全 文 ：植物保护学报 允燥怎则灶葬造 燥枣 孕造葬灶贼 孕则燥贼藻糟贼蚤燥灶袁 圆园员缘袁 源圆渊员冤院 远远 原 苑员 阅韵陨院 员园郾 员猿愿园圆 辕 躁援 糟灶噪蚤援 扎憎遭澡曾遭援 圆园员缘郾 园员郾 园员园
基金项目院 国家野愿远猿冶计划渊圆园员圆粤粤员园员缘园源冤袁国家野怨苑猿冶计划渊圆园员员悦月员园园苑园园冤
鄢通讯作者渊粤怎贼澡燥则 枣燥则 糟燥则则藻泽责燥灶凿藻灶糟藻冤袁 耘鄄皂葬蚤造院 糟赠澡藻岳 糟葬葬泽援 灶藻贼援 糟灶
收稿日期院 圆园员源 原 园源 原 圆苑
鞭毛素蛋白 云造蚤悦葬葬葬诱导水稻免疫反应的活性测定
刘摇 莹员袁圆 摇 陈华民圆 摇 于摇 清圆 摇 田摇 芳圆 摇 鲁国东员 摇 何晨阳圆鄢
渊员援 福建农林大学植物保护学院袁 福州 猿缘园园园圆曰 圆援 中国农业科学院植物保护研究所袁
植物病虫害生物学国家重点实验室袁 北京 员园园员怨猿冤
摘要院 为阐明燕麦嗜酸菌渊粤糟蚤凿燥增燥则葬曾 葬增藻灶葬藻 泽怎遭泽责援 葬增藻灶葬藻袁 粤葬葬冤鞭毛素蛋白 云造蚤悦葬葬葬及其结构域对
水稻免疫反应的诱导作用袁通过分子生物学和生物信息学方法袁对 粤葬葬菌株 陨孕晕员 的鞭毛素进行基
因克隆及其序列分析曰在大肠杆菌中对该基因全长尧晕 端和 悦 端片段进行了原核表达袁纯化了
云造蚤悦葬葬葬蛋白及其截短肽段曰采用水稻叶片浸润法测定了表达蛋白对水稻免疫反应的诱导活性遥 结
果表明袁通过特异性引物的 孕悦砸扩增袁获得 员 源苑怨 遭责的鞭毛素基因 枣造蚤悦葬葬葬袁其编码产物含有 源怨圆 个
氨基酸袁分子量为 源怨郾 源 噪阅袁具有 枣造葬早藻造造蚤灶鄄晕 和鄄悦 两个保守结构域曰原核诱导表达获得了 云造蚤悦葬葬葬尧
云造蚤悦葬葬葬鄄晕和 云造蚤悦葬葬葬鄄悦可溶性融合蛋白曰猿 种纯化蛋白均能诱导水稻细胞死亡和 匀圆韵圆 产生等免疫
反应袁但诱导能力略有差异遥
关键词院 燕麦嗜酸菌曰 鞭毛素曰 原核表达曰 纯化曰 免疫反应
云怎灶糟贼蚤燥灶葬造 葬灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 贼澡藻 枣造葬早藻造造蚤灶 云造蚤悦葬葬葬 枣则燥皂 粤糟蚤凿燥增燥则葬曾 葬增藻灶葬藻 泽怎遭泽责援
葬增藻灶葬藻 蚤灶 藻造蚤糟蚤贼葬贼蚤燥灶 燥枣 蚤皂皂怎灶藻 则藻泽责燥灶泽藻泽 燥枣 则蚤糟藻
蕴蚤怎 再蚤灶早员袁圆 摇 悦澡藻灶 匀怎葬皂蚤灶圆 摇 再怎 匝蚤灶早圆 摇 栽蚤葬灶 云葬灶早圆 摇 蕴怎 郧怎燥凿燥灶早员 摇 匀藻 悦澡藻灶赠葬灶早圆鄢
渊员援 悦燥造造藻早藻 燥枣 孕造葬灶贼 孕则燥贼藻糟贼蚤燥灶袁 云怎躁蚤葬灶 粤早则蚤糟怎造贼怎则藻 葬灶凿 云燥则藻泽贼则赠 哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠袁 云怎扎澡燥怎 猿缘园园园圆袁 云怎躁蚤葬灶 孕则燥增蚤灶糟藻袁 悦澡蚤灶葬曰
圆援 杂贼葬贼藻 运藻赠 蕴葬遭燥则葬贼燥则赠 枣燥则 月蚤燥造燥早赠 燥枣 孕造葬灶贼 阅蚤泽藻葬泽藻泽 葬灶凿 陨灶泽藻糟贼 孕藻泽贼泽袁 陨灶泽贼蚤贼怎贼藻 燥枣 孕造葬灶贼 孕则燥贼藻糟贼蚤燥灶袁
悦澡蚤灶藻泽藻 粤糟葬凿藻皂赠 燥枣 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽袁 月藻蚤躁蚤灶早 员园园员怨猿袁 悦澡蚤灶葬冤
粤遭泽贼则葬糟贼院 栽燥 则藻增藻葬造 贼澡藻 枣怎灶糟贼蚤燥灶泽 燥枣 枣造葬早藻造造蚤灶 云造蚤悦葬葬葬 枣则燥皂 粤糟蚤凿燥增燥则葬曾 葬增藻灶葬藻 泽怎遭泽责援 葬增藻灶葬藻 渊粤葬葬冤 蚤灶
蚤灶凿怎糟贼蚤燥灶 燥枣 蚤皂皂怎灶藻 则藻泽责燥灶泽藻泽 燥枣 则蚤糟藻 葬灶凿 蚤贼泽 凿燥皂葬蚤灶泽袁 贼澡藻 枣造蚤悦葬葬葬 早藻灶藻 糟造燥灶藻凿 枣则燥皂 贼澡藻 泽贼则葬蚤灶 陨孕晕员 燥枣
粤葬葬 憎葬泽 藻曾责则藻泽泽藻凿 蚤灶 耘泽糟澡藻则蚤糟澡蚤葬 糟燥造蚤 泽贼则葬蚤灶 月蕴圆员袁 葬灶凿 贼澡藻 责怎则蚤枣蚤藻凿 责则燥贼藻蚤灶 云造蚤悦葬葬葬 葬灶凿 贼澡藻 贼则怎灶糟葬贼藻凿
