全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第2期
收稿日期 ：2012-08-09
基金项目 ：转基因生物新品种培育重大专项（2009ZX08012-017B），国家自然科学基金项目（31271649）
作者简介 ：张坤，男，研究方向 ：转基因作物检测 ；E-mail: zhkun_lc@126.com
通讯作者 ：南铁贵，男，博士后，研究方向 ：酶免疫技术在作物科学中的应用 ；E-mail: nantiegui@163.com
现代生物工程技术可以将外源基因导入并稳定
整合于植物体基因组，使其定向遗传。运用该技术，
近几十年来转基因作物在全球范围内飞速发展［1，2］。
来源于苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）
的 cry 基因作为其中的代表性基因，可表达晶体毒
蛋白，对鳞翅目、双翅目、鞘翅目、膜翅目等多种
昆虫和线虫均有独特的杀虫活性。目前，该基因已
经成功转入玉米、棉花、水稻等主要作物，转基因
抗虫玉米和抗虫棉在世界各地普遍种植。转 Bt 基因
作物降低生产成本，提高单位面积产量，其优点不
高温处理对转基因作物种子 Bt 蛋白含量的影响
张坤  谭桂玉  王保民  南铁贵
（中国农业大学农学与生物技术学院，北京 100193）
摘 要 ： 转基因作物食品安全问题日益受到社会关注，作物种子作为食物的重要来源之一，转基因作物种子的安全性研究
更有待加强。分别利用转 Bt 基因棉花和玉米品种及非转基因品种种子进行高温处理（55-130℃），并用双抗夹心酶免疫检测方法
（ELISA）研究其中的外源 Bt 蛋白的动态变化过程。结果表明，不同作物种子中的 Bt 蛋白对高温的耐受程度不同，棉花种子中 Bt
蛋白较玉米种子耐高温能力强 ；高温处理条件下，种子中的 Bt 蛋白在 10 min 内含量显著下降，其后降解缓慢 ；130℃以上的高温
处理条件下，玉米和棉花种子中的外源 Bt 蛋白均能显著降解。
关键词 ： 高温 Bt 蛋白 种子 双抗夹心酶联免疫吸附检测方法
Impact of High Temperature Treatment on the Content of Bt Protein in
Genetically Modified Crop Seeds
Zhang Kun Tan Guiyu Wang Baomin Nan Tiegui
（College of Agricultural and Biotechnology，China Agricultural University，Beijing 100193）
Abstract:  Food safety problem of genetically modified crops have aroused public concern day by day. As crop seed is one of the most
important source of food, the research on safety of genetically modified crop seeds need to be strengthened. The present work applied cotton and
corn seeds, Bt modified varieties and non-genetically modified varieties, to treat with high temperature（55-130℃）, and then detected the dyna-
mic digestion process of Bt protein with sandwich enzyme link immunoassay（ELISA）. The result of the assay showed that the Bt protein in
different crops have different degree of tolerance to high temperature. The capacity of enduring heat stress of Bt protein in cotton seed is better
than that in corn seed ；the toxin protein significantly decreased within 10 min in the high temperature treatment, followed by slow degradation ；
all Bt protein in transgenic corn and cotton seeds can obviously inactivation treated with 130℃ or higher temperature.
