理解的问题[1,4]。 作为“黑箱冶的地下生态过程是生态系统结构、功能
与过程研究中最不确定的因素,已成为限制现代生态学发展的“瓶颈冶,也严重制约着生态系统与全球变化关
系研究的理论拓展[5]。 全球变化的现实,也更迫切地要求生态学家从地下过程的研究中认识陆地生态系统
的响应机制[2]。
随着分子技术的发展,环境 DNA技术对于解决地下生态过程中存在的难题提供了一种方便快捷的解决
方法,已经在地下生态过程研究中展现出良好的应用前景[6鄄7],近几年来,环境 DNA 技术在土壤微生物多样
性[8鄄10]、土壤动物多样性[11鄄13]、地下植物丰富度及分布[14鄄17]、根系生态方面[18鄄21]都得到了一定发展和应用。
随着生态学研究的深入,将分子技术与传统的生态学研究相结合将成为未来生态学研究的一个发展趋势[6]。
本文主要对环境 DNA技术在土壤生物多样性及功能、根系生态方面的应用进行了综述,以期能为复杂的地下
生态系统研究提供新的思路和启发。
1摇 环境 DNA(eDNA)分子技术
环境 DNA(eDNA)是指由活细胞或有机体产生的细胞 DNA 和由细胞结构破坏及死亡后产生的细胞外
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DNA组成[22鄄23]。 最早(1987年)是由 Ogram在沉积物中微生物 DNA提取和纯化的研究中提出的概念[24],但
直到 2000年之后才被生态学家广泛认可及应用[6,25鄄26]。 所谓环境 DNA 技术,是指从土壤、水体及沉积物等
环境样品中直接提取 DNA片段,然后通过 DNA测序技术(如 Sanger 双脱氧链终止法;化学裂解法;新一代测
序技术(NGS)等)来定性或定量化目标生物,以确定目标生物在生态系统中的分布及功能特征[27鄄28]。
目前常见的分子技术主要有:基于 PCR 的构建克隆文库方法、变性 /温度梯度凝胶电泳(DGGE / TGGE) 、
随机引物扩增多态性分析(RAPD) 、限制性片段长度多态性(RFLP)、末端限制性片段长度多态性(T鄄RFLP)
、荧光原位杂交(FISH)、宏基因组学(Metagenome)及宏转录组学(Metatranscriptomics)等[6鄄7,17,29鄄32]。 尤其是基
于低成本、高通量测序平台(目前以 Illumina 公司的 Solexa,ABI 公司的 SOLid,和 Roche 公司的 454 技术应用
最为广泛)的新一代测序及基因芯片技术的出现,不仅克服了 Sanger 测序等方法,在克隆及 PCR扩增产物测
序的耗时,费用昂贵等缺点,而且具有从同一个样品中同时分析测序多种基因的优点,使得复杂环境样品的基
因组分析已经成为生态学研究中的重要方法与手段[17,29,31鄄34]。 基于 DNA 的分子技术方法,对于理解物种进
化、生态系统演替、生态系统的结构和功能、及生态多样性等研究将具有重要的推动作用;尤其是对于作为
“黑箱冶处理的地下生态系统来说,将具有革命性意义,对地下生物组成、生物多样性、地下生态系统结构和功
能等认识和理解将具有十分广阔的应用前景[6鄄7,30鄄31]。
2摇 环境 DNA技术在土壤生物多样性及功能方面的应用
2.1摇 土壤微生物多样性及功能
土壤微生物是土壤生物中的一个重要类群,其群落结构、多样性及动态过程是气候和土壤环境条件变化
的敏感指标,在物质合成、降解、碳氮等元素地球化学循环方面具有十分重要的生态功能。 土壤微生物多样性
主要研究土壤环境中微生物种群的种类、丰度、分布均匀性、结构变化和微生物群落的功能多样性等。 但人类
对微生物物种的了解非常有限,Cowan等指出只有 20万种微生物可以用人工的方法进行纯培养,只占整个自
然界微生物物种总数的 1%—10%,远远低于微生物实际的多样性程度[35鄄36]。 20世纪 90 年代,随着分子生物
学技术的发展,特别是 16S rRNA 基因序列在分子系统学上的应用,许多研究者试图避开微生物的培养工序
而从分子水平上了解和确认自然环境中存在的微生物,及其在土壤生态系统中的结构和功能。 目前,大多数
环境 DNA技术在土壤微生物多样性及生态功能方面都得到了应用[6鄄7,29鄄31]。 如有些研究通过 16S rDNA 序列
分析法分析了土壤细菌多样性[9鄄10],结果说明土壤的农业耕作可显著影响细菌和古生菌的多样性。 He 等分
别利用 16S和 18S rRNA 基因调查了澳大利亚两种针叶林土壤中细菌和真菌群落组成及多样性[37鄄38]。 随着
宏基因组和宏转录组概念的提出、新一代高通量测序技术及基因芯片的应用,微生物宏基因组学和宏转录组
学逐渐成为微生物研究的热点和前沿。 Bu佴e等利用第二代测序技术(454焦磷酸测序) 对 6种森林类型土壤
真菌进行调查,结果表明,不同植被类型森林土壤中存在极高的真菌生物多样性,可有效探究真菌群落随环境
变化的精细结构[39]。 Blaalid等采用 454扩增产物测序方法研究了不同演替梯度下草本植物珠芽蓼(Bistorta