责则燥贼藻蚤灶泽 云造蚤悦葬葬葬鄄晕 葬灶凿 云造蚤悦葬葬葬鄄悦 憎藻则藻 葬泽泽葬赠藻凿 枣燥则 蚤灶凿怎糟贼蚤燥灶 燥枣 蚤皂皂怎灶藻 则藻泽责燥灶泽藻泽 蚤灶 则蚤糟藻援 栽澡藻 则藻泽怎造贼泽
泽澡燥憎藻凿 贼澡葬贼 贼澡则藻藻 责怎则蚤枣蚤藻凿 责则燥贼藻蚤灶泽 糟燥怎造凿 蚤灶凿怎糟藻 贼澡藻 蚤皂皂怎灶藻 则藻泽责燥灶泽藻 燥枣 贼澡藻 则蚤糟藻 韵则赠扎葬 泽葬贼蚤增葬 蕴援 糟增援
晕蚤责责燥灶遭葬则藻袁 蚤灶糟造怎凿蚤灶早 澡赠责藻则泽藻灶泽蚤贼蚤增藻 糟藻造造 凿藻葬贼澡 葬灶凿 澡赠凿则燥早藻灶 责藻则燥曾蚤凿藻 渊匀圆韵圆 冤 责则燥凿怎糟贼蚤燥灶袁 憎澡藻灶 贼澡藻则蚤糟藻 造藻葬增藻泽 憎藻则藻 蚤灶燥糟怎造葬贼藻凿 遭赠 蚤灶枣蚤造贼则葬贼蚤燥灶 燥枣 贼澡藻 贼藻泽贼藻凿 责则燥贼藻蚤灶泽援 杂贼则燥灶早藻则 蚤灶凿怎糟藻凿 凿藻枣藻灶泽藻 则藻泽责燥灶泽藻 憎葬泽
枣燥怎灶凿 蚤灶 云造蚤悦葬葬葬鄄贼则藻葬贼藻凿 则蚤糟藻 贼澡葬灶 蚤灶 贼澡燥泽藻 贼则藻葬贼藻凿 憎蚤贼澡 云造蚤悦葬葬葬鄄晕 葬灶凿 云造蚤悦葬葬葬鄄悦援
运藻赠 憎燥则凿泽院 粤糟蚤凿燥增燥则葬曾 葬增藻灶葬藻 泽怎遭泽责援 葬增藻灶葬藻曰 枣造葬早藻造造蚤灶曰 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶曰 责怎则蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶曰 蚤皂皂怎灶藻 则藻泽责燥灶泽藻
摇 摇 在植物要病原物之间长期的互作进化中袁植物
已形成了一种复杂的尧可诱导的尧能够防御病原物入
侵的免疫机制遥 这种免疫机制分为 圆 种免疫反应模
式院病原相关分子模式渊责葬贼澡燥早藻灶鄄葬泽泽燥糟蚤葬贼藻凿 皂燥造藻糟怎鄄
造葬则 责葬贼贼藻则灶袁孕粤酝孕冤激发的免疫反应渊孕粤酝孕鄄贼则蚤早早藻则藻凿
蚤皂皂怎灶蚤贼赠袁孕栽陨冤和效应子激发的免疫反应渊 藻枣枣藻糟贼燥则鄄
贼则蚤早早藻则藻凿 蚤皂皂怎灶蚤贼赠袁耘栽陨冤 渊 悦澡蚤泽澡燥造皂 藻贼 葬造援 袁 圆园园远曰
允燥灶藻泽 驭 阅葬灶早造袁圆园园远冤遥 孕栽陨是在病原物入侵时袁植物
通过对病原物保守的 孕粤酝孕 进行识别袁从而诱发体
内一系列主动防御反应遥 细菌鞭毛素是研究最清楚
的 孕栽陨 诱导因子之一 渊 郧燥皂藻扎鄄郧燥皂藻扎 藻贼 葬造援 袁员怨怨怨曰
郧燥皂藻扎鄄郧燥皂藻扎 驭 月燥造造藻则袁圆园园园冤遥 许多病原细菌鞭毛
素可以诱发植物 孕栽陨袁包括过敏性细胞死亡尧匀圆韵圆
产生尧活性氧爆发和胼胝质沉积等免疫反应渊云藻造蚤曾
藻贼 葬造援 袁员怨怨怨冤遥 在诱发植物 孕栽陨 时袁鞭毛素不同结构
域有不同的诱导效率遥 例如袁鞭毛素 晕 端由保守的
圆圆 个氨基酸组成的多肽 云造早圆圆 比全长蛋白诱导拟南
芥 粤则葬遭蚤凿燥责泽蚤泽 贼澡葬造蚤葬灶葬尧烟草 晕蚤糟燥贼蚤葬灶葬 贼葬遭葬糟怎皂 和番
茄 蕴赠糟燥责藻则泽蚤糟燥灶 藻泽糟怎造藻灶贼怎皂等植物免疫反应的功能更
强袁表明此区段是免疫反应的诱导活性中心渊武晓
丽等袁圆园员员冤遥
研究表明袁来源于谷子的燕麦嗜酸菌 渊 粤糟蚤鄄
凿燥增燥则葬曾 葬增藻灶葬藻 泽怎遭泽责援 葬增藻灶葬藻袁粤葬葬冤菌株 晕员员源员 不
能侵染水稻袁人工接种可导致水稻产生多种免疫
反应袁如过敏性细胞死亡尧匀圆韵圆 产生和防卫基因
表达活化渊栽葬灶葬噪葬 藻贼 葬造援 袁圆园园猿冤遥 从该菌株中直接
分离的鞭毛素蛋白同样能特异性地诱导水稻悬浮
培养细胞产生 孕栽陨渊悦澡藻 藻贼 葬造援 袁圆园园园冤遥 然而袁该蛋
白 晕 端保守 云造早圆圆 片段的 孕栽陨 诱导能力却很弱
渊栽葬噪葬蚤 藻贼 葬造援 袁圆园园愿冤袁推测诱导活性功能域可能位
于 云造早圆圆 以外的某个未知区段遥 转 枣造蚤悦葬葬葬 基因水
稻可表达免疫反应以及对病害的抗性渊栽葬噪葬噪怎则葬 藻贼
葬造援 袁圆园园愿冤遥 此外袁粤葬葬水稻亲和菌株 运员 与不亲和
菌株 晕员员源员 的 云造蚤悦葬葬葬在大肠杆菌中重组表达后袁
