全 文 ：·研究报告· 2011年第12期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
收稿日期 : 2011-05-09
基金项目 : 上海市优秀学科带头人项目（08XD1403700），上海市国际合作项目（08540702600），上海市水生生物重点学科资助项目（S30701）
作者简介 : 胡乐琴，女，博士研究生，副教授，研究方向：赤潮藻毒素；E-mail:yqhu@shou.edu.cn
通讯作者 : 何培民，男，博士，教授，研究方向：海藻生物技术，分子生物学，海洋生物学和活性物质；E-mail: pmhe@shou.edu.cn
前沟藻 18S rDNA 序列克隆和分子鉴定分析
胡乐琴 唐晨 汪卿 陈霁升 何培民
（上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306）

摘 要: 旨在扩增一株未知微藻 18S rDNA，并进行序列分析和物种鉴定分析。提取该微藻总 DNA，用 PCR 技术扩增其
18S rDNA，对序列进行测序，在 GenBank 进行序列比对分析，用 Clustal X 软件构建进化树 ；用光学显微镜进行形态学分析。经
测序其序列长度为 1 736 bp，G+C 为 47% ；同源性分析表明，与 GenBank 中多个强壮前沟藻种的 18S rDNA 基因序列同源性达
99％ ；与前沟藻属的其它藻种同源性均达 95％以上。而与裸甲藻属和环藻属的藻株同源性为 85% 左右。经光学显微镜观察，该藻
具有典型的强壮前沟藻形态。结合该藻 18S rDNA 序列分析和粗略的形态学分析，推断该藻可能为前沟藻属的强壮前沟藻。微藻
形体微小，结构简单，需借助电子显微镜才可准确地从形态学上鉴定其种属，鉴定工作繁琐费时 ；而利用分子技术，则可能使鉴
定工作变得简单快捷。
关键词: 赤潮藻 前沟藻 18S rDNA 分子鉴定 同源性分析
Cloning of 18S rDNA of an Amphidinium sp. and
Molecular Identifying Analysis
Hu Leqin Tang Chen Wang Qing Chen Jisheng He Peimin
（College of Aqua-life Science & Technology，Shanghai Fisheries University，Shanghai 201306）
Abstract: DNA extraction of red tide-forming causative species Amphidinium sp. was performed. PCR technology was used to amplify
18S rDNA. The result of amplification indicated that the length of PCR productions of Amphidinium sp. was 1 736 bp，G+C was 47%.Then，
homology analysis was performed using BLAST in NCBI，and the result indicated that the fragment of 18S rDNA of Amphidinium sp. we
cloned had a high homology（99%）with that of Amphidinium carterae，95% homology with any other Amphidinium sp. in GenBank，85%
homology with Gymnodinium and Prorocentrum. There was no distinct homology with human genomic and mouse genomic. The results show that，
18S rDNA was an effective method for rapid identification of genus，while not quite sure for the species identification.
Key words: Red tide Amphidinium sp. 18S rDNA Identification Homology analysis
近年来，中国沿海地区经常遭受赤潮灾害的困
扰，危害海洋生态，甚至危害到人类身体健康和生
命安全，已经成为中国沿海地区主要海洋生态灾害
之一。我国在赤潮预防监测和治理方面投入了大量
的人力、财力，对赤潮做了大量的研究工作 [1-5]。