vivipara)共生菌根真菌群落特征,菌根真菌多样性随着演替梯度的变化显著增加[40]。 这些结果体现了高效的
454测序技术在研究地下生态系统真菌群落时空动态过程中的有效应用。
宏基因组学技术不仅应用在土壤微生物多样性方面的研究,也逐渐用来揭示微生物参与土壤生态过程等
功能方面的探讨。 如 Zhou等基于功能基因芯片技术,研究了土壤长期增温后微生物对土壤有机碳稳定性的
影响,结果表明,在增温条件下,分解易降解有机碳的基因变得活跃, 而分解难降解有机碳的基因并没有显著
改变, 这表明土壤有机碳库主体相对稳定[41]。 He等通过功能基因芯片技术,研究 CO2浓度升高的效应,发现
碳固定基因、易降解碳基因以及氮循环基因的数量明显增多,活性增加,表明土壤微生物参与这 3种生态过程
的功能增强[42]。 Mackelprang等基于 454测序技术调查了高寒条件下土壤微生物的群落变化,研究发现,当
永久冻土随气温升高而融化时,微生物群落的碳氮循环功能基因的活化,与永久冻土里甲烷释放等现象存在
相关性[43]。 而宏转录组学是从整体水平上研究特定环境、特定时期群体细胞中所有 RNA(包括 mRNA 和非
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编码 RNA) 的转录情况及转录调控规律。 因其测序量小,发现新基因能力强,同时可对微生物群落结构和原
位功能进行解释,比宏基因组学技术更为有效地监控由环境引起的群落结构和功能的变化[44鄄45]。 这种技术
在土壤微生物结构和功能的研究中也得到了初步应用。 如 Leininger 等人通过 cDNA 的高通量测序及数据库
比较分析对欧洲 12个不同土壤类型样品进行了研究,发现泉古菌很可能是土壤生态系统中丰度最高的胺氧
化生物群体[46]。 而 Urich等人采用宏转录组和宏基因组两种方法,结合 SEED 数据库及 MEGAN 程序,对沙
质土壤生态系统微生物群落的结构和功能特征进行研究,同样发现泉古菌对土壤氨氧化和 CO2固定过程起重
要作用,而宏转录组比宏基因组更为有效地检测微生物群落结构变化的过程[45]。
宏基因组及宏转录组技术在土壤微生物生态功能方面的研究具有良好的应用效果,但这些研究仅仅从分
子生态学中微生物功能基因的微观角度来阐述其生态功能,并未结合宏观尺度的碳、氮循环过程,所以,其研
究结果可能与实际状况有所偏差。 如何将分子水平上的功能基因变化与生态系统水平上有机碳分解、氮循环
过程的具体观测数据结合起来分析,如何将微观尺度上的研究结果推绎到宏观尺度是现代生态学发展亟待解
决的问题。 总之,宏基因组和宏转录组技术因其可以结合生物信息学及环境因子进行数据综合分析,能够揭
示微生物与环境之间的生态过程,为从群落结构及生态系统尺度上认识微生物的生态过程与功能开拓了新的
途径。
2.2摇 土壤动物多样性及功能
土壤动物是构成陆地生态系统的重要组成部分,土壤动物协同相关的微生物有机体共同调节着生态系统
的过程和功能,直接或间接影响有机质分解、养分循环、碳获取、植物群落动态及土壤结构维持等过程,近年来
土壤动物生态学研究已经成为生态学、地学领域研究的热点和前沿[47]。 目前土壤动物的研究主要集中在土
壤动物多样性方面的研究。 尽管土壤中存在多种多样的动物种类,但对不同尺度范围内土壤动物多样性的分
布模式及影响因素知之甚少[48]。 这种信息的缺失主要是由于缺乏快速、便利、精确地测定土壤动物多样性方
法[49]。 目前用于土壤动物多样性的研究方法主要是传统的形态学鉴定方法,这种传统方法要求研究者必须
较好地掌握每一种动物类群的特征,而且工作量较大[50];另外,由于不同类群的土壤动物其个体大小及生态
史各不相同,因此提取不同类群的土壤动物往往需要不同的方法,这必然会影响到人们对同一土壤样品中所
有动物种类的鉴别,往往会忽略很多土壤动物类群的识别[49]。
基于 DNA技术的分子生物学方法,如变形梯度凝胶电泳、末端限制性片段长度多态性、及磷脂脂肪酸分
析等,可以快速地从单一土壤样品中鉴别出土壤动物的物种多样性[11,51],如 Huang 等利用标准线粒体细胞色
素 C氧化酶 I(COI)基因区位作为 DNA条形码,对中国 6个属 28个种的蚯蚓种群的基因多样性进行了研究,
结果表明基因序列的种内趋异性通常低于 1%,而种间趋异性高于 15%,认为利用 DNA 条形码技术能够准确
的区分 28个蚯蚓种群类别,同时也可能区分一些未确认边缘种或亚种,是一种蚯蚓种群区分及多样性测定的
重要方法,有效弥补了传统形态学分类方法的不足[52]。 Wu等采用 18S rDNA基因片段作为特异性引物,对土
壤样品中 DNA进行分子扩增及测序,与土壤动物基因库进行对比来鉴别北方森林及极地苔原生态系统中土
壤动物种类及丰富度[11]。 Bienert等利用 DNA元条码与新一代测序技术相结合的方法分析了法国阿尔卑斯
山地生态系统土壤中蚯蚓的物种组成,通过提取 14 种蚯蚓线粒体 DNA(mtDNA)16S 基因,创建 DNA 参照数
据库,设计两个 DNA序列较短(只有 30—70bp)的特异性引物进行 PCR扩增及测序,并认为通过这种土壤中