二者均能诱导上述相同的 孕栽陨 反应袁表明 云造蚤悦葬葬葬
的 孕栽陨 诱导特异性可能受到糖基化修饰的调控
渊匀蚤则葬蚤 藻贼 葬造援 袁圆园员员冤遥
为了阐明本实验室前期分离获得的 粤葬葬 菌株
陨孕晕员 的 云造蚤悦葬葬葬对水稻细胞 孕栽陨 的诱导作用袁本研
究通过克隆和生物信息学分析了其编码基因 枣造蚤鄄
悦葬葬葬袁在大肠杆菌中原核表达了基因全长尧晕端和 悦
端片段袁获得了纯化蛋白及其截短肽段袁测定了其诱
导水稻细胞死亡和 匀圆韵圆 产生等免疫反应的能力袁
验证了 云造蚤悦葬葬葬蛋白对水稻免疫反应的诱导功能袁以
期为深入揭示其作用机理尧后续研发水稻免疫制剂
提供科学依据和试验材料遥
员 材料与方法
员郾 员 材料
供试菌株院粤葬葬 菌株 陨孕晕员渊悦郧酝悦悦 晕燥援 愿远远员冤尧
表达载体 责耘栽圆愿葬和水稻品种日本晴 韵则赠扎葬 泽葬贼蚤增葬 蕴援
糟增援 晕蚤责责燥灶遭葬则藻由本实验室在 源 益条件下保存曰大肠
杆菌 耘泽糟澡藻则蚤糟澡蚤葬 糟燥造蚤 菌株 阅匀缘琢 和 月蕴圆员 购自北京
天根生化科技有限公司遥 粤葬葬 菌株在 圆愿 益金氏 月
渊运蚤灶早爷泽 月则燥贼澡袁 运月冤培养基上培养曰耘援 糟燥造蚤 菌株在
猿苑 益 蕴月渊造怎则蚤葬鄄遭藻则贼葬灶蚤冤培养基上培养遥
培养基院运月培养基院圆园 早 辕 蕴蛋白胨尧员园 皂蕴 辕 蕴甘
油尧员郾 缘 早 辕 蕴 运圆匀孕韵源尧员郾 缘 早 辕 蕴 酝早杂韵源窑苑匀圆韵曰蕴月培养
基院员园 早 辕 蕴蛋白胨尧缘 早 辕 蕴酵母提取物尧员园 早 辕 蕴 晕葬悦造遥
试剂院栽葬择栽酝阅晕粤聚合酶尧高保真酶 孕则蚤皂藻 杂栽粤砸
酝葬曾 阅晕粤 孕燥造赠皂藻则葬泽藻尧栽源 阅晕粤 蕴蚤早葬泽藻 和各种限制性
内切酶袁宝生物工程渊大连冤有限公司曰胶回收试剂
盒尧核酸和蛋白 酝葬则噪藻则袁北京天根生化科技有限公
司曰牛血清白蛋白渊遭燥增蚤灶藻 泽藻则怎皂 葬造遭怎皂蚤灶袁月杂粤冤定量
试剂盒袁北京康为世纪生物科技有限公司曰蛋白纯化
晕蚤鄄杂藻责澡葬则燥泽藻栽酝填料袁美国 郧藻灶藻则葬造 耘造藻糟贼则蚤糟公司曰克隆
质粒 责酝阅鄄员愿栽袁宝生物工程渊大连冤有限公司曰表达
载体 责悦燥造凿鄄杂哉酝韵袁哈尔滨海基生物公司曰异丙基鄄茁鄄
阅鄄硫代半乳糖甘渊陨孕栽郧冤袁美国 杂蚤早皂葬 公司曰栽则蚤贼燥灶鄄载鄄
员园园 和二氨基联苯胺渊阅粤月冤袁江晨试剂公司遥
抗生素院 缘园 滋早 辕 皂蕴 卡那霉素 渊 噪葬灶葬皂赠糟蚤灶袁
运葬灶冤尧员园园 滋早 辕 皂蕴 氨苄青霉素渊 葬皂责蚤糟蚤造造蚤灶袁粤皂责冤购
自北京中保科农生物科技有限公司遥
仪器院 栽悦鄄缘员圆 型 孕悦砸 仪袁英国 栽藻糟澡灶藻 公司曰
孕燥憎藻则孕葬糟栽酝型电泳仪袁美国 月蚤燥鄄砸葬凿公司曰灾悦载苑缘园 型
超声波破碎仪袁美国 杂燥灶蚤糟泽公司曰杂在载员远 型光学显微
镜袁日本 韵造赠皂责怎泽公司遥
员郾 圆 方法
员郾 圆郾 员 基因克隆及其序列分析
在 晕悦月陨数据库中查找 粤葬葬 基因组中鞭毛素基
因的已知序列 粤栽悦悦员怨愿远园 渊郧藻灶藻 陨阅 员园猿园怨圆缘圆冤和
粤粤悦园园鄄员渊郧藻灶藻 陨阅 源远远缘苑缘愿冤袁用 阅晕粤酝粤晕软件进行
序列比对分析曰根据同源性较高的保守区域袁用
孕则蚤皂藻则 孕则藻皂蚤藻则 缘郾 园 软件设计引物 粤员鄄云 辕 砸渊表 员冤曰以
陨孕晕员 菌株基因组 阅晕粤 为模板袁对鞭毛素基因进行
孕悦砸扩增遥 孕悦砸 引物均由北京华大基因生物公司
合成遥
摇 摇 对 粤员 两端序列进行了分析和鉴定遥 鞭毛素
云造蚤悦葬葬葬上游是鞭毛钩蛋白袁下游是基因序列不完全
相同的鞭毛素蛋白渊图 员冤遥 根据 圆 个鞭毛素蛋白基
因之间的非编码区以及鞭毛素蛋白基因和鞭毛钩蛋
白基因之间非编码区的保守性袁设计引物 粤员晕鄄云 辕 砸
和 粤员悦鄄云 辕 砸渊表 员冤袁孕悦砸 扩增出包含 枣造蚤悦葬葬葬 缘忆端
粤员晕基因片段和 猿忆端 粤员悦 基因片段渊图 员冤遥 孕悦砸
扩增产物进行 员豫琼脂糖凝胶电泳检测袁用凝胶回
收纯化试剂盒进行纯化回收袁与 责酝阅鄄员愿栽 载体在
