全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第2期
生物矿化是指在生物体中细胞的参与下，无机
元素从环境中选择性地沉析在特定的有机质上而形
成矿物的过程［1］。生物体的矿化过程十分复杂，至
今远未充分认识生物矿物的形成机理以及基质、细
胞等对生物矿物的调控作用。大多数的研究只是在
生物体外简单的模拟体系中进行，并且对生物大分
子协同调控作用的研究非常少［2-6］。因此需要在更
接近生物体内环境的条件下，进一步研究基质中的
生物矿化过程、细胞与矿物的相互作用，以阐明生
物矿物的形成过程，为开发仿生材料提供理论基础。
但目前生物矿化研究的对象主要为一些多细胞动物
收稿日期 ： 2013-09-03
基金项目 ：浙江省自然科学基金资助项目（LY12C01004 ）
作者简介 ：胡伟莲，女，博士，副教授，研究方向 ：微生物生物技术 ；E-mail ：weilian89@126.com
沙根骨中碳酸钙矿化微生物分离筛选及鉴定
胡伟莲 戴德慧
（浙江科技学院 生物与化学工程学院，杭州 310023）
摘 要 ： 沙根骨（自命名）是在宁夏中卫地区发现的以碳酸钙为主的胶结物质将周围的沙子凝聚在一起形管状物。对沙根
骨中碳酸钙矿化微生物进行了分离筛选，共分离到 12 株菌株，其中 3# 菌株有较强碳酸钙矿化能力，在经 1.0% CaCl2 液体培养基
中振荡培养的 72 h 后，能形成矿物沉淀并形成薄膜挂壁。沉淀物质经扫描电镜（SEM）及 X 射线粉末衍射（XRD）分析，确定为
方解石和球霞石混合晶型的碳酸钙晶体。根据其形态特征、生理生化以及 16S rDNA 对 3# 菌株进行了鉴定，初步认定了该菌为类
芽孢杆菌属，命名为 Paenibacillus sp.s3，为进一步研究沙根骨的形成机理奠定了良好基础。
关键词 ： 沙根骨 生物矿化 微生物 类芽孢杆菌属
The Isolation，Screening and Identification of CaCO3 Mineralization
Strain from Sand Boon
Hu Weilian Dai Dehui
（Department of Biology and Chemical Engineering，Zhejiang Universtity of Science and Technology，Hangzhou 310023）
Abstract: Sand bone（named by the research team）is a tube that is agglutinated by sand with cementing material mainly composed of
calcium carbonate. It was found in Zhongwei area of Ningxia Autonomous Region. Strain 3# has strong ability of CaCO3 mineralization among
12 strains isolated from sand bone. Mineral deposit was produced and covered the flask wall after 72 h shake cultivation with 1.0% CaCl2 liquid
medium. To analyze the mineral deposits, XRD and SEM were performed. The result was showed that mineral deposit was made up of calcium
carbonate, which contains two crystal forms（calcite and vaterite）. Based on morphological, physiological and biochemical properties and 16S
rDNA sequence analysis, strain 3# was identified as Paenibacillus sp., and was named Paenibacillus sp. s3 . It laid a good foundation for reaching
formation mechanism of sand boon further.