DNA测定可以区分多种生态系统或样点的蚯蚓群落特征[13]。 Wu 等人通过分析收集到的 17516 个环境 18S
rRNA基因序列,研究了全球 11个不同生物区系和不同纬度的区域中 20 个门土壤动物多样性的分布特征及
影响因素[12]。 与传统的形态学分析相比,环境 DNA 技术可以快速分析土壤动物的多样性及其分布特征,可
以更有效地鉴定到未知的或稀少的物种,因此鉴定土壤动物类群的幅度较宽,同时可以进行时空尺度上的对
比研究。
目前,环境 DNA技术主要用在土壤动物鉴别分类、物种多样性及空间分布方面的研究,而有关土壤动物
生态功能方面的研究很少有报道。 如何借鉴土壤微生物生态功能方面的研究经验来推动土壤动物生态功能
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的研究是未来土壤动物生态学发展的一个重要环节。
3摇 环境 DNA技术在植物多样性及根系生态方面的应用
3.1摇 植物多样性及群落组成
目前,对植物多样性及群落组成的研究完全是基于植物地上部分的数据,依赖于个体植物的生物量、丰
度、以及形态分类鉴定,这种方法往往耗时费力,尤其是在森林生态系统中;而且由于不同植物的生活史不同,
以及植物休眠等因素,在生长季不同时间进行植物多样性测定的结果往往存在较大偏差[53],因此,应用传统
方法进行植物多样性及群落组成调查需要在生长季中进行多次采样,大大增加了工作量。 另外,由于在调查
过程中很容易导致某些物种的遗漏,很难定量化物种入侵早期或灭绝后期的物种定植或灭绝的动态变化
量[54鄄55]。 研究者越来越意识到传统的调查方法对植物多样性及群落组成测定存在的问题。 环境 DNA 技术
可以克服这些问题,土壤中的 DNA信息可以有效补充地上部分的调查数据。 事实上 DNA在土壤中可以存在
较长时间,土壤样品采集不用局限于植物生长季,因此,在野外取样具有较大灵活性,降低了误判的可
能性[17,33]。
近几年,少数国外分子生物家逐渐通过环境 DNA技术对不同生态系统的植物分类及多样性进行了研究。
如 Yoccoz等采用元条码(metabarcoding)方法,从土壤中提取 DNA,用带有标记的 g和 h引物来扩繁质体 DNA
trnL(UAA)内含子,对欧洲 3个气候类型区的植物进行分类,并对植物多样性进行调查,结果发现通过土壤
DNA分析所得到的植物种类和多样性与通过地上部分形态学调查所得到的结果高度一致,这种方法在热带
及温带地区同样有较好的适用性[17]。 而 Hiiesalu通过新一代测序技术(叶绿体 DNA trnL(UAA)内含子的 454
测序)研究草本植物地下植物丰度水平,并与地上部分的丰度相比较,结果发现在区域尺度内,植物地下丰度
可以达到地上部分的两倍,在群落水平上,地下丰度同样超过地上部分;地上部分丰度随土壤肥力增加而下
降,而地下部分所发现的物种数量则随土壤肥力增加而显著增加[33]。 这表明传统的地上部分植物丰度的研
究可能忽略了许多共存的物种,在地上部分丰度下降的条件下,地下丰度研究可能更有意义。 基于 DNA技术
的物种丰度研究方法,改变了人们以往对植物群落多样性模式的理解,将揭示一些与以往地上部分丰度描述
不一样的模式,能够产生有关植物群落结构和功能方面的新想法[16]。
3.2摇 植物根系生态
细根是陆地生态系统中最重要的,也是最难研究的领域[5,56鄄57]。 而不同植物细根的精确识别是根系研究
中最困难的环节。 如何快速有效地区分不同植物的细根,提高细根研究数据的精确性是所有根系生态研究者
所面临的难题。 随着分子生物学的发展,环境 DNA技术开始被研究者用来研究植物根系,应用到根系的鉴定
与识别[58鄄61]。 Bobowski等采用叶绿体 rbcL基因限制性片段长度多态性(RFLP)方法,能够准确区分美国西部
9种木本植物的根系[62]。 Jackson等和 Linder等利用核核糖体 DNA 内转录间隔区(ITS)序列,成功识别了美
国得克萨斯州的 7种木本植物根系[58鄄59],这些研究表明,在根系鉴定与识别研究中,分子生物学技术具有很
大的应用潜力。 目前,已有研究者尝试以环境 DNA 技术来定量化细根的生物量大小,探讨细根空间分布规
律[19]。 如 Ugawa等从土壤中提取 DNA,结合实时 PCR法,发现玉米根系生物量与土壤中 DNA含量之间表现
出极显著的相关性,表明可以采用环境 DNA技术有效测定根系生物量,但会受到土壤类型的限制[21]。 Riley
等也利用实时 PCR方法对土壤中根系的数量进行了定量化研究,该研究认为分子生物学方法比较灵敏,可以
在混合样品中定量化目标样品,能够精确探测到土壤中的低根系含量(根量<2 mg / kg 干土重) [63]。 这种分子
技术为土壤中根系研究提供了新方法,根系 DNA 的定量化分析为植物根系生态功能和生态过程提供了新
视角。
部分研究对根系 DNA的提取方法、提取效果及影响因素进行了探讨。 如 Brunner 等改进了木本植物细