苑远员 期 刘摇 莹等院 鞭毛素蛋白 云造蚤悦葬葬葬诱导水稻免疫反应的活性测定
摇 摇 摇 表 员 本研究所用的引物
栽葬遭造藻 员 孕则蚤皂藻则泽 怎泽藻凿 蚤灶 贼澡藻 泽贼怎凿赠
引物
孕则蚤皂藻则 灶葬皂藻
引物序列渊缘忆鄄猿忆冤
孕则蚤皂藻则 泽藻择怎藻灶糟藻
退火温度渊益冤
粤灶灶藻葬造蚤灶早 贼藻皂责藻则葬贼怎则藻
限制性内切酶
砸藻泽贼则蚤糟贼蚤燥灶 藻灶扎赠皂藻
粤员晕鄄云 辕 砸 粤栽郧郧悦粤栽悦悦粤悦悦粤栽悦粤粤悦粤悦
栽悦粤悦栽栽悦粤郧悦粤郧郧郧粤悦粤郧悦粤
缘缘 原
粤员鄄云 辕 砸 郧悦栽郧郧郧粤粤悦粤粤粤悦粤栽栽粤悦栽郧悦悦
粤栽郧悦郧郧栽悦悦粤栽栽栽悦悦郧粤悦粤郧
缘苑 原
粤员悦鄄云 辕 砸 栽悦郧粤郧粤悦郧粤悦郧郧栽郧粤粤悦粤粤悦
郧郧栽栽悦栽郧悦粤悦悦栽郧悦粤悦郧栽栽郧
缘缘 原
枣造蚤悦葬葬葬鄄云 辕 砸 粤栽郧郧悦粤栽悦悦粤悦悦粤栽悦粤粤悦粤悦
栽悦粤粤悦郧悦粤郧悦粤郧郧郧粤悦粤粤悦粤
源远 原
枣造蚤悦葬葬葬鄄云圆 辕 砸圆 悦郧郧郧粤栽悦悦粤栽郧郧悦粤栽悦悦粤悦悦粤栽悦粤粤悦粤悦
悦悦粤粤郧悦栽栽栽悦粤粤悦郧悦粤郧悦粤郧郧郧粤悦粤粤悦粤
源远 月葬皂匀 玉
匀蚤灶凿 芋
枣造蚤悦葬葬葬鄄晕鄄云 辕 砸 悦郧郧郧粤栽悦悦粤栽郧粤栽悦粤粤悦粤悦悦粤粤悦粤栽悦粤郧悦
悦悦粤粤郧悦栽栽栽栽粤郧粤粤郧郧粤郧悦悦郧栽悦悦粤粤悦粤
缘源 月葬皂匀 玉
匀蚤灶凿 芋
枣造蚤悦葬葬葬鄄悦鄄云 辕 砸 悦郧郧郧粤栽悦悦粤栽郧栽栽郧粤粤郧粤栽悦粤栽悦郧粤悦郧悦
悦悦粤粤郧悦栽栽栽栽粤悦粤郧悦粤郧郧郧粤悦粤粤悦粤悦郧悦
缘缘 月葬皂匀 玉
匀蚤灶凿 芋
摇 摇 下划线为限制性内切酶位点遥 砸藻泽贼则蚤糟贼蚤燥灶 藻灶扎赠皂藻 泽蚤贼藻泽 葬则藻 怎灶凿藻则造蚤灶藻凿援
员远 益下连接过夜曰通过热击法袁将连接产物转化至
耘援 糟燥造蚤 阅匀缘琢感受态细胞中袁获得阳性质粒袁经测序
确认遥
图 员 引物设计示意图
云蚤早援 员 孕则蚤皂藻则 凿藻泽蚤早灶 蚤灶 贼澡蚤泽 泽贼怎凿赠
粤员院 含有鞭毛素基因的 阅晕粤片段曰 粤员悦院 含有鞭毛素
基因 猿忆端的 阅晕粤 片段曰 粤员晕院 含有鞭毛素基因 缘忆端的
阅晕粤片段遥 粤员院 阅晕粤 枣则葬早皂藻灶贼 糟燥灶贼葬蚤灶蚤灶早 贼澡藻 枣造葬早藻造造蚤灶 早藻灶藻曰
粤员悦院 阅晕粤 枣则葬早皂藻灶贼 糟燥灶贼葬蚤灶蚤灶早 猿忆 贼藻则皂蚤灶葬造 燥枣 贼澡藻 枣造葬早藻造造蚤灶
早藻灶藻曰 粤员晕院 阅晕粤 枣则葬早皂藻灶贼 糟燥灶贼葬蚤灶蚤灶早 缘忆 贼藻则皂蚤灶葬造 燥枣 贼澡藻
枣造葬早藻造造蚤灶 早藻灶藻援
摇
根据得到的 缘忆和 猿忆端的基因序列袁设计引物 枣造蚤鄄
悦葬葬葬鄄云 辕 砸渊表 员冤袁孕悦砸 扩增 枣造蚤悦葬葬葬 全长基因袁纯化
回收扩增产物袁与 责酝阅鄄员愿栽 载体连接袁将连接产物
转化至大肠杆菌感受态细胞中袁获得阳性质粒
责酝阅员愿栽鄄枣造蚤悦葬葬葬袁经测序确认获得 枣造蚤悦葬葬葬 的基因
序列遥
以质粒 责酝阅员愿栽鄄枣造蚤悦葬葬葬 为模板袁设计引物 枣造蚤鄄
悦葬葬葬鄄云圆 辕 砸圆尧 枣造蚤悦葬葬葬鄄晕鄄云 辕 砸 和 枣造蚤悦葬葬葬鄄悦鄄云 辕 砸 渊表
员冤袁扩增全长尧晕 端和 悦 端保守结构域 猿 个基因片
段袁回收尧连接至 责酝阅鄄员愿栽 载体上尧测序袁得到含酶
切位点的阳性质粒 责酝阅员愿鄄栽鄄枣造蚤悦葬葬葬尧责酝阅员愿鄄栽鄄枣造蚤鄄
悦葬葬葬鄄晕和 责酝阅员愿鄄栽鄄枣造蚤悦葬葬葬鄄悦遥
用 阅晕粤酝粤晕软件对 云造蚤悦葬葬葬与同一亚种内 源 个
已知序列同源性比对分析曰通过 月蕴粤杂栽 渊 澡贼贼责院 辕 辕
遭造葬泽贼援 灶糟遭蚤援 灶造皂援 灶蚤澡援 早燥增 辕 月造葬泽贼援 糟早蚤 冤 和 耘曾责葬泽赠 渊 澡贼鄄
贼责院 辕 辕 憎藻遭援 藻曾责葬泽赠援 燥则早 辕 糟燥皂责怎贼藻赃责蚤 辕 冤对 云造蚤悦葬葬葬 保守
结构域和分子量进行预测分析遥
员郾 圆郾 圆 重组表达载体的构建和转化
根据 云造蚤悦葬葬葬蛋白保守结构域袁对蛋白进行截短
分段表达遥 用限制性内切酶 月葬皂匀 玉和 匀蚤灶凿 芋分