Key words:  High temperature Bt protein Seed Sandwich enzyme link immunoassay
言而喻，但抗虫转基因作物及其产品的环境安全性
和食品安全性也越来越受到社会的广泛关注。虽然
研究人员认为 Bt 蛋白只有在昆虫肠道碱性环境下才
能加工成有杀虫活性的蛋白，与昆虫肠道细胞表面
受体结合，造成昆虫肠道穿孔［3］。人畜胃环境为酸性，
肠道细胞表面不含杀虫蛋白受体，因此转 Bt 基因作
物对人畜是安全的，但大量应用的转基因作物中 Bt
蛋白对人畜的长期影响仍时有争议。
作物种子，如玉米、棉花、水稻等，是人类粮
食及油料的最主要来源之一。现今转基因作物的广
2013年第2期 77张坤等 ：高温处理对转基因作物种子 Bt 蛋白含量的影响
泛种植，使转基因作物种子不免进入日常饮食，转
基因作物的食品安全引起社会关注［4，5］。虽然这些
作物种子中所含的 Bt 蛋白在食物加工过程中产生降
解，但目前这一方面的研究仍鲜见报道。本研究模
拟热加工处理温度，检测玉米、棉花种子在高温处
理条件下，所含 Bt 蛋白的变化情况，以期为解决转
基因食品安全争论提供试验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 对照常规棉品种“辽棉 18”由河
间市国欣农研会赠送 ；转 Bt 杂交抗虫棉品种“鄂杂
棉 10”及“鄂杂棉 29”的 F1 代种子由湖北省农牧
业厅提供。对照常规玉米品种“郑 58”及其杂交转
Bt 基因抗虫玉米品种（研究阶段）由中国农业大学
农学院化控中心提供。
1.1.2 化学试剂 Bt 蛋白检测所需抗 Bt 蛋白兔多克
隆抗体（pAb）［6］、辣根过氧化物酶标记鼠单克隆
抗体（HPR-mAb）［7］、Bt 标准蛋白均由中国农业大
学农学院化控中心提供，标准蛋白稀释至浓度 100、
50、25、12.5、6.25、3.125、1.625 和 0 ng/mL 作为标
准浓度 ；TMB 显色溶液购自美国 Sigma 公司。
1.2 方法
1.2.1 棉花种子处理 取棉籽去种皮（种子内种皮
及其以内部分未受损伤）于烘箱中进行高温处理，
处理温度为 70℃、85℃、100℃、115℃、130℃，各
于 5、10、15、20、30、40、50 和 60 min 时取样并
即刻研磨成粉，称取棉花种子粉末 0.1 g，用 2 mL
Na2HPO4-KH2PO4 缓冲液［0.1 mol/L，pH7.5，含 1%
（W/V）的 NaCl 和 0.1%（V/V）吐温 -20，PBST］在
4℃提取过夜。提取液 5 000 r/min、4℃离心取上清，
即为 Bt 蛋白待测液。每处理 3 个重复。
1.2.2 玉米种子处理 玉 米 种 子 分 别 置 于 55℃、
70℃、85℃、100℃、115℃、130℃进行热处理，取
样间隔时间及后续 Bt 蛋白提取方法同 1.2.1。所取玉
米种子粉末重量为 0.2 g。
1.2.3 Bt 蛋白含量测定 热处理后，棉花及玉米种
子提取液按如下步骤检测 Bt 蛋白 ：（1）用 Na2CO3-
NaHCO3 缓 冲 液（0.05 mol/L，pH9.6） 将 抗 Bt 蛋 白
兔多克隆抗体稀释到工作浓度后加入酶标板，每孔
100 μL。酶标板放入湿盒并置于 37℃培养箱温育 3
h ；（2）温育完成，将酶标板从培养箱中取出，弃
去孔内液体后每孔加入 150 μL PBST，在常温放置 1
min，弃去 PBST，重复 4 次，将板内残留 PBST 在
吸水纸上甩干 ；（3）在酶标板中分别加入 50 μL 玉
米、棉花 Bt 蛋白待测液、各浓度标准溶液，均做 3
个 重 复 ；（4） 将 Bt HRP-mAb 用 PBST（ 含 0.1% 明
胶）稀释至工作浓度后加入步骤（3）酶标板孔中，
每孔 50 μL，将酶标板放入湿盒中 37℃温育 1 h ；（5）
同步骤（2）；（6）在酶标板内加入 TMB 显色液，每
孔 100 μL，放入湿盒并于 37℃下显色 15 min ；（7）
显色结束后每孔加入 100 μL 1 mol/L 盐酸终止酶反
应 ；（8）450 nm 下测定酶标板各孔的 OD 值 ；（9）
对标准样品的浓度和相应的 OD 值分别取自然对数
后绘制标准曲线，并根据标准曲线计算待测样品中
Bt 蛋白的含量。
1.2.4 统计分析 原始数据用 Excel 2007 软件进行