Key words: Sand boon Biomineralization Microorganism Paenibacillus
（如软体动物、甲壳动物、脊椎动物等），调控及矿
化过程过于复杂［7，8］，在无机物矿化的机理研究中
难以突破，而在微生物生物矿化方面的研究也只是
集中在地质的演变、矿物形成、微生物浸矿等方面
的研究［9，10］，对于微生物矿化的种群生态、微观机理、
微生物活体与无机物的相互作用机制、微生物活体
诱导无机物矿化的机理等方面研究相对较少。笔者
在宁夏回族自治区沙漠地区发现少许有沙子黏结的
细长管状物（命名为沙根骨），管内中空。在该地区
距地表 30-60 cm 以下发现内部充填着的褐色物质的
沙管（图 1），对沙管及沙管中褐色物进行了显微观
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第2期172
察及初步研究，发现该沙管是由沙子通过由碳酸钙
为主要胶结物质集聚而成的（图 2）。微生物矿化作
用形成沙根骨现象在国内外文献均未见报道。对其
形成的机制研究具有原创性。本研究对沙根骨中微
生物进行了分离、筛选及鉴定，为今后进一步研究
沙根骨矿化微生物及生物矿化形成的机制研究奠定
了良好的基础。
限公司，上海）；高速冷冻离心机 ：HC-2518R（BBI
美国）；超净工作台 ：SW-CJ-2FD 型（苏州净化设备
有限公司，苏州）：光 学 显 微 镜 ：BA210（Motick
中国）。热场发射扫描电子显微镜 ：SIRION（FEI 公
司 荷兰）；X 射线衍射仪 XPert PRO（PANalytical 荷
兰）。
1.1.3 主要培养基 （1）细菌筛选分离培养基（%）：
牛肉膏 0.5，蛋白胨 0.5，氯化钠 0.3，采样地沙子
10，琼脂 2，pH7.4-7.6。（2）真菌筛选培养基（%）：
硝酸钠 0.3，蔗糖 3，采样地沙子 10，琼脂 2，pH 自然。
（3）放线菌筛选培养基（%）：可溶性淀粉 2，KNO3 0.1，
采样地沙子 10，琼脂 2，pH7.4-7.6。（4）沙子培养基：
采样地沙子 20，琼脂 2，pH 自然。（5）液体矿化培
养基 ：分别在牛肉膏蛋白胨细菌培养基，察氏培养
基，高氏一号液体培养基的基础上添加 1.0% CaCl2。
121℃灭菌 20 min。
1.2 方法
1.2.1 沙根骨中微生物的分离、纯化 将新采集的
沙根骨在无菌室中用无菌水冲洗去表面沙子及污物，
以 75% 酒精进行表面消毒，用无菌水冲洗，将消毒
后的沙根骨用无菌接种针将管内物推入到无菌生理
盐水中，并涂布到细菌、真菌、放线菌等分离培养基，
分别至于 26℃培养一定的时间，观察生长情况。当
出现单菌落后进一步划线纯化后斜面保藏。
1.2.2 碳酸钙矿化微生物筛选 将斜面保存的各菌
株斜面活化后，加入无菌水将菌体洗下制成菌悬
液，按菌种类别分别接入装有 1.0 % CaCl ２的发酵培
养基中（300 mL 三角瓶装量 50 mL）。置于 26℃中
180 r/min 振荡培养 3-8 d，观察发酵液中菌体生长、
沉淀以及瓶壁挂膜等情况。
1.2.3 分析检测 用滤纸抽滤去除发酵液和菌体细
胞，所得沉淀用蒸馏水冲洗 4-5 次，洗去表面附着
的发酵液，105℃干燥至恒重。对沉淀物质进行扫描
电子显微镜及 X 射线衍射分析。
1.2.4 菌株鉴定 菌体形态观察、生理生化反应及
菌种全自动鉴定 ：选取碳酸钙矿化能力最强的 3# 菌
株，按参考文献方法［11］观察菌体形态并进行生
理生化试验。
16S rDNA 分子生物学法鉴定菌种 ：用 UNIQ-10
图 1 自然环境中的沙根骨（沙下 40 cm）
图 2 沙根骨的切面图（20×）
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 沙根骨样品来源 沙根骨 ：样品采自宁夏回
族自治区中卫地区。在采样过程中，首先用铲子铲
去表面的沙子，找到沙根骨，小心采集不短于 20 cm
的沙根骨，4℃保存备用，在运输及保存过程中注意
防止污染。
1.1.2 主要试剂和仪器 琼脂糖 ：BBI ；DNA Ladder
Mix maker SM0337（100-10000，上海生工）；Bacter-
ial DNA Kit ：SK1201（上海生工）；其他试剂均为分
析纯。水平槽电泳仪 ：DYC P-31DN（六一仪器厂，
北京）；凝胶成像仪 ：FR980（上海复日科技仪器有
2014年第2期 173胡伟莲等 ：沙根骨中碳酸钙矿化微生物分离筛选及鉴定
柱式细菌基因组 DNA 抽提试剂盒提取菌种的基因
组 DNA，利用 16S rDNA 通用引物，上游引物为（5-
CAGAGTTTGATCCTGGCT-3），下 游 引 物 为（5-
AGGAGGTGA TCCAGCCGCA-3）。 进 行 PCR 扩 增。
PCR 扩增程序 ：98℃预变性 3 min，98℃维持 25 s，
55℃维持 25 s，72℃ 1 min，30 个循环。PCR 产物检测：
预先制备质量分数为 1.0% 的琼脂糖凝胶，扩增反应
完毕后，取 5 μL PCR 产物与上样缓冲液混合，加样
于琼脂糖凝胶点样孔中进行电泳。DNA 回收 ：从琼
脂糖中回收 DNA，具体方法参照凝胶回收试剂盒说
明书。测序：由生工上海生物工程有限公司代作测序。
系统进化树构建 ：将目的菌株的 16S rDNA 基因
序列输入到 GenBank 基因数据库（http ：//www.ncbi.