根识别的分子生物学方法,在 DNA 提取过程中,添加 2%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和 5% 聚乙烯聚吡咯烷酮
(PVPP)固定多酚类化合物,然后进行 PCR扩增及分子测序工作,准确快速地鉴定出阿尔卑斯山中 30种树木
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的根系[64];Haling等人采用 3种 DNA提取技术(PowerSoil 襃 0.25 g DNA提取试剂盒;Purdy修改的苯酚提取
法;SARDI分子诊断提供的商业 DNA提取技术)对草本植物根系生物量进行了对比研究,结果表明细根生物
量与土壤 DNA含量之间存在显著的相关性,3种 DNA提取方法都具有较好的提取效果[18]。 在这个研究中,
Haling同时分析了土壤类型、植物材料、净根提取、根系冷藏保存、植物年龄、物种组成、及根系构型等多种因
子对根系 DNA提取的影响。 Fisk等采用叶绿体 trnL内含子的 PCR扩增子(限制性片段长度多态性)研究了
美国北方硬阔叶林中美国山毛榉 ( Fagus grandifolia Ehrh.)、黄桦 ( Betula alleghaniensis Britton)和白蜡
(Fraxinus americana L.)3个树种细根的根群组成,并探讨了根系种类、相对丰度和细根直径对根系 DNA提取
的影响,分析认为该方法可以有效地测定不同树种细根的含量及丰度,但不同树种之间存在差异,混合样品中
根系含量多的物种 DNA回收效率较低,直径<0.3 mm的细根样品中 DNA的回收效率大于直径>0.3 mm的细
根[65]。 Taggart等采用 trnL内含子和 trnT鄄trnL以及 trnL鄄trnF基因间区 3种荧光标记的 PCR扩增子(荧光片段
长度多态性)研究了不同的羊茅草原群落的物种组成,并区分各物种的根系,结果表明叶绿体 trnT鄄trnL 具有
较低扩增成功率,而 trnL内含子和 trnL鄄trnF基因间隔区可以区分超过 80%的物种,也可有效区分 82%的植物
根系[66]。
环境 DNA技术在复杂的根系生态学研究中具有明显的优点。 分子技术能够精确地鉴别单个物种[58],甚
至单个植物的根系[64],特别是针对细根研究。 细根是植物竞争及根系对异质性的土壤环境反应的主体,但却
很难从土壤中分离出来,不同植物种类细根难以用形态学方法进行鉴定与识别。 环境 DNA 技术是直接从土
壤样品中提取根系 DNA,克服了传统方法需要洗根、分根、只能测定单物种根系的局限[64鄄65],可以降低由于洗
根造成细根损失而带来的研究误差。 随着环境 DNA技术的发展,以分子生物学手段定量化研究根系生物量、
根系与环境之间的相互作用规律将是根系生态学新的发展方向。
4摇 环境 DNA技术在地下生态学研究中的应用前景
环境 DNA技术在土壤微生物多样性研究方面相对成熟,许多分子生态学家及微生物学家在土壤微生物
研究中广泛应用环境 DNA技术,但在土壤微生物和土壤动物的生态功能方面、植物地下多样性及根系生态学
研究中的应用相对较弱。 宏基因组和宏转录组技术的发展及应用使土壤生物生态功能的研究成为可能,目
前,有关土壤生物生态功能的研究处于初级探索性阶段,也仅仅通过土壤微生物群落功能基因的变化来初步
预测其功能作用,而并未将功能基因的变化与生态系统水平上的生态过程及功能联系起来。 因此,未来在利
用宏基因组学和宏转录组学进行微生物生态学研究时,有必要充分结合生态学尤其是群落生态学和生态系统
生态学的相关理论和方法,将微观尺度的生态学规律推绎到中观尺度的生态系统,及至宏观尺度的全球生态
系统,这种研究尺度的推绎是分子生态学的研究结论得到普适性应用的关键,也是一个研究难点。 为此,可以
沿着一系列环境梯度,如温度、降水,进行土壤宏基因组学和宏转录组学的调查,有助于揭示环境因子乃至气
候变化对土壤微生物、土壤动物的影响以及地下生物对此做出的响应,从而探讨区域或全球尺度下的生态环
境问题。 在清楚分析宏基因组中碳、氮循环功能基因(如参与甲烷代谢的基因、硝化 /反硝化相关基因)比例
及其变化的基础上,结合生态系统尺度上的碳、氮循环的数量,来探讨土壤微生物、土壤动物在相对宏观尺度
上对碳、氮循环库和流的贡献应该更具有实际意义。
除了植物丰度、多样性及物种组成外,基于 DNA技术的植物地下部分研究还可应用于其它领域,如沿环
境梯度变化物种的分布特征、共存的根系与根际区分、植物群落地下配置规律、植物行为生态,如不同种或不
同基因型植物是否会指示地下根系对向生长或者彼此远离生长,为什么会出现这种行为? 这种方法还可以用
于植物根系的生长状况,如植物根系和根际能延伸多远、能休眠多长时间、哪些物种可以共存? 也可用于研究
植物与微生物竞争土壤养分的研究。 这些领域中有许多无法回答的生态学问题,需要借助分子生物学手段来
进行合理解答。 总之,环境 DNA技术对于以土壤微生物、土壤动物及地下植物根系为主体的地下生态学过程
