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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第7期
鞭毛素（flagellin）是细菌鞭毛的主要组分，不
仅与鞭毛运动性有关，而且可以作为病原相关分子
模式（PAMP）激发植物的免疫反应（PTI）［1］。其
N 端有一个由 22 个氨基酸组成的保守肽段 flg22，通
过与植物受体 FLS2 的识别及其信号传导，最终诱导
了拟南芥、番茄和烟草等植物的防卫反应［2-5］。同样，
通过 flg22 与水稻受体 OsFLS2 的识别作用，也可引
起水稻的防卫反应，但这种反应很微弱 ；而 flg22 或
鞭毛素却能激发过表达 OsFLS2 的水稻悬浮细胞强烈
的防卫反应［6］。燕麦嗜酸菌（Acidovorax avenae sub.
收稿日期 ：2013-03-22
基金项目 ：国家“863”计划项目课题（2012AA101504），植物病虫害生物学国家重点实验室开放基金资助项目（SKL2012OP10）
作者简介 ：伍甜，男，硕士研究生，研究方向 ：分子植物病理学 ；E-mail ：wowutian2007@yahoo.com.cn
通讯作者 ：陈华民，副研究员，硕士生导师，研究方向 ：分子植物病理学 ；E-mail ：hmchen@ippcaas.cn
avenae，简称 Aaa）不亲和菌株 N1141 的鞭毛素能够
引起水稻过敏反应，并伴随着大量 H2O2 的产生
［7， 8］。
表 明 细 菌 鞭 毛 素 作 为 PAMP 对 单 子 叶 植 物 水 稻
PTI 的诱导作用机理比较复杂，有必要进行深入的
探究。
本研究采用机械震荡、丙酮沉淀以及离子交换
层析进行了蛋白提纯，并对其诱导水稻产生 H2O2 的
能力进行测定，旨在探索一种能够大量提纯的可行
方法，并且获得提纯、有活性的鞭毛素蛋白，用于
后续的水稻 PTI 机理的解析。
燕麦嗜酸菌鞭毛素的提纯及其活性检测
伍甜1，2  刘莹2  余超2  边强3  田芳2  黄琼1  陈华民2  何晨阳2 
（1. 云南农业大学植物保护学院 云南省植物病理重点实验室，昆明 650201 ；2. 中国农业科学院植物保护研究所
植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193 ；3. 南开大学 农药国家工程研究中心，天津 300071）
摘 要 ： 为阐明燕麦嗜酸菌（Aaa）鞭毛素作为一种病原相关分子模式（PAMP）诱导水稻免疫反应（PTI）的作用机理，采
用机械震荡、丙酮沉淀以及离子交换层析进行了蛋白提纯，并用 DAB 染色法对其诱导水稻产生 H2O2 的能力进行了测定。结果表
明，上述提纯方法的组合使用有效地提纯了分子量约为 45 kD 的鞭毛素，经浸润接种处理后诱导了水稻叶组织 H2O2 的产生。因此，
Aaa 鞭毛素提纯蛋白可用于后续的水稻 PTI 机理分析。
关键词 ： 燕麦嗜酸菌 鞭毛素 纯化 生物活性
Purification and Activity Assay of Flagellin from
Acidovorax avenae sub. avenae NB001
Wu Tian1，2 Liu Ying2 Yu Chao2 Bian Qiang3 Tian Fang2 Huang Qiong1 Chen Huamin2 He Chenyang2
（1. Yunnan Province Key Laboratory of Plant Pathology，Faculty of Plant Protection，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201 ；
2. State Key Laboratory for Biology of Plant Disease and Insect Pests，Institute of Plant Protection，Chinese Academy of Agricultural
Sciences，Beijing 100193 ；3. National Pesticide Engineering Research Center，Nankai University，Tianjin 300071）
Abstract:  To elucidate the mechanism of PAMP-triggered-immunity（PTI）of rice by bacterial flagellin, a pathogen-associated
molecular pattern（PAMP）, the isolation and purification of flagellin from Acidovorax avenae sub. avenae（Aaa）strain NB001 and it’s
activity in elicitation of H2O2 generation of rice were performed in this study. The results showed that Aaa flagellin（about MW45 kD）was
effectively purified by combined using of vortex oscillation, acetone precipitation and anion exchange chromatography. Moreover, the purified
flagellin significantly induced H2O2 production in the leaf tissues of 14-day-old rice seedling. Therefore, the purified flagellin from Aaa could be
further used for function analysis in PTI of rice.