对赤潮的监测是了解赤潮发生的基础，赤潮监
测大多采用传统的形态分类学技术，如显微镜等，
但由于赤潮生物（藻）形态的相似性和复杂性，使
传统检测方法在实际应用中存在困难。分子探针技
术具有快速、准确、专一性强等特点，特别是在混
合体中鉴别不占优势的种或者有大量背景噪音干扰
情况下，分子探针技术优势尤显突出。核糖体 RNA
基因（rDNA）是生物体内最保守的基因之一，为一
类中度重复序列，以串联多拷贝的形式存在于细胞
核内染色体 DNA 中，每个重复单位由非转录间隔区
（NTS）、内部转录间隔区（ITS）和 3 种核糖体基因
编码区（18S、5.8S 和 28S）组成。编码区内可分为
高度保守区、保守区、可变区和高度可变区，这些
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不同的区域在种系发生，物种亲缘关系探讨及鉴定
研究中得到了广泛应用。其中 18S rDNA 已经被多次
用于藻类的鉴定研究中 [6-9]。
本试验扩增出实验室一株未知名的前沟藻 18S
rDNA，通过对其序列进行分析，与 GenBank 中已知
序列的对比，结合其形态学特征，初步鉴定其种类，
探讨利用 18S rDNA 快速鉴定赤潮藻种属的可行性。
1 材料与方法
1.1 材料
试验藻种取自上海海洋大学藻类实验室。用
0.45 μL 的滤膜过滤海水煮沸后配成 f/2 培养基，在
5 000 Lx 光强，L D=12 12 的光周期，光照时间：6：
00-18 ：00，以及 22℃的温度下于上海水产大学藻
种培养室中进行纯培养。
1.2 方法
1.2.1 基 因 组 DNA 的 提 取 总 DNA 的 提 取 参 照
CTAB 法 [5] 并 经 过 一 定 的 改 良。 取 新 鲜 藻 体 于
10 000 r/min 离心 5 min，得到藻体为 20 mg 左右。
加入 200 mL 的悬浮缓冲液（Tris-HCl，50 mmo1/L；
EDTA，50 mmol/L pH8.0） 悬 浮， 再 移 入 1.5 mL
eppendorf 管中，加入预热至 55℃的裂解缓冲液（3%
（w/v）CTAB，1%（w/v）sarkosyl，20 mmol/L EDTA，
1.4 mol/L NaCl，0.1 moI/L Tris-HCl pH8.0，1%（v/
v）2-mercaptoethano）， 充 分 震 荡 摇 匀，55 ℃ 温 育
90 min，期间每间隔一段时间混匀一次 ；之后于 4℃
冰箱冷却 3 min，加入 800 μL 的酚 氯仿 异戊醇
（25 24 1）试剂，颠倒 30-50 次，使溶液呈乳浊状，
12 000 r/min 4℃离心 10 min ；取上清用等体积氯仿
重复提抽一次 ；转移上清至新的 1.5 mL eppendorf
管 中， 加 入 1/20 体 积 的 NaAc（3 mol/L，pH5.2）
及 2 倍体积的冰冷无水酒精。静止至少 2 h 后取出
12 000 r/min 4℃离心 10 min。得到 DNA 沉淀，沉淀
用 70% 酒精洗两次，空气中晒干后溶解于 50 µL 无
菌水中备用。
1.2.2 18S rDNA 的 克 隆 与 测 序 PCR 引 物 为 18S
DNA 通用引物 [6]，由上海生工生物工程技术服务
有限公司合成。18SF:5′-AACCTGGTTGATCCTGCCAG
T-3′，18SR: 5′-GATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC-3′。
PCR 条件 ：94℃预变性 3 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，
72℃ 1 min，共进行 30 个循环 ；72℃充分延伸 10 min。
反应体系 50 μL，10×RCR Buffer 5 μL，dNTP 4 μL，
DNA 模板 2 μL，正向引物与反向引物各为 2 μL，
ddH2O 34.75 μL，Taq 酶 0.25 μL。
PCR 产物交上海生工生物工程技术服务有限
公司测序，测序仪为 ABI LR-377 全自动荧光测序
仪。将得到的结果在 NCBI 上分别进行 BLAST 同源
性比较。
1.2.3 电泳检测 采用琼脂糖凝胶电泳法进行电泳
检测。凝胶中的琼脂糖含量为 0.8%，电泳缓冲液为
TBE。
1.2.4 藻体形态观察 用吸管吸取适量藻培养液滴
于载玻片上，用普通光学显微镜观察形态。
2 结果
2.1 DNA提取结果
前沟藻基因组 DNA 经电泳检测后如下图 1 所
示，提取的总 DNA 边缘清晰、条带集中无拖尾，表
明总 DNA 质量较好，可以用于 PCR 扩增。DNA 大