nlm.nih.gov/genbank）中使用 Blast 软件进行序列同源
性比较分析。选取同源性高的序列先通过 Clustal W
软件进行程序进行多重对比后，利用 MEGA 5.2 软
件计算并构建系统进化树［12，13］。
2 结果
2.1 沙根骨中菌株的分离与筛选
通过对沙根骨管腔内的褐色物质进行分离纯化，
共得到菌落形态或菌株形态有差异的菌株 12 株，其
中细菌 8 株，均为革兰氏阳性菌 ；放线菌 2 株，丝
状真菌 2 株。将分离纯化得到 12 株菌株按菌种类
别分别接入到筛选培养基中，根据菌株生长情况培
养 3-8 d。在发酵过程中，能使瓶壁挂上一层沉淀薄
膜（图 3）和过滤后得到沉淀（图 4）的菌株有 2 株，
分别为 3# 和 6# 菌株，其产生的沉淀分别为 0.8 g/L
和 0.07 g/L。由此可以初步判断 3# 和 6# 均有一定的
生物矿化能力，其中 3# 生物矿化能力最强，有可能
是沙根骨中的晶体形成的主要微生物。对 3# 菌株的
沉淀物质及种属鉴定进行了进一步研究。
2.2 沉淀物质分析
为了定性分析所得沉淀物质，对样品进行了 X
射线衍射和扫描电镜观察分析。
如图 5 所示，沉淀粉末样品进行 XRD 分析。对
照设备所带数据库及 PDF 标准卡（PDF No ：00-005-
0586、No ：00-033-0268）的有关数据，沉淀样品出
现 方 解 石 衍 射 峰， 衍 射 角 ＝ 23.0o、29.4 o、35.9 o、
39.5 o、43.1 o、47.5 o、48.5 o 分别对应（012）、（104）、
图 3 3# 菌株三角瓶培养沉淀薄膜挂壁状态
图 4 3# 菌株发酵液中沉淀物质（12×）
6000
5000
4000
3000
2000
1000
0
10 20 30 40
88-1807>Calcite-Ca CO3
72-0506>Vaterite-CaCO3
50
2-Theta
In
te
ns
ity
Co
un
ts
图 5 沉淀物质 X 射线粉未衍射图
A B
C D
图 6 沉淀物质扫描电镜（A ：500×，B ：1 000×，
C ：5 000×，D ：10 000×）
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第2期174
（110）、（113）、（202）、（018）、（116） 晶 面。 此 外
还出现球霞石衍射峰，衍射角 22θ ＝ 21.0o、24.9 o、
27.0 o、32.7 o、42.7 o、43.8 o、49.0 o、50.0 o 分别对应（004）、
（110）、（112）、（114）、（008）、（300）、（304）、（118）
晶面。说明沉淀样品晶型是方解石和球霞石混合晶
型。根据两种晶型的衍射峰的强度经计算分析［14］，
两者的比例约为 52 ∶ 48。
由图 6 可以看出 CaCO3 颗粒呈分散状态，形貌
呈球形、方形和无规则块状体，分布杂乱无章，表
面具有多层重叠结构特征，粒径在 0-15 μm，沉淀
的样品表面无明显菌体印痕。可能菌体本身未参加
CaCO3 的生物矿化形成。
2.3 菌株鉴定结果
2.3.1 菌株的形态特征及生理生化特性鉴定 3# 菌
株形态特征见图 7。3# 菌株在蛋白胨牛肉膏固体培
养基上 28℃培养 48 h 后即形成明显的单菌落，菌落
为无色透明，圆形，边缘整齐，表面光滑，粘稠。
菌株革兰氏染色为阳性，但随培养时间增长菌体革
兰氏染色转为红色，两端钝圆，散生，运动，有较
大荚膜，膨大胞囊内有接近顶端的椭圆形大芽孢。
生理生化特征 ：接触酶为阳性、氧化酶弱阳性、水
解淀粉、脲酶阴性、VP 阴性，不产硫化氢。
2.3.2 分子生物学鉴定及系统发育树构建 3# 菌
株 16S rDNA 经 PCR 扩 增 后 得 到 约 1 500 kb 的
DNA 片段，回收纯化后进行序列测定，序列总长
为 1 458 bp。将该序列在 GenBank 中提交（序列号
KF669895）并进行同源性检索，结果显示在最相近
的序列中，均为类芽孢杆菌属（Paenibacillus）细
菌。 根 据 序 列 在 NCBI 数 据 库 BLAST， 从 中 选 出
14 个具有代表性的菌株，根据其相近的菌株的 16S