别对 质 粒 责酝阅员愿鄄栽鄄枣造蚤悦葬葬葬尧 责酝阅员愿鄄栽鄄枣造蚤悦葬葬葬鄄晕尧
责酝阅员愿鄄栽鄄枣造蚤悦葬葬葬鄄悦 和表达载体 责耘栽圆愿葬尧责悦燥造凿鄄杂哉鄄
酝韵进行双酶切袁回收酶切产物遥 将回收片段 枣造蚤鄄
悦葬葬葬和载体 责耘栽圆愿葬用 栽源 阅晕粤 蕴蚤葬早泽藻在 员远 益下连
接过夜曰分别将回收片段 枣造蚤悦葬葬葬鄄晕 和 枣造蚤悦葬葬葬鄄悦 与
载体 责悦燥造凿鄄杂哉酝韵用 栽源 阅晕粤 蕴蚤葬早泽藻在 员远 益下连接
过夜曰通过热击法袁将上述重组表达载体转化至 耘援
糟燥造蚤菌株 月蕴圆员 感受态细胞中袁涂布于加有相应抗生
素的培养基平板上袁对筛选的转化子质粒提取和酶
切验证袁得到阳性克隆 责耘栽圆愿葬鄄枣造蚤悦葬葬葬尧 责悦燥造凿鄄杂哉鄄
酝韵鄄枣造蚤悦葬葬葬鄄晕和 责悦燥造凿鄄杂哉酝韵鄄枣造蚤悦葬葬葬鄄悦遥
员郾 圆郾 猿 蛋白原核表达和纯化
挑取 耘援 糟燥造蚤 月蕴圆员渊责耘栽圆愿葬鄄枣造蚤悦葬葬葬冤菌落接种于
含有 蕴月 垣 运葬灶 的培养基中曰挑取 月蕴圆员 渊 责悦燥造凿鄄杂哉鄄
酝韵鄄枣造蚤悦葬葬葬鄄晕冤和 月蕴圆员 渊 责悦燥造凿鄄杂哉酝韵鄄枣造蚤悦葬葬葬鄄悦冤单
菌落接种至 蕴月 垣 粤皂责 培养基中曰在 猿苑 益尧圆园园 则 辕
愿远 植摇 物摇 保摇 护摇 学摇 报 源圆 卷
皂蚤灶条件下培养至菌液 韵阅 越 园郾 远 耀 园郾 愿遥 加入终浓
度为 园郾 缘 皂皂燥造 辕 蕴的 陨孕栽郧袁月蕴圆员渊责耘栽圆愿葬鄄枣造蚤悦葬葬葬冤在
员园 益尧员缘园 则 辕 皂蚤灶条件下诱导 圆源 澡曰月蕴圆员渊责悦燥造凿鄄杂哉鄄
酝韵鄄枣造蚤悦葬葬葬鄄晕冤尧月蕴圆员渊责悦燥造凿鄄杂哉酝韵鄄枣造蚤悦葬葬葬鄄悦冤在 员缘
益尧员缘园 则 辕 皂蚤灶条件下诱导 圆源 澡遥 离心收集菌体袁重
悬细胞袁至于冰上超声破碎袁离心取上清袁经 杂阅杂鄄
孕粤郧耘 凝胶电泳和考马斯亮蓝 渊 糟燥燥皂葬泽泽蚤藻 遭则蚤造造蚤葬灶贼
遭造怎藻冤染色袁检测蛋白的表达情况遥 用 匀蚤泽 标签蛋白
纯化树脂镍柱纯化蛋白渊再葬灶早 藻贼 葬造援 袁圆园员圆冤遥
员郾 圆郾 源 云造蚤悦葬葬葬诱导水稻细胞死亡和 匀圆韵圆 产生的检测
参考 郧藻则 藻贼 葬造援 渊圆园园圆冤叶细胞死亡检测法袁将 员园
滋皂燥造 辕 蕴纯化蛋白用 员 皂蕴无针头注射器润浸接种到
生长 员源 凿 的日本晴水稻叶片袁以 员园 皂皂燥造 辕 蕴 栽则蚤泽鄄
匀悦造 渊责匀 苑郾 源冤 缓冲液作为对照遥 接种 圆源 澡后袁取 猿
耀 缘 糟皂长度的接种叶片组织袁置于台酚蓝溶液渊台
酚蓝 员园 皂早尧乙醇 圆园 皂蕴尧栽则蚤泽饱和酚 员园 皂蕴尧乳酸 员园
皂蕴尧凿匀圆韵圆员园 皂蕴冤袁煮沸 圆 耀 猿 皂蚤灶袁用 圆郾 缘 早 辕 皂蕴水合
氯醛溶液脱色袁后用清水冲洗袁在光学显微镜下
观察遥
参考 云蚤贼扎早藻则葬造凿 藻贼 葬造援 渊圆园园源冤匀圆韵圆 产生检测法袁
将 员园 滋皂燥造 辕 蕴纯化蛋白用 员 皂蕴 无针头注射器润浸
接种到生长 员源 凿 的日本晴水稻叶片袁以 员园 皂皂燥造 辕 蕴
的 栽则蚤泽鄄匀悦造 渊责匀 苑郾 源冤缓冲液作为对照遥 接种 圆源 澡
后袁取接种叶片组织袁置于含 园郾 园员豫 栽则蚤贼燥灶鄄载鄄员园园 和
员 皂早 辕 皂蕴二氨基联苯胺渊阅粤月冤的水溶液中袁在室温
下过夜孵育曰将叶片浸入在乙醇 原乳酸 原酚渊怨缘豫
乙醇 颐乳酸 颐 栽则蚤泽饱和酚 越 圆 颐 员 颐 员冤中袁在 远缘 益下水
浴 猿园 皂蚤灶后袁用乙醇冲洗袁再用清水冲洗后袁在光学
显微镜下观察遥
圆 结果与分析
圆郾 员 枣造蚤悦葬葬葬基因克隆以及生物信息学分析
以 粤葬葬菌株 陨孕晕员 基因组 阅晕粤 为模板袁用特异
性引物 粤员鄄云 辕 砸袁孕悦砸扩增成功获得 员 源苑怨 遭责的基因
片段 粤员渊图 圆鄄葬冤遥 根据鞭毛钩状基因和鞭毛蛋白
基因之间的非编码区和 圆 个鞭毛蛋白基因之间非编
码区的保守性袁用特异性引物 粤员晕鄄云 辕 砸和 粤员悦鄄云 辕 砸
通过 孕悦砸扩增成功获得 远怨缘 遭责和 苑圆圆 遭责的基因片