的研究将具有革命性意义,在对地下生态系统结构和功能等认识和理解过程中将具有十分广阔的应用前景,
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也是对作为“黑箱冶的地下生态系统进行拓展研究的关键技术手段。 相信在未来一段时期内,随着环境 DNA
技术的不断发展与完善,地下生态过程的研究将会取得丰硕的成果。
参考文献(References):
[ 1 ]摇 Wardle D A, Bardgett R D, Klironomos J N, Set覿l覿 H, van der Putten W H, Wall D H. Ecological linkages between aboveground and belowground
biota. Science, 2004, 304(5677): 1629鄄1633.
[ 2 ] 摇 Copley J. Ecology goes underground. Nature, 2000, 406(6795): 452鄄454.
[ 3 ] 摇 Van der Putten W H, Bardgett R D, de Ruiter P C, Hol W H G, Meyer K M, Bezemer T M, Bradford M A, Christensen S, Eppinga M B,
Fukami T, Hemerik L, Molofsky J, Sch覿dler M, Scherber C, Strauss S Y, Vos M, Wardle D A. Empirical and theoretical challenges in
aboveground鄄belowground ecology. Oecologia, 2009, 161(1): 1鄄14.
[ 4 ] 摇 Bardgett R D, Wardle D A. Aboveground鄄belowground linkages: biotic interactions, ecosystem processes, and global change / / Oxford Series in
Ecology and Evolution. Oxford, UK: Oxford University Press, 2010.
[ 5 ] 摇 贺金生, 王政权, 方精云. 全球变化下的地下生态学: 问题与展望. 科学通报, 2004, 49(13): 1226鄄1233.
[ 6 ] 摇 Yoccoz N G. The future of environmental DNA in ecology. Molecular Ecology, 2012, 21(8): 2031鄄2038.
[ 7 ] 摇 Taberlet P, Coissac E, Hajibabaei M, Rieseberg L H. Environmental DNA. Molecular Ecology, 2012, 21(8): 1789鄄1793.
[ 8 ] 摇 Jumpponen A, Jones K L, Blair J. Vertical distribution of fungal communities in tall grass prairie soil. Mycologia, 2010, 102(5): 1027鄄1041.
[ 9 ] 摇 Rousk J, B覽覽th E, Brookes P C, Lauber C L, Lozupone C, Caporaso J G, Knight R, Fierer N. Soil bacterial and fungal communities across a pH
gradient in an arable soil. The ISME Journal, 2010, 4: 1340鄄1351.
[10] 摇 Nacke H, Thurmer A, Wollherr A, Will C, Hodac L, Herold N, Sch觟ning I, Schrumpf M, Daniel R. Pyrosequencing鄄based assessment of
bacterial community structure along different management types in German forest and grassland soils. PLoS ONE, 2011, 6: e17000.
[11] 摇 Wu T H, Ayres E, Li G, Bardgett R D, Wall D H, Garey J R. Molecular profiling of soil animal diversity in natural ecosystems: Incongruence of
molecular and morphological results. Soil Biology and Biochemistry, 2009, 41(4): 849鄄857.