小约为 23 kb 的条带。
图 1 前沟藻基因组 DNA 电泳图
图 2 PCR 扩增前沟藻 18S rDNA 基因片段
2.2 18S rDNA基因序列的克隆与测序分析
以 前 沟 藻 基 因 组 DNA 为 模 板，PCR 扩 增
18S rDNA 基因序列，得到的 PCR 产物，经电泳检
测。从电泳图谱（图２）可以看出，PCR 产物只出
胡乐琴等 ：前沟藻 18S rDNA 序列克隆和分子鉴定分析
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011年第12期94
现一条明亮主带，表明 PCR 效果较好。其大小为
1 800 bp 左右。对 PCR 产物进行了测序分析，结果
2.3 序列比对
将克隆序列在 NCBI 上进行 BLAST 同源性比较
搜索，结果表明，扩增得到的前沟藻 18S rDNA 基
因序列与 GenBank 上多个前沟藻属（Amphidinium）
的藻株 18S rDNA 基因序列高度同源，同源性达到
95%-99％，而与其中几株标记为强壮前沟藻的同源
性均为 99%，序列覆盖度均在 99%，E value 均为零，
由此可以初步推断试验藻株为强壮前沟藻。GenBank
中与本试验株的同源性为 99%，序列覆盖度为 99%，
Evalue 为零的还有４株藻，这４株藻均属于前沟藻
属，但未标明种名，推测４藻株也可能是强壮前沟藻。
克隆序列与裸甲藻属和环藻属的藻株同源性为
85% 左右，前沟藻、裸甲藻属和环藻属均属于甲藻
门的不同属。
CAGCTTGTCT AAGATTAGCC ATGCATGTCT CAGCATAAGC GATCTTCAGC AAGGCTGCAA
ATGGCTCATT ACAACAGCAA TAATTTTCGC AGTGCTTCAT CGCACATGGA TAACTGTGGA
AAATCTAGGG CTAATACATG CGTCATACCT GACTTCTGGG AAAGGTTGCT ATCATGAGTC
ATAGAATCGG CGCAGGCTCT GCCTTGCTAC CAAGGTGAGT CATGATAATT TAGCTGATCG
CATTGCATCA GCTGGTGATG AACTGCACAA GTTTCTGACC TATCAGCTTC CGACGCTAGG
GTATTGGCCT ACTGTGGCAA TGACGGGTGA CGGAGAATTA GGGTTCGATT CCGGAGAGGG
AGCCTGACAC ATGGCTACCA CATCTAAGGA AGGCAGCAGG CGCGCAAATT ACCCAATCCT
GACATGGGGA GGTAGTGACA AGCAATAACA ATACGGGGCA TCCATGTCTT GTAATTGGAA
TGAGCTAACT GTAAACATGT TGGTGAGTAT CAATTGGAGG GCAAGTCTGG TGCCAGCAGC
CGCGGTAATT CCAGCTCCAA TAGCGTATAT TAAAGCTGTT GCGGTTAAAA AGCTCGTAGT
TGGATTTCTG TCAAGTACAA CTGGTCCGCC CTCTGGGTGA GCACATAGTT TGGTCTTGGC
ATCTTGCTGG AAACTGTTGC TGCACTTGGC TGTGTGGCGC AGTGTCCAGC ACTTTCACTT
TGAGGAAATT GGAGTGTTTC AAGCAGGCAA TGCCTTTGAA CACAGTAGCA TGGAATAATT
AGATTGGGCT TTTGCTCCAA TTTGTCGGTT TCTGGAGCTG AGGTGAGAAT TAATGGGGAT
TGTTGGGGGC ATCCGAATTC AGCCGTCAGA GGTGAAATTC TTGGATCGGC TAAAGACGGA
CAACTGCGAA AGCGTTTGCC CAGGATGTTT TCATTGATCA AGAACGAAAG TTAGGGGATC
GAAGACGATC AGATACCGTC CTAGTCTTAA CCATAAACTA TGCCAACTAG GGATTGGTGG
TCGTTAGTTG CACGACCCCA TCAGCACCTG ATGAGAAATC AAAGTCTTTG GGTTCTGGGG
GGAGTATGGT CGCAAGGCTG AAACTTAAAG GAATTGACGG AAGGGCACCA CCAGGAGTGG
AGCCTGCGGC TTAATTTGAC TCAACACGGG GAAACTTACC AGGTCCAGAC ATAGGTAGGA