段 粤员晕和 粤员悦渊图 圆鄄遭袁糟冤袁获得了包含 枣造蚤悦葬葬葬基因
缘忆端和 猿忆端的 圆 个基因片段遥 根据这 圆 个基因序
列袁设计特异性引物 枣造蚤悦葬葬葬鄄云 辕 砸袁 孕悦砸 扩增获得
员 源苑怨 遭责的鞭毛素基因 枣造蚤悦葬葬葬渊图 圆鄄凿冤遥
图 圆 鞭毛素蛋白 云造蚤悦葬葬葬基因片段 孕悦砸扩增
云蚤早援 圆 孕悦砸 葬皂责造蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 阅晕粤 枣则葬早皂藻灶贼泽 糟燥灶贼葬蚤灶蚤灶早 贼澡藻 枣造葬早藻造造蚤灶 早藻灶藻 枣则燥皂 粤糟蚤凿燥增燥则葬曾 葬增藻灶葬藻 泽怎遭泽责援 葬增藻灶葬藻
摇 摇 酝院 员噪遭 责造怎泽 阅晕粤 造葬凿凿藻则曰 员院 粤员曰 圆院 粤员晕曰 猿院 粤员悦曰 源院 枣造蚤悦葬葬葬援
摇
摇 摇 生物信息学分析表明袁枣造蚤悦葬葬葬 基因完整开放阅
读框为 员 源苑怨 遭责袁编码 源怨圆 个氨基酸袁分子量 源怨郾 源
噪阅遥 云造蚤悦葬葬葬 蛋白具有 枣造葬早藻造造蚤灶鄄晕 渊缘 耀 员源圆粤粤冤 和
枣造葬早藻造造蚤灶鄄悦渊源园远 耀 源怨员粤粤冤圆 个保守结构域遥 序列同
源性分析表明袁云造蚤悦葬葬葬蛋白在不同亚种菌株中的序
列相似性高达 怨愿郾 猿猿豫 遥
圆郾 圆 云造蚤悦葬葬葬蛋白表达载体构建尧表达和纯化
将 云造蚤悦葬葬葬蛋白全长尧晕 端渊缘 耀 员源圆粤粤冤和 悦 端
渊源园远 耀 源怨员粤粤冤进行原核表达遥 以质粒 责酝阅员愿栽鄄枣造蚤鄄
悦葬葬葬为模板袁用特异性引物进行 孕悦砸 扩增袁分别获
得了 员 源苑怨尧源员源 和 圆缘愿 遭责基因片段渊图 猿鄄葬冤遥 将测
序正确的基因片段定向克隆至表达载体上袁得到重
组表达质粒 责耘栽圆愿葬鄄枣造蚤悦葬葬葬尧责悦燥造凿鄄杂哉酝韵鄄枣造蚤悦葬葬葬鄄晕
和 责悦燥造凿鄄杂哉酝韵鄄枣造蚤悦葬葬葬鄄悦遥 经过 月葬皂匀玉和 匀蚤灶凿 芋
双酶切验证遥 将重组质粒转化至大肠杆菌菌株
月蕴圆员 细胞中诱导表达袁分别得到了 云造蚤悦葬葬葬 渊缘员
噪阅冤尧云造蚤悦葬葬葬鄄晕渊猿员 噪阅冤和 云造蚤悦葬葬葬鄄悦渊圆远 噪阅冤可溶性
融合蛋白渊图 猿鄄遭冤遥
圆郾 猿 云造蚤悦葬葬葬对水稻细胞死亡和匀圆韵圆 产生的诱导作用
用上述纯化蛋白接种到水稻叶片组织袁用台酚
怨远员 期 刘摇 莹等院 鞭毛素蛋白 云造蚤悦葬葬葬诱导水稻免疫反应的活性测定
图 猿 鞭毛素蛋白 云造蚤悦葬葬葬的原核表达和纯化
云蚤早援 猿 耘曾责则藻泽泽蚤燥灶 葬灶凿 责怎则蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 云造蚤悦葬葬葬
蚤灶 耘泽糟澡藻则蚤糟澡蚤葬 糟燥造蚤
葬院 鞭毛素 云造蚤悦葬葬葬及其截短片段的基因克隆曰 遭院 纯化蛋
白的 杂阅杂鄄孕粤郧耘 分析遥 葬院 悦造燥灶蚤灶早 燥枣 云造蚤悦葬葬葬袁 枣造蚤悦葬葬葬鄄晕 葬灶凿
枣造蚤悦葬葬葬鄄悦援 酝院 员 噪遭 责造怎泽 阅晕粤 造葬凿凿藻则曰 员院 枣造蚤悦葬葬葬曰 圆院 枣造蚤悦葬葬葬鄄
晕曰 猿院 枣造蚤悦葬葬葬鄄悦援 遭院 杂阅杂鄄孕粤郧耘 燥枣 贼澡藻 责怎则蚤枣蚤藻凿 责则燥贼藻蚤灶泽援 酝院
责则燥贼藻蚤灶 皂葬则噪藻则曰 员院 云造蚤悦葬葬葬曰 圆院 云造蚤悦葬葬葬鄄晕曰 猿院 云造蚤悦葬葬葬鄄悦援
摇
蓝染色法检测水稻细胞死亡遥 结果显示袁云造蚤悦葬葬葬 蛋
白尧云造蚤悦葬葬葬鄄晕 和 云造蚤悦葬葬葬鄄悦 截短蛋白均能显著诱导
水稻细胞死亡袁且 云造蚤悦葬葬葬 蛋白诱导能力大于 云造蚤鄄
悦葬葬葬鄄晕和 云造蚤悦葬葬葬鄄悦肽段袁而 栽则蚤泽鄄匀悦造 缓冲液和 杂哉鄄
酝韵标签蛋白对照处理无诱导作用渊图 源冤遥
图 源 鞭毛素 云造蚤悦葬葬葬及其截短蛋白对水稻叶片细胞死亡和 匀圆韵圆 产生的诱导作用
云蚤早援 源 匀赠责藻则泽藻灶泽蚤贼蚤增藻 糟藻造造 凿藻葬贼澡 葬灶凿 匀圆韵圆 责则燥凿怎糟贼蚤燥灶 蚤灶凿怎糟藻凿 遭赠 云造蚤悦葬葬葬 葬灶凿 贼则怎灶糟葬贼藻凿 责则燥贼藻蚤灶泽 蚤灶 则蚤糟藻 造藻葬增藻泽