[12] 摇 Wu T H, Ayres E, Bardgett R D, Wall D H, Garey J R. Molecular study of worldwide distribution and diversity of soil animals. Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America, 2011, 108(43): 17720鄄17725.
[13] 摇 Bienert F, De Danieli S, Miquel C, Coissac E, Poillot C, Brun J J, Taberlet P. Tracking earthworm communities from soil DNA. Molecular
Ecology, 2012, 21(8): 2017鄄2030.
[14] 摇 Mommer L, Wagemaker C A M, de Kroon H, Ouburg N J. Unravelling below鄄ground plant distributions: a real鄄time polymerase chain reaction
method for quantifying species proportions in mixed root samples. Molecular Ecology Resources, 2008, 8(5): 947鄄953.
[15] 摇 Kesanakurti P R, Fazekas A J, Burgess K S, Percy D M, Newmaster S G, Graham S W, Barrett S C H, Hajibabaei M, Husband B C. Spatial
patterns of plant diversity below鄄ground as revealed by DNA barcoding. Molecular Ecology, 2011, 20(6): 1289鄄1302.
[16] 摇 P覿rtel M, Hiiesalu I, 魻pik M, Wilson S D. Below鄄ground plant species richness: new insights from DNA鄄based methods. Functional Ecology,
2012, 26(4): 775鄄782.
[17] 摇 Yoccoz N G, Brathen K A, Gielly L, Haile J, Edwards M E, Goslar T, Von Stedingk H, Brysting A K, Coissac E, Pompanon F, S覬nsteb覬 J H,
Miquel C, Valentini A, De Bello F, Chave J, Thuiller W, Wincker P, Cruaud C, Gavory F, Rasmussen M, Gilbert M T P, Orlando L,
Brochmann C, Willerslev E, Taberlet P. DNA from soil mirrors plant taxonomic and growth form diversity. Molecular Ecology, 2012, 21(15):
3647鄄3655.
[18] 摇 Haling R E, Simpson R J, McKay A C, Hartley D, Lambers H, Ophel鄄Keller K, Wiebkin S, Herdina, Riley I T, Richardson A E. Direct
measurement of roots in soil for single and mixed species using a quantitative DNA鄄based method. Plant and Soil, 2011, 348(1 / 2): 123鄄137.
[19] 摇 Jones F A, Erickson D L, Bernal M A, Bermingham E, Kress W J, Herre E A, Muller鄄Landau H C, Turner B L. The roots of diversity: below
ground species richness and rooting distributions in a tropical forest revealed by DNA barcodes and inverse modeling. PLoS ONE, 2011, 6
(9): e24506.
[20] 摇 Mommer L, Dumbrell A J, Wagemaker C A M, Ouborg N J. Belowground DNA鄄based techniques: untangling the network of plant root interactions.
Plant and Soil, 2011, 348(1 / 2): 115鄄121.
[21] 摇 Ugawa S, Yamaguchi M, Miura S, Kaneko S. A method for obtaining the relationship between the amount of DNA and the fine root weight from
mixtures of fine roots and soil particles. Soil Science and Plant Nutrition, 2012, 58(4): 510鄄516.
[22] 摇 Levy鄄Booth D J, Campbell R G, Gulden R H, Hart M M, Powell J R, Klironomos J N, Pauls K P, Swanton C J, Trevors J T, Dunfield K E.
Cycling of extracellular DNA in the soil environment. Soil Biology and Biochemistry, 2007, 39(12): 2977鄄2991.
[23] 摇 Pietramellara G, Ascher J, Borgogni F, Ceccherini M T, Guerri G, Nannipieri P. Extracellular DNA in soil and sediment: fate and ecological
4794 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 35卷摇
http: / / www.ecologica.cn
relevance. Biology and Fertility of Soils, 2009, 45(3): 219鄄235.
[24] 摇 Ogram A, Sayler G S, Barkay T. The extraction and purification of microbial DNA from sediments. Journal of Microbiological Methods, 1987, 7(2 /
3): 57鄄66.
[25] 摇 Rondon M R, August P R, Bettermann A D, Brady S F, Grossman T H, Liles M R, Loiacono K A, Lynch B A, MacNeil I A, Minor C, Tiong C
L, Gilman M, Osburne M S, Clardy J, Handelsman J, Goodman R M. Cloning the soil metagenome: a strategy for accessing the genetic and
functional diversity of uncultured microorganisms. Applied and Environmental Microbiology, 2000, 66(6): 2541鄄2547.
[26] 摇 Handelsman J. Metagenomics: application of genomics to uncultured microorganisms. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2004, 68(4):
669鄄685.
[27] 摇 Ficetola G F, Miaud C, Pompanon F, Taberlet P. Species detection using environmental DNA from water samples. Biology Letters, 2008, 4(4):
423鄄425.