TCGACAGATT GATAGCTCTT TCGTGATTCT ATGGGTGGTG GTGCATGGCC GTTCTTAGTT
GGTGGAGTGA TTTGTCTGGT TAATTCCGTT AACGAACGAG ACCTTATCTG GCTAAGTAGC
TATGCATAGC TGTGGTTTTG TGGACAGTTT CTTAGAGGGA CTTCGTGCGC CTAGCATGAG
GAAGTTTGAG GCAATAACAG GTCTGTGATG CCCTTAGATG TTCTGGGCTG CACGCGCGCT
ACACTGATAC CTTCAGCGAG TCCACCACCT TGCCTGGGAG GGTGGGGTAA CCTCTGGAAA
GTGCATCGTG ATGGGGATCG ATTATTGTAA TTATTAATCT TCAACGAGGA ATTCCTAGTA
AGCATGTGTC ATCAGCCCGT GCTGATTACG TCCCTGCCCT TTGTACACAC CGCCCGTCGC
TCCTACCGAT TGAGTGATCC GGTGAATTAT TCGGACTGCA ACGCGTTCAG TCTCTGTATG
CTGTTGCGGA AAGTTTTGTG AACCTTACCA CTAGAGGAAG AGAAGTCGAC CATGCG
1
61
121
181
241
301
361
421
481
541
601
661
721
781
841
901
961
1021
1081
1141
1201
1261
1321
1381
1441
1501
1561
1621
1681
图３ 测序结果
（图 3）显示，克隆得到的 18S rDNA 基因片段大小
为 1 736 bp。
2.4 藻体形态观察
光学显微镜下观察如图 4 所示，该藻为单细
胞，裸露无细胞壁，营浮游生活。 细胞为顶尖形，
上锥部退化，只占其体长的 1/4 或更少。藻体长约
8-15 μm，宽 5-7 μm 。横沟连接着上锥部与下锥部，
上锥部只占下锥部的 1/5。带状横鞭毛，纵鞭毛凸
图 4 前沟藻在光镜下（×1000）的形态照片
2011年第12期 95胡乐琴等 ：前沟藻 18S rDNA 序列克隆和分子鉴定分析
出纵沟，并垂直于横沟。藻体内色素较少，3-4 个。
这些特征与强壮前沟藻的典型形态特征相符合。结
合分子序列比对和形态学特征，初步认为该藻为强
壮前沟藻。
3 讨论
目前藻类鉴定是依据传统的形态学特征，鉴定
时间比较长 [12] ；藻类生活史复杂，生存环境变化大，
导致形态变化较大，依靠形态学鉴别有时会产生误
差 [12] ；在混合体中要鉴别和鉴定各组成物种，依
靠形态学方法更加困难。因此，在研究赤潮时，有
必要寻找一种新的、更为先进的藻类鉴定方法，以
弥补形态学鉴别的不足。分子技术为物种鉴定提供
了更为方便、快捷、准确的途径。遗传物质在长期
的进化过程中具有相对的稳定性，在物种进化研究
和物种鉴定中得到越来越广泛的应用。目前用于
鉴定物种的分子标记和分子技术有 SCCP、DDGE、
DDTE、RFLP、RAPD、16S rDNA 及 18S rDNA，其中
18S rDNA 已经多次应用于藻类的鉴定 [6-8]。然而，
关于 18S rDNA 是否可以作为区别种的分子标记则不
同的学者有不同的看法。有文章说 18S rDNA 可以将
藻类鉴定到种 [8,11]，有认为只适合属以上的鉴定 [9]，
还有的认为过于保守，精确度不高 [6,12]，而 ITS 则作
为良好的分子标记，用于种间鉴定合适 [7,9,13] ；也有
人建议将 18S rDNA 和形态鉴定结合起来 [10]。
关于 18S rDNA 在藻种鉴定上的准确性，不同
的学者得出了略为不同的结论。本试验认为，对于
前沟藻而言，只依赖 18S rDNA 似乎没有足够的证据
确定其种属，但如果将分子标记和微藻的一、二个
典型性的形态学特征结合起来，则有可能精确、快
速地鉴定该藻。这似乎是一个值得参考的微藻鉴定
的方法。
4 结论
为了鉴定本试验藻的种属，在 GenBank 搜索
列出了 21 个同源性在 95% 以上的结果。其中同源
性在 99% 的有 10 个，其中 6 株明确为强壮前沟藻，
另 4 株未命名。这 10 株藻序列相似度极高。由此初
步推断试验藻株为强壮前沟藻。另外 4 株未命名的
藻株推断也是强壮前沟藻。
与前沟藻属的另外 11 株同源性为 95%-96%。
与甲藻门的其他属，如环沟藻属的一个藻株 86%，
裸甲藻属的一株 86%。光学显微镜下，可以清晰地
看到该藻具有明显的强壮前沟藻的形态特征。结合
分子序列特征和形态学特征，基本可以鉴定该藻为
强壮前沟藻。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）