用纯化蛋白接种到水稻叶组织袁用 阅粤月 染色法
检测 匀圆韵圆 产生遥 有 匀圆韵圆 产生的叶片沿叶脉出现
红褐色沉积物袁颜色越深袁扩展面积越大袁表明诱导
能力越强遥 结果显示袁 云造蚤悦葬葬葬 蛋白尧 云造蚤悦葬葬葬鄄晕 和
云造蚤悦葬葬葬鄄悦截短蛋白均能显著诱导水稻细胞 匀圆韵圆 产
生袁云造蚤悦葬葬葬蛋白诱导能力大于 云造蚤悦葬葬葬鄄晕 和 云造蚤悦葬葬葬鄄
悦肽段袁而 栽则蚤泽鄄匀悦造 缓冲液和 杂哉酝韵 标签蛋白对照
处理无诱导作用渊图 源冤遥
猿 讨论
据 悦澡藻 藻贼 葬造援 渊圆园园园冤报道袁粤葬葬 水稻非致病菌株
晕员员源员 接种水稻后袁可导致水稻悬浮细胞死亡尧活性
氧猝发和 匀圆韵圆 产生等防卫反应遥 本实验室分离到员 株水稻非致病菌株 陨孕晕员袁其鞭毛素蛋白也能够引
起水稻免疫反应袁具有用于水稻免疫诱导制剂研发
的潜能遥 由于 云造蚤悦葬葬葬 蛋白不存在翻译后修饰作用
渊栽葬噪葬蚤 藻贼 葬造援 袁圆园园愿曰 匀蚤则葬蚤 藻贼 葬造援 袁圆园员员冤袁本研究对鞭
毛素基因进行克隆尧分段原核表达和纯化以及表达
蛋白的 孕栽陨诱导活性测定遥 发现鞭毛素 云造蚤悦葬葬葬 蛋
白能够引起水稻细胞死亡和 匀圆韵圆 产生的免疫反
应遥 因此袁粤葬葬菌株 陨孕晕员 及其鞭毛素蛋白可作为水
稻免疫诱导制剂研发的出发菌株和试验材料遥
病原细菌鞭毛素通常存在 孕栽陨 诱导活性中心袁
如位于 晕端的 云造早圆圆 短肽被认为是激发植物细胞抗
性反应的关键区段渊武晓丽等袁圆园员员冤遥 然而袁能够
诱导拟南芥尧烟草和番茄等植物的细菌鞭毛素及其
云造早圆圆 均不能激发水稻细胞的防卫反应 渊 云藻造蚤曾 藻贼
葬造援 袁员怨怨怨曰 栽葬噪葬蚤 藻贼 葬造援 袁圆园园愿冤袁表明这些植物鞭毛素
诱导水稻 孕栽陨反应机制与其它植物不同袁其诱导活
性中心不是 云造早圆圆遥 本研究将鞭毛素 云造蚤悦葬葬葬蛋白进
行了 晕 端和 悦 端截短表达袁并验证了 孕栽陨 诱导活
性遥 发现无论是表达的全长蛋白还是截短肽段袁均
能显著诱导水稻细胞死亡和 匀圆韵圆 产生的免疫反
应遥 表明 云造蚤悦葬葬葬蛋白具有水稻 孕栽陨 活性诱导的多
个位点遥 另外袁云造蚤悦葬葬葬蛋白诱导能力大于 云造蚤悦葬葬葬鄄晕
和 云造蚤悦葬葬葬鄄悦肽段袁可能是后二者活性位点不完整袁
导致了诱导活性略为减弱袁仍需要对其活性位点进
园苑 植摇 物摇 保摇 护摇 学摇 报 源圆 卷
行深入的探究遥
此外袁匀蚤则葬蚤 藻贼 葬造援 渊圆园员员冤采用超高速离心法直
接提取鞭毛蛋白遥 但此法对试验仪器和超速离心条
件等要求严格袁而且在技术上大规模批量提取比较
困难遥 伍甜等渊圆园员猿冤通过震荡尧丙酮沉淀和离子交
换层析法对 粤葬葬鞭毛素进行提纯袁提纯蛋白具有生
物活性袁是从 粤葬葬中直接提取鞭毛素的一种有效方
法遥 本研究通过在大肠杆菌中原核表达袁进行大规
模蛋白表达和纯化袁为将来批量化制备新型水稻免
疫诱导剂提供了技术支持遥
参 考 文 献 渊砸藻枣藻则藻灶糟藻泽冤
悦澡藻 云杂袁 晕葬噪葬躁蚤皂葬 再袁 栽葬灶葬噪葬 晕袁 陨憎葬灶燥 酝袁 再燥泽澡蚤凿葬 栽袁 栽葬噪葬赠葬皂葬
杂袁 运葬凿燥贼葬 陨袁 陨泽燥早葬蚤 粤援 圆园园园援 云造葬早藻造造蚤灶 枣则燥皂 葬灶 蚤灶糟燥皂责葬贼蚤遭造藻
泽贼则葬蚤灶 燥枣 孕泽藻怎凿燥皂燥灶葬泽 葬增藻灶葬藻 蚤灶凿怎糟藻泽 葬 则藻泽蚤泽贼葬灶糟藻 则藻泽责燥灶泽藻 蚤灶
糟怎造贼怎则藻凿 则蚤糟藻 糟藻造造泽援 允燥怎则灶葬造 燥枣 月蚤燥造燥早蚤糟葬造 悦澡藻皂蚤泽贼则赠袁 圆苑缘渊源员冤院
猿圆猿源苑 原 猿圆猿缘远
悦澡蚤泽澡燥造皂 杂栽袁 悦燥葬噪藻则 郧袁 阅葬赠 月袁 杂贼葬泽噪葬憎蚤糟扎 月允援 圆园园远援 匀燥泽贼鄄皂蚤鄄
糟则燥遭藻 蚤灶贼藻则葬糟贼蚤燥灶泽院 泽澡葬责蚤灶早 贼澡藻 藻增燥造怎贼蚤燥灶 燥枣 贼澡藻 责造葬灶贼 蚤皂皂怎灶藻
则藻泽责燥灶泽藻援 悦藻造造袁 员圆源院 愿园猿 原 愿员源
云藻造蚤曾 郧袁 阅怎则葬灶 允阅袁 灾燥造噪燥 杂袁 月燥造造藻则 栽援 员怨怨怨援 孕造葬灶贼泽 澡葬增藻 葬 泽藻灶泽蚤鄄