[28] 摇 Haile J, Froese D G, MacPhee R D E, Roberts R G, Arnold L J, Reyes A V, Rasmussen M, Nielsen R, Brook B W, Robinson S, Demuro M,
Gilbert M T P, Munch K, Austin J J, Cooper A, Barnes I, M觟ller P, Willerslev E. Ancient DNA reveals late survival of mammoth and horse in
interior Alaska. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2009, 106(52): 22352鄄22357.
[29] 摇 Gao D, Tao Y. Current molecular biologic techniques for characterizing environmental microbial community. Frontiers of Environmental Science &
Engineering, 2011, 6(1): 82鄄97.
[30] 摇 Epp LS, Boessenkool S, Bellemain E P, Haile J, Esposito A, Riaz T, Ers佴us C, Gusarov V I, Edwards M E, Johnsen A, Sten覬ien H K, Hassel
K, Kauserud H, Yoccoz N G, Br覽then K A, Willerslev E, Taberlet P, Coissac E, Brochmann C. New environmental metabarcodes for analysing
soil DNA: potential for studying past and present ecosystems. Molecular Ecology, 2012, 21(8): 1821鄄1833.
[31] 摇 Shokralla S, Spall J L, Gibson J F, Hajibabaei M. Next鄄generation sequencing technologies for environmental DNA research. Molecular Ecology,
2012, 21(8): 1794鄄1805.
[32] 摇 Riesenfeld C S, Schloss P D, Handelsman J. Metagenomics: genomic analysis of microbial communities. Annual Review of Genetics, 2004, 38:
525鄄552.
[33] 摇 Harrison N, Kidner C A. Next鄄generation sequencing and systematics: what can a billion base pairs of DNA sequence data do for you? Taxon,
2011, 60(6): 1552鄄1566.
[34] 摇 Hiiesalu I, Opik M, Metsis M, Lilje L, Davison J, Vasar M, Moora M, Zobel M, Wilson S D, P覿rtel M. Plant species richness belowground:
higher richness and new patterns revealed by next鄄generation sequencing. Molecular Ecology, 2012, 21(8): 2004鄄2016.
[35] 摇 Cowan D A. Microbial genomes鄄the untapped resource. Trends in Biotechnology, 2000, 18(1): 14鄄16.
[36] 摇 Torsvik V, Ovreas L, Thingstad T F. Prokaryotic diversity鄄magnitude, dynamics, and controlling factors. Science, 2002, 296(5570): 1064鄄1066.
[37] 摇 He J Z, Xu Z H, Hughes J. Molecular bacterial diversity of a forest soil under residue management regimes in subtropical Australia. FEMS
Microbiology Ecology, 2006, 55(1): 38鄄47.
[38] 摇 He J Z, Xu Z H, Hughes J. Analyses of soil fungal communities in adjacent natural forest and hoop pine plantation ecosystems of subtropical
Australia using molecular approaches based on 18S rRNA genes. FEMS Microbiology Letters, 2005, 247(1): 91鄄100.
[39] 摇 Bu佴e M, Reich M, Murat C, Morin E, Nilsson R H, Uroz S, Martin F. 454 Pyrosequencing analyses of forest soils reveal an unexpectedly high
fungal diversity. New Phytologist, 2009, 184(2): 449鄄456.
[40] 摇 Blaalid R, Carlsen T, Kumar S, Halvorsen R, Ugland K I, Fontana G, Kauserud H. Changes in the root鄄associated fungal communities along a
primary succession gradient analysed by 454 pyrosequencing. Molecular Ecology, 2012, 21(8): 1897鄄1908.
[41] 摇 Zhou J Z, Xue K, Xie J P, Deng Y, Wu L Y, Cheng X L., Fei S F, Deng S P, He Z L, Van Nostrand J D, Luo Y Q. Microbial mediation of
carbon鄄cycle feedbacks to climate warming. Nature Climate Change, 2012, 2(2): 106鄄110.
[42] 摇 He Z L, Xu M Y, Deng Y, Kang S D, Kellogg L, Wu L Y, van Nostrand J D, Hobbie S E, Reich P B, Zhou J. Metagenomic analysis reveals a
marked divergence in the structure of belowground microbial communities at elevated CO2 . Ecology Letters, 2010, 13(5): 564鄄575.
[43] 摇 Mackelprang R, Waldrop M P, DeAngelis K M, David M M, Chavarria K L, Blazewicz S J, Rubin E M, Jansson J K. Metagenomic analysis of a
permafrost microbial community reveals a rapid response to thaw. Nature, 2011, 480(7377): 368鄄371.
[44] 摇 Warneckea F, Hess M. A perspective: Metatranscriptomics as a tool for the discovery of novel biocatalysts. Journal of Biotechnology, 2009, 142
(1): 91鄄95.
[45] 摇 Urich T, Lanz佴n A, Qi J, Huson D H, Schleper C, Schuster S C. Simultaneous assessment of soil microbial community structure and function
through analysis of the meta鄄transcriptome. PLoS One, 2008, 3(6): e2527.
[46] 摇 Leininger S, Urich T, Schloter M, Schwark L, Qi J, Nicol G W, Prosser J I, Schuster S C, Schleper C. Archaea predominate among ammonia鄄
oxidizing prokaryotes in soils. Nature, 2006, 442(7104): 806鄄809.