rDNA 序列，利用 MEGA5.2 构建系统进化树，如图
8 所示。从系统发育树上看，3# 菌株与 Paenibacillus
castaneae 位于同一分枝，同源性最高，亲缘关系最近。
从分子生物学鉴定结果分析该菌株可以判定为类芽
孢杆菌属，命名为 Paenibacillus sp. S3，但其种的确
定还需通过模式菌进一步比对。
A B
图 7 3# 菌株菌体形态（A 营养体，B 芽孢 1 000×）
Paenibacillus catalpae strain D75 HQ 657320.1
Paenibacillus glycanilyticus strain XAS5-2 JF496313.1
Paenibacillus glycanilyticus strain KUDC1790 KC 355297.1
Paenibacillus glycanilyticus strain WAS2-2 JF496508.
Paenibacillus catalpae strain P6E KF010809.1
Paenibacillus glycanilyticus strain NBM75 HQ703903.1
Paenibacillus glycanilyticus strain EA4-12 JF496423.1
Paenibacillus glycanilyticus strain EA3-12 JF496415.1
strain 3*
Paenibacillus castaneae strain Ch-32 NR 044403.1
Paenibacillus castaneae strain CCNWQLS16 JX 840390.1
Paenibacillus castaneae strain IHB B 3128 HM563048.1
Paenibacillus prosopidis strain EAS3-6 JF 496445.1
Paenibacillus prosopidis strain PW21 FJ 820995.1
100
99
51
62
58 99
99
61
39
53
59
47
0.005
Paenibacillus harenae strain B519 NR043220.1
图 8 依据 16S rDNA 序列构建的 3# 菌株及相关菌株的系统发育树
3 讨论
方解石、文石及球霰石等 3 种同质多象变体碳
酸钙是自然界分布最广的矿物之一，微生物诱导碳
酸钙生物矿化一直是地质微生物学领域研究的重要
内容［16-19］。矿化微生物通过其自身的新陈代谢，与
周围环境介质之间不断发生酶化作用，形成胶结物
质——方解石，经过长期的累积，可以将刚沉积的
疏松碎屑物质最终胶结形成坚硬的岩石［20］。本研究
2014年第2期 175胡伟莲等 ：沙根骨中碳酸钙矿化微生物分离筛选及鉴定
所采取的样品沙根骨即是微生物通过自身的代谢反
应形成以碳酸钙为主的胶结物质将周围的沙子凝聚
在一起形成沙管的形态，在恶劣的环境中对沙管中
的微生物起保护作用。分离筛选得到碳酸盐矿化微
生物是研究沙根骨形成机制的前提条件。本研究通
过对沙根骨中的微生物分离、纯化及筛选得到一株
碳酸钙矿化微生物。在 CaCl2 培养基中能将 Ca
2+ 形
成方解石、球霰石的混合晶型的碳酸钙晶体，经形态、
生理生化及分子生物学等方法确定了该菌株为类芽
孢杆菌（Paenibacillus sp.）。为今后进一步研究沙根
骨生物矿化机理方面的基础研究提供材料。此外，
若为该菌株提供适宜的环境条件，加速其酶化作用，
快速沉积制备出 CaCO3，在较短时间内将石质材料
胶结起来，可以为重大建筑工程、重要历史建筑物
裂缝以及石质历史文物的修补提供新的方法和思路。
4 结论
从沙根骨中分离得到具有有较强碳酸钙矿化能
力的 3# 菌株，其矿化物经扫描电镜（SEM）及 X 射
线粉末衍射（XRD）分析，确定为方解石和球霞石
混合晶型的碳酸钙晶体。通过从形态特征、生理生
化以及 16S rDNA 等方面的鉴定，初步确定了该菌为
类芽孢杆菌属，命名为 Paenibacillus sp.s3.。
参 考 文 献
［1］ 薛中会 , 武超 , 戴树玺 , 等 . 生物矿化研究进展［J］. 河南大学
学报 ：自然科学版 , 2003, 33（3）21-25.