Key words:  Acidovorax avenae sub. avenae Flagellin Purification Biological activity
2013年第7期 79伍甜等 ：燕麦嗜酸菌鞭毛蛋白的提取纯化及生物活性测定
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验材料 供试菌株 ：Aaa 菌株 NB001 由中
国检验检疫科学院赵文军研究员提供。水稻品种 ：
日本晴（Oryza sativa ssp. japonica）由本实验室保存。
Aaa 菌株 NB001 与水稻品种日本晴的存在不亲和互
作关系。
1.1.2 主要试剂 KB 培养基（20 g 蛋白胨、10 mL
甘油、1.5 g K2HPO4、1.5 g MgSO4·7H2O、1 000 mL
H2O）；2×SDS 电 泳 上 样 缓 冲 液（0.061 5 mmol/L
Tris-HCl，pH6.8 ；1% SDS，10% 甘油，5% β-巯基乙
醇，0.002% 溴酚蓝）；染色液（0.125 g 考马斯亮蓝
R250、30 mL 甲醇、10 mL 冰乙酸、加 H2O 定容至
100 mL）；脱色液（30 mL 甲醇、10 mL 冰乙酸，加
H2O 定 容 至 100 mL）；PBS（0.27 g KH2PO4、1.42 g
Na2HPO4、NaCl 8 g，KCl 0.2 g、调节 pH 至 7.4，加
水定容至 1 L）；抗鞭毛素蛋白兔多克隆抗体（华大
公司）；HRP 标记的羊抗兔 IgG 抗体（华大公司）；
Super Ecl 发光液（北京普利莱基因技术有限公司）；
DAB（AMRESCO 公司）；蛋白 Marker（预染蛋白质
Marker Ⅲ）（天根公司）。
1.1.3 仪器和设备 台式恒温振荡器（太仓市实验
设备厂）；离心机（BECKMAN 公司）；震荡混匀器
（VORTGX 公司）；HPLC 系统（GE 公司）；阴离子
交换柱（GE 公司，5 mL HiTrapTM SP HP）；阳离子
交换柱（GE 公司，5 mL HiTrapTM QP HP）；垂直电
泳槽（Junyi 公司）；半干电转仪（Bio-Rad 公司）；
化学发光采集系统（GE 公司）；水浴锅（PolyScience
公司）；光学显微镜（OLYPUS 公司）。
1.2 方法
1.2.1 鞭毛素等电点和分子量预测 根据已测序的
鞭毛素基因的编码序列，通过 Primer 5.0 翻译成为氨
基酸序列，通过生物信息学网站 ExPASy（http：//web.
expasy.org/compute_pi/）对 Aaa 鞭毛素等电点（pI）、
分子量进行预测。
1.2.2 菌体培养与蛋白粗提 接种细菌于 4 L KB 培
养基中，在 28℃下震荡（200 r/min）培养 24 h。离心
（7 000 r/min×20 min，28 ℃）， 收 集 菌 体 沉 淀 ；加
玻璃珠与 30-40 mL 的 ddH2O 于离心管中，振荡 3
min，收集上清为鞭毛素蛋白粗提液。
1.2.3 粗提液检测及纯化前处理 缓慢加入粗提液
4 倍体积的预冷丙酮，慢慢搅拌至析出大量蛋白，
4℃放置过夜，沉淀蛋白。离心除去上清，收集蛋白
后，静置于通风厨 10 min，待残余丙酮挥发。加入
50 mL ddH2O 重悬蛋白，留取 100 μL 粗提液重悬物，
采用 5% 浓缩胶（上层），12% 分离胶（下层）进行
SDS-PAGE 电泳，检测粗提物纯度。其余粗提物用
HCl 调节至 pH2.0，在常温下搅拌 30 min，此时鞭毛
素蛋白从鞭毛上解离出来，形成解离液。将解离液
分成等体积 2 份，分别稀释至 300 mL 以降低盐浓度，
并分别调节 pH 至 3.5 和 7.5，用滤膜（2.2 μm）过滤，