[47] 摇 Fu S L, Zou X M, Coleman D. Highlights and perspectives of soil biology and ecology research in China. Soil Biology and Biochemistry, 2009, 41
5794摇 15期 摇 摇 摇 于水强摇 等:环境 DNA技术在地下生态学中的应用 摇
http: / / www.ecologica.cn
(5): 868鄄876.
[48] 摇 Ettema C H, Wardle D A. Spatial soil ecology. Trends in Ecology and Evolution, 2002, 17(4): 177鄄183.
[49] 摇 Behan鄄Pelletier V, Newton G. Linking soil biodiversity and ecosystem function: the taxonomic dilemma. BioScience, 1999, 49(2): 149鄄153.
[50] 摇 St John M G, Wall D H, Hunt H W. Are soil mite assemblages structured by the identity of native and invasive alien grasses? Ecology, 2006, 87
(5): 1314鄄1324.
[51] 摇 O忆Brien H E, Parrent J L, Jackson J A, Moncalvo J, Vilgalys R. Fungal community analysis by large鄄scale sequencing of environmental samples.
Applied and Environmental Microbiology, 2005, 71(9): 5544鄄5550.
[52] 摇 Huang J, Xu Q, Sun Z J, Tang G L, Su Z Y. Identifying earthworms through DNA barcodes. Pedobiologia, 2007, 51(4): 301鄄309.
[53] 摇 夏富才, 潘春芳, 赵秀海, 何海燕, 周海城. 长白山原始阔叶红松林林下草本植物多样性格局及其影响因素. 西北植物学报, 2012, 32
(2): 370鄄376.
[54] 摇 Chabrerie O, Verheyen K, Saguez R, Decocq G. Disentangling relationships between habitat conditions, disturbance history, plant diversity, and
American blackcherry (Prunus serotina Ehrh.) invasion in a European temperate forest. Diversity and Distributions, 2008, 14(2): 204鄄212.
[55] 摇 Chen G K, Kery M, Zhang J L, Ma K P. Factors affecting detection probability in plant distribution studies. Journal of Ecology, 2009, 97(6):
1383鄄1389.
[56] 摇 Eissenstat D M, Yanai R D. Root life span, efficiency, and turnover / / Waisel Y, Eshel E, Kafkafi U. Plant Roots, the Hidden Half. 3rd ed. New
York: CRC Press, 2002: 221鄄238.
[57] 摇 王政权, 郭大立. 根系生态学. 植物生态学报, 2008, 32(6): 1213鄄1216.
[58] 摇 Jackson R B, Moore L A, Hoffmann W A, Pockman W T, Linder C R. Ecosystem rooting depth determined with caves and DNA. Proceedings of
the National Academy of Sciences of the United States of America, 1999, 96(20): 11387鄄11392.
[59] 摇 Linder C R, Moore L A, Jackson R B. A universal molecular method for identifying underground plant parts to species. Molecular Ecology, 2000, 9
(10): 1549鄄1559.
[60] 摇 Moore L A, Field C B. A technique for identifying the roots of different species in mixed samples using nuclear ribosomal DNA. Journal of
Vegetation Science, 2005, 16(1): 131鄄134.
[61] 摇 Roumet C, Picon鄄Cochard C, Dawson L A, Joffre R, Mayes R, Blanchard A, Brewer M J. Quantifying species composition in root mixtures using
two methods: near infrared reflectance spectroscopy and plant wax markers. New Phytologist, 2006, 170(3): 631鄄638.
[62] 摇 Bobowski B R, Hole D, Wolf P G, Bryant L. Identi覱cation of roots of woody species using polymerase chain reaction ( PCR) and restriction
fragment length polymorphism (RFLP) analysis. Molecular Ecology, 1999, 8(3): 485鄄491.
[63] 摇 Riley I T, Wiebkin S, Hartley D, McKay A C. Quantification of roots and seeds in soil with real鄄time PCR. Plant and Soil, 2010, 331(1 / 2):
151鄄163.
[64] 摇 Brunner I, Brodbeck S, Buchler U, Sperisen C. Molecular identi覱cation of 覱ne roots of trees from the Alps: reliable and fast DNA extraction and
PCR鄄RFLP analyses of plastid DNA. Molecular Ecology, 2001, 10(8): 2079鄄2087.
[65] 摇 Fisk M C, Yanai R D, Fierer N. A molecular approach to quantify root community composition in a northern hardwood forest鄄testing effects of root
species, relative abundance, and diameter. Canadian Journal of Forest Research, 2010, 40(4): 836鄄841.
[66] 摇 Taggart J M, Cahill J F Jr, McNickle G G, Hall J C. Molecular identification of roots from a grassland community using size differences in
fluorescently labelled PCR amplicons of three cpDNA regions. Molecular Ecology Resources, 2011, 11(1): 185鄄195.
6794 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 35卷摇