标准曲线建立，用 SPSS 17.0 软件进行方差分析。
2 结果
2.1 高温处理对转基因棉花种子Bt蛋白含量的影响
依据转基因植物及其产品成分检测抗虫转 Bt 基
因棉花外源蛋白表达量检测技术规范（农业部 1485
号公告），采用 ELISA 试剂盒检测作物种子中外源
Bt 蛋白的含量。检测结果（图 1 -A）表明，棉花阴
性样品在常温和 130℃高温处理条件下，Bt 蛋白的
检测结果无差异，证明所用方法不受杂蛋白影响，
可特异性地检测 Bt 蛋白。转基因棉花种子中 Bt 蛋
白含量随高温处理时间变化趋势，如图 1-B、图 1-C
所示。高温处理最初的 10 min 为含量迅速变化期，
Bt 蛋白含量显著下降。10 min 后含量变化趋于缓和，
曲线进入平台期。随着处理温度的升高，棉籽外源
Bt 蛋白含量在迅速变化期下降速率越快，在平台期
的蛋白含量越低。棉花种子内的 Bt 蛋白含量随着温
度的升高被降解的速度增快被降解量增大。
2.2 高温处理对转基因玉米种子Bt蛋白含量的影响
如图 2 所示，玉米阴性样品在常温和高温处理
条件下，Bt 蛋白的检测结果无差异，证明所用方法
可应用于转基因玉米种子 Bt 外源蛋白的特异性检
测。转基因玉米种子 Bt 蛋白含量随高温处理时间变
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第2期78
化趋势与棉花种子相似，含量变化先为迅速变化期，
其后为平缓期，迅速变化期随温度变化时间长度不
同。随着温度的升高，玉米种子 Bt 蛋白含量被降解
速度增快被降解量增大。
0
200
400
600
800
1000
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1400
1600
1800
0 5 10 15 20 30 40 50 60
RT 130ć
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RT
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RT
B
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ᰦ䰤min ᰦ䰤min ᰦ䰤min
B
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70ć
100ć
130ć115ć 130ć
100ć85ć
B
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ⲭਜ਼
䟿n
g/
g
A B C
A ：阴性种子 ；B ：鄂杂棉 10 号 ；C ：鄂杂棉 29 号
图 1 棉花种子在高温处理条件下 Bt 蛋白含量的变化
0
10
20
30
40
50
60
0 5 10 15 20 30 40 50 60
RT
0
10
20
30
40
50
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0 5 10 15 20 30 40 50 60
RT
B
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B
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ᰦ䰤min ᰦ䰤min
130ć
85ć
130ć
55ć
100ć 70ć115ć
A B
3 讨论
3.1 高温处理棉花和玉米Bt蛋白含量变化比较
已有的文献报道中［8-10］，关于高温对 Bt 蛋白的
影响均以生长期叶片为材料，研究 40℃左右高温对
Bt 蛋白的作用，本研究弥补了高温对种子内 Bt 蛋白
影响的研究空白。从本研究结果可看出，在一定高
温条件下，棉花和玉米种子中的 Bt 蛋白在短时间处
理时间内均迅速下降至平台期。平台期种子在修复
机制作用下，贮藏蛋白降解不再显著。棉花种子内
Bt 蛋白含量变化与玉米相比较，70℃处理 10 min 时，
玉米种子中的 Bt 蛋白含量开始逐渐下降，而棉花种
A ：阴性种子 ；B ：转基因种子
图 2 玉米种子在高温处理条件下 Bt 蛋白含量的变化
子 Bt 蛋白含量无显著变化 ；85℃处理 10 min 时，玉
米种子中的 Bt 蛋白含量降解至原含量一半，而棉花