备用。
1.2.4 离子交换层析法纯化 使用高效蛋白纯化仪，
分别通过阴、阳离子交换层析进行蛋白纯化。用浓
度为 15 mmol/L 的 Tris-HCl，pH8.0 的缓冲液作为 A
液（Start buffer），用 1 mol/L NaCl，通过加入 HCl 调
节 pH 至 7.0 作为 B 液（elution buffer）。先用 5 倍柱
体积的 A 液以 5 mL/min 流速平衡层析柱，然后以 3
mL/min 的流速，通过上样泵上蛋白样品（阳离子层
析柱上 pH 为 3.5 的粗提物样品，阴离子层析柱上
pH7.5 的粗提物样品）。然后用 2 倍柱体积的 A 液，
以 5 mL/min 的流速冲洗层析柱。最后以线性方式洗
脱蛋白（盐梯度使用 NaCl 的浓度由 0-1 mol/L），洗
脱 10 个柱体积，用 UV 214 nm 监测洗脱峰，收集出
峰的组份。
1.2.5 SDS-PAGE 检测和 Western blot 验证 取出峰
组份，吸取 20 μL 与等体积的 2×SDS 上样缓冲液，
沸水浴中煮 5 min。处理好的样品经 5% 浓缩胶（上
层），12% 分离胶（下层）的 SDS-PAGE 凝胶电泳。
一块胶用考马斯亮蓝染色 2 h，脱色液脱色 12 h，检
测结果。另一块胶用半干转膜系统，在 25 V 恒压下
转膜 1 h，所用的膜为 PVDF 膜 ；然后膜经过 5% 的
脱脂奶粉室温封闭 2 h，PBS 漂洗 3 次后，加入用
PBS 1∶5 000 稀释的鞭毛素蛋白多克隆抗体，孵育 2
h，用 PBS 漂洗 3 次，加入 HRP 标记的羊抗兔 IgG，
孵育 2 h，使用 PBS 漂洗 4 次，最后加入 Super Ecl
发光液，采集化学信号成像。
1.2.6 生物活性检测 用 DAB 染色法进行蛋白活性
检测。用浸润法将纯化蛋白（浓度 0.3 mg/mL）接
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第7期80
种苗龄 14 d 的水稻叶片，以 15 mmol/L 的 Tris-HCl
（pH7.0）缓冲液作为对照。对接种部位叶组织取样，
浸 入 含 0.01% Triton-X-100 和 1 mg/mL DAB 的 水 溶
液中，同时真空 30 min。叶片在室温下过夜孵育，
出现褐色 - 红色沉淀物质后，再将叶片浸入在 95%
乙醇∶乳酸∶苯酚（2∶1∶1）中，65℃孵育 30 min
后，用 50% 乙醇冲洗，再用清水冲洗后，在光学显
微镜下观察结果。
2 结果
2.1 鞭毛素等电点和分子量的预测
根据已经测序的 Aaa 鞭毛素的基因序列，通过
生物信息学分析，预测该菌株的鞭毛素 pI 为 5.46，
分子量为 49.37 kD。
2.2 鞭毛素蛋白的提纯
通过加入玻璃珠剧烈震荡菌体的方法，使鞭毛
与菌体分离。采用丙酮沉淀上清的方法，得到了大
量的粗提物。SDS-PAGE 电泳检测（图 1）发现，粗
提物中鞭毛素蛋白含量较高，但是仍然含有较多的
杂蛋白。
94
kD
M 1
60
45
27
18
M ：标准分子量蛋白 ；1 ：粗提物
图 1 燕麦嗜酸菌鞭毛素粗提物 SDS-PAGE 电泳分析
3400
A
3200
3000
2800
2600
2400
2200
2000
1800
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
-100 0 40 80 120 160 200 240 280 320 360 400
A
21
4n
m
੨ݹ
٬m
A
U

过柱体积mL
A ：HiTrapTM SP HP 阳离子交换层析 ；B ：HiTrapTM QP HP 阴离子交换层析