贼蚤增藻 责藻则糟藻责贼蚤燥灶 泽赠泽贼藻皂 枣燥则 贼澡藻 皂燥泽贼 糟燥灶泽藻则增藻凿 凿燥皂葬蚤灶 燥枣 遭葬糟贼藻则蚤鄄
葬造 枣造葬早藻造造蚤灶援 栽澡藻 孕造葬灶贼 允燥怎则灶葬造袁 员愿渊猿冤院 圆远缘 原 圆苑远
云蚤贼扎早藻则葬造凿 匀粤袁 悦澡藻则灶 酝杂袁 晕葬增葬则则藻 砸袁 砸燥灶葬造凿 孕悦援 圆园园源援 韵增藻则藻曾鄄
责则藻泽泽蚤燥灶 燥枣 渊粤贼冤 晕孕砸员 蚤灶 则蚤糟藻 造藻葬凿泽 贼燥 葬 月栽匀鄄葬灶凿 藻灶增蚤则燥灶皂藻灶贼鄄
蚤灶凿怎糟藻凿 造藻泽蚤燥灶鄄皂蚤皂蚤糟 辕 糟藻造造 凿藻葬贼澡 责澡藻灶燥贼赠责藻援 酝燥造藻糟怎造葬则 孕造葬灶贼鄄
酝蚤糟则燥遭藻 陨灶贼藻则葬糟贼蚤燥灶泽袁 员苑渊圆冤院 员源园 原 员缘员
郧藻则 酝允袁 悦澡藻灶 悦匀袁 匀憎葬灶早 杂再援 圆园园圆援 悦燥灶泽贼蚤贼怎贼蚤增藻 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 燥枣
澡则葬责 早藻灶藻 蚤灶 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 贼燥遭葬糟糟燥 责造葬灶贼 藻灶澡葬灶糟藻泽 则藻泽蚤泽贼葬灶糟藻 葬鄄
早葬蚤灶泽贼 增蚤则怎造藻灶贼 遭葬糟贼藻则蚤葬造 责葬贼澡燥早藻灶泽 遭赠 蚤灶凿怎糟贼蚤燥灶 燥枣 葬 澡赠责藻则泽藻灶泽蚤鄄
贼蚤增藻 则藻泽责燥灶泽藻援 酝燥造藻糟怎造葬则 孕造葬灶贼鄄酝蚤糟则燥遭藻 陨灶贼藻则葬糟贼蚤燥灶泽袁 员缘 渊愿冤院
苑远源 原 苑苑猿
郧燥皂藻扎鄄郧燥皂藻扎 蕴袁 月燥造造藻则 栽援 圆园园园援 云蕴杂圆院 葬灶 蕴砸砸 则藻糟藻责贼燥则鄄造蚤噪藻 噪蚤鄄
灶葬泽藻 蚤灶增燥造增藻凿 蚤灶 贼澡藻 责藻则糟藻责贼蚤燥灶 燥枣 贼澡藻 遭葬糟贼藻则蚤葬造 藻造蚤糟蚤贼燥则 枣造葬早藻造造蚤灶
蚤灶 粤则葬遭蚤凿燥责泽蚤泽援 酝燥造藻糟怎造葬则 悦藻造造袁 缘渊远冤院 员园园猿 原 员园员员
郧燥皂藻扎鄄郧燥皂藻扎 蕴袁 云藻造蚤曾 郧袁 月燥造造藻则 栽援 员怨怨怨援 粤 泽蚤灶早造藻 造燥糟怎泽 凿藻贼藻则鄄
皂蚤灶藻泽 泽藻灶泽蚤贼蚤增蚤贼赠 贼燥 遭葬糟贼藻则蚤葬造 枣造葬早藻造造蚤灶 蚤灶 粤则葬遭蚤凿燥责泽蚤泽 贼澡葬造蚤葬灶葬援
栽澡藻 孕造葬灶贼 允燥怎则灶葬造袁 员愿渊猿冤院 圆苑苑 原 圆愿源
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造蚤灶援 允燥怎则灶葬造 燥枣 月蚤燥造燥早蚤糟葬造 悦澡藻皂蚤泽贼则赠袁 圆愿远渊圆怨冤院 圆缘缘员怨 原 圆缘缘猿园
允燥灶藻泽 允阅袁 阅葬灶早造 允蕴援 圆园园远援 栽澡藻 责造葬灶贼 蚤皂皂怎灶藻 泽赠泽贼藻皂援 晕葬贼怎则藻袁 源源源院
猿圆猿 原 猿圆怨
栽葬噪葬蚤 砸粤袁 栽葬噪葬赠葬皂葬 杂袁 悦澡藻 云杂援 圆园园愿援 粤灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 枣造葬早藻造造蚤灶 责藻则糟藻责鄄
贼蚤燥灶 皂藻凿蚤葬贼藻凿 遭赠 枣造早圆圆 则藻糟藻责贼燥则 韵泽云蕴杂圆 蚤灶 则蚤糟藻援 酝燥造藻糟怎造葬则
孕造葬灶贼鄄酝蚤糟则燥遭藻 陨灶贼藻则葬糟贼蚤燥灶泽袁 圆员渊员圆冤院 员远猿缘 原 员远源圆
栽葬噪葬噪怎则葬 再袁 悦澡藻 云杂袁 陨泽澡蚤凿葬 再袁 栽泽怎贼泽怎皂蚤 云袁 运怎则燥贼葬灶蚤 运陨袁 哉泽葬皂蚤 杂袁
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早藻灶藻 贼则蚤早早藻则泽 责造葬灶贼 蚤皂皂怎灶藻 则藻泽责燥灶泽藻泽 葬灶凿 糟燥灶枣藻则泽 凿蚤泽藻葬泽藻 则藻泽蚤泽贼鄄
葬灶糟藻 蚤灶 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 则蚤糟藻 责造葬灶贼泽援 酝燥造藻糟怎造葬则 孕造葬灶贼 孕葬贼澡燥造燥早赠袁 怨
渊源冤院 缘圆缘 原 缘圆怨
栽葬灶葬噪葬 晕袁 悦