［2］ Reyes-Carmona JF, Felippe MS, Felippe WT , et al . The
Biomineralization ability of mineral trioxide aggregate and portland
cement on dentin enhances the push-out strength［J］.Journal of
Endodontics, 2010, 36（2）：286-291.
［3］ Hakki SS, Buket Bozkurt S, Hakki EE, et al. Effects of mineral
trioxide aggregate on cell survival, gene expression associated with
mineralized tissues, and biomineralization of cementoblasts［J］.
Journal of Endodontics, 2009, 35（4）：513-519.
［4］ Habibovic P, Bassett DC, Doillon CJ, et al. Collagen biomineraliza-
tion In vivo by sustained release of inorganic phosphate ions［J］.
Advanced Materials, 2010, 22（16）：1858-1862.
［5］ Weiner S, Mahamid J, Politi Y, et al. Overview of the amorphous
precursor phase strategy in biomineralization［J］.Frontiers of
Materials Science in China, 2009, 3（2）：104-108.
［6］ Tong H, Ma W, Wang L, et al. Control over the crystal phase, shape,
size and aggregation of calcium carbonate via a l-aspartic acid
inducing process［J］. Biomaterials, 2004（25）：3923-3929.
［7］ 欧阳健明 . 生物矿物及其矿化过程［J］. 化学进展 , 2005, 17
（4）：749-756.
［8］ Takahashi K, Yamamoto H, Onoda A, et al. Highly oriented arago-nite
nanocrystal-biopolymer composites in an aragonite brick of the nacr-
eous layer of Pinctada fucata［J］. Chem Comm, 2004（8）：996-
997.
［9］ Miota J, Benzeraraa K, Morina G, et al. Iron biomineralization by
anaerobic neutrophilic iron-oxidizing bacteria［J］. Geochimica et
Cosmochimica Acta, 2009, 73（3）：696-711.
［10］ 鲁安怀 , 生命活动中矿化作用的环境响应机制研究［J］. 高
校地质学报 , 2007, 13（4）：613-620.
［11］ 郭俊涛微生物的鉴别与图谱［M］. 北京 ：人民卫生出版社 ,
2007.
［12］ 谢菲 , 李从虎 , 郑佳 , 王红梅 , 等 . 角蛋白酶生产菌株的分离
筛选与鉴定［J］. 微生物学报 , 2010, 50（4）：537-541.
［13］ 孙玉英 , 张继泉 , 邬世昂 . 一株产壳聚糖酶的噬纤维菌分离及
产酶发酵条件优化［J］. 生物技术通报 , 2013（8）：150-154.
［14］ 陈明燕 . 有机基质存在下碳酸钙的生物矿化研究［D］. 成都：
西南石油学院 , 2005 ：41-46.
［15］ 东秀珠 , 蔡妙英 . 常见细菌系统鉴定手册［M］. 北京 ：科学
出版社 , 2001.
［16］ 吴晓萍 , 邱轩 , 刘邓 . 微生物成因的碳酸盐矿物研究进展［J］.
微生物学通报 , 2013, 40（1）：180-189.
［17］ 成亮 , 钱春香 , 王瑞兴 , 等碳酸盐矿化菌调控碳酸钙结晶动
力学、形态学的研究［J］. 功能材材 , 2007, 9（38）：1511-
1515.
［18］ 徐旭荣 , 蔡安华 , 刘睿 , 等 . 生物矿化中的无定形碳酸钙［J］.
化学进展 , 2008, 20（1）：54-59.
［19］ Kitamura M, Konno H. Controlling factors and mechanism of
reactive crystallization of calcium carbonate polymorphs from
calcium hydroxide suspensions［J］. Journal of Crystal Growth,
2002, 236（1）：323-332.
［20］ 王瑞兴 , 钱春香 , 王剑云 . 微生物沉积碳酸钙研究［J］. 东南
大学学报 ：自然科学版［J］.2005, 35（增刊 1）：191-195.
（责任编辑 李楠）