图 2 燕麦嗜酸菌鞭毛素离子交换层析洗脱峰
3500
B
3300
3100
2900
2700
2500
2300
2100
1900
1700
1500
1300
1100
700
900
500
300
100
0
-100 0 40 80 120 160 200 240 280 320 360 400
A
21
4n
m
੨ݹ
٬m
A
U

过柱体积mL
在 pH3.5 或 pH7.5 的条件下，粗提物中大量蛋
白均能够结合到阳、阴离子层析柱上，洗脱峰较为
单一（图 2）。
2.3 鞭毛素蛋白的检测
为了检测蛋白的纯化效果，对离子交换层析组
份进行验证。SDS-PAGE 结果（图 3）显示，阴、阳
离子交换层析纯化后均能获得一条明显的蛋白条带
（45 kD 左右）；相比较而言，阳离子交换层析纯化
产物更纯，未发现其它蛋白。Western blot 分析表明，
M ：标准分子量蛋白 ；1 ：阴离子交换层析纯化蛋白 ；
2 ：阳离子交换层析纯化蛋白
图 3 纯化后燕麦嗜酸菌鞭毛素的检测
94
kD
SDS-PAGE⭥⌣
Western blot
M 1 2
60
45
27
18
经阴、阳离子交换层析纯化的为鞭毛素蛋白。
2.4 鞭毛素蛋白的活性检测
通过 DAB 染色分析（图 4）显示，纯化后的鞭
毛素蛋白能引起水稻叶片产生大量的 H2O2，而缓冲
液处理则没有 H2O2 的产生，说明纯化得到的鞭毛素
2013年第7期 81伍甜等 ：燕麦嗜酸菌鞭毛蛋白的提取纯化及生物活性测定
蛋白具有生物学活性。
3 讨论
由于细菌鞭毛素含量较低，在大规模提纯等方
面一直存在一些困难。目前大多数报道采用超高速
离心提纯法［9］，但由于受到仪器容量、离心条件的
限制，提取量少，该法不适合大量提取。本研究对
燕麦嗜酸菌鞭毛素提取和纯化方法进行了不同尝试，
采用机械震荡、丙酮沉淀以及离子交换层析，成功
地获得了纯化蛋白，为后续的大规模制备提供了技
术支撑。
本试验发现 ：（1）通过玻璃珠机械震荡，使鞭
毛更易从菌体上脱落 ；（2）针对鞭毛素结构较保守、
耐受性较强的特点，通过加入丙酮破坏蛋白水化层，
使粗提蛋白沉淀，从而有利于在酸性条件下蛋白解
离 ；（3）鞭毛素（pI=5.46）无论带负或正电荷，都
可分别结合到阴、阳离子交换层析柱上。但阳离子
交换层析的蛋白组份单一，而阴离子交换层析的有
较多的杂带。其可能的原因是，在 pH=7.5 条件下，
粗提物中很多杂蛋白也带负电荷，与鞭毛素一起结
合到阴离子层析柱上，且结合力相仿，从而进行线
性洗脱时，两者一同被洗脱下来 ；而在 pH=3.5 条
件下，鞭毛素带正电荷，能够结合到阳离子层析柱
上，并且能够被洗脱下来 ；粗提物中杂蛋白在此 pH
条件，引发变性和空间构象变化，不能结合到阳离
子层析柱上，或结合力过大，导致无法洗脱。用 1
mol/L NaOH 对层析柱重生过程中，发现大量杂蛋白
被洗脱出来（实验室资料）。
此外，本研究纯化的鞭毛素能引起水稻叶片产
生 H2O2，表明这种蛋白具有生物活性。鞭毛素是一
种 PAMP 能够引起水稻的 PTI。因此，这种纯化的、
㕃ߢ⏢ 㓟ॆ䷝∋㳻ⲭ
图 4 DAB 染色法检测鞭毛素蛋白诱导水稻叶片 H2O2 产生
具有生物活性的鞭毛素蛋白可用于后续的水稻 PTI
分子机理的解析。
4 结论
成功地组合利用机构震荡、丙酮沉淀和离子交
换层析法，从 Aaa 中提纯了具有生物活性的鞭毛素
蛋白。
参 考 文 献
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及其信号机制的激发［J］. 植物保护 , 2011, 37（3）：12-16.
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（责任编辑 马鑫）