种子 100-115℃处理 10 min 时其 Bt 蛋白被降解至原
含量一半 ；在 130℃处理时，棉花和玉米种子中的
Bt 蛋白含量均迅速下降，并大量降解，处理 10 min
后，玉米种子的 Bt 蛋白含量几乎与本底持平，而棉
花种子仍可检测到少量 Bt 蛋白。玉米种子 Bt 蛋白
对高温的耐受程度较棉花种子弱，降解速度较平缓。
这些现象与两种作物种子的组成成分不同有关。棉
花种子富含油分，其耐高温能力较淀粉类种子及蛋
白类种子强，但油分不易散热，使种子内部迅速达
2013年第2期 79张坤等 ：高温处理对转基因作物种子 Bt 蛋白含量的影响
到高温，导致 Bt 蛋白失活 ；不同品种的棉花由于种
子成分含量不同，降解程度存在差异，但总体变化
趋势一致。
3.2 种子Bt蛋白含量与食品加工
根据上述试验结果，可推测在食品加工时，榨
油原料需经历 130℃左右的高温长时间烘烤［11，12］，
同时施以高压，种子内的 Bt 蛋白在成油后已大量减
少。而后煎炒等加工，温度远高于 130℃，Bt 蛋白
彻底降解。水煮加工温度持续 100℃，淀粉类、蛋
白类种子中 Bt 蛋白可显著降解，但油料种子中仍有
Bt 蛋白。煎炸烘烤等加工，温度均高于 130℃，持
续一段时间后，可使种子内的 Bt 蛋白完全降解。冷
加工或不加工的转基因种子，缺乏热处理过程，若
不采用其他的处理方法，其内 Bt 蛋白含量不减少。
4 结论
转基因作物种子经高温处理，所含 Bt 蛋白可显
著降低。在降解过程中，会出现一个迅速下降期，
而后蛋白降解缓慢，进入平台期。随着处理温度升
高，平台期所含的 Bt 蛋白降低。种子成分的不同，
所含 Bt 蛋白对高温的耐受程度不同。油料种子中
的 Bt 蛋白对高温的耐受强度高于淀粉类种子。在
130℃以上温度处理，种子 Bt 蛋白几乎完全降解。
水煮温度为 100℃，Bt 蛋白在短时间内无法全部降
解。而冷加工或不加工食品，需要通过其他方式减
少 Bt 蛋白的摄入。
参 考 文 献
［1］ 何礼健 , 周玉婷 , 左停 . 转基因生物技术在农业领域的发展现
状分析［J］. 安徽农业科学 , 2011, 39（1）：66-68.
［2］ 吴俊彦 . 美国转基因作物发展动态综述 . 黑龙江农业科学［J］.
2012（2）：21-23.
［3］ 许文涛 , 贺晓云 , 黄昆仑 , 罗云波 . 转基因植物的食品安全性问
题及评价策略［J］. 生命科学 , 2011, 23（2）：179-185.
［4］ 王春玲 , Hammond B. 转基因抗虫作物中苏云金芽孢杆菌 Cry
蛋白的食品安全问题［J］. 生物技术进展 , 2011, 1（4）：235-
241.
［5］ 吴维成 . 消费者对转基因食品的认知情况及消费态度调查分
析［J］. 西南民族大学学报 , 2011, 37（5）：771-775.
［6］ 王保民 , 何钟佩 , 赵继勋 . 抗虫棉 Bt 杀虫晶体蛋白免疫检测方
法的研究［J］. 棉花学报 , 1998, 10（4）：220-221.
［7］ 王保民 , 何钟佩 , 田晓莉 . 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白 Cry1A
单克隆抗体的制备及在转 Bt 基因棉毒蛋白检测上的应用［J］.
棉花学报 , 2000, 12（1）：34-39.
［8］ 周桂生 , 封超年 , 周青 , 等 . 高温胁迫对 Bt 转基因棉叶片毒蛋
白含量的影响［J］. 扬州大学学报 , 2003, 24（4）：75-77.
［9］ Chen DH, Ye GY, Yang CQ, et al. The effect of high temperature on
the insecticidal properties of Bt cotton. Environmental and Experi-
mental Botany, 2005, 53（3）：333-342.
［10］ 王保民 , 李召虎 , 李斌 , 等 . 转 Bt 抗虫棉各器官毒蛋白的含量
及表达［J］. 农业生物技术学报 , 2002, 10（3）：215-219.
［11］ 魏荣光 . 一次压榨法制取棉籽油存在的问题初探［J］. 中国
棉花加工 , 1992, 5 ：20-23.
［12］ 黄炳权 , 张秀玲 . 玉米半湿法提胚及制取玉米油工艺技术［J］.
粮食与食品工业 , 2004, 11（3）：15-18, 54.
（责任编辑 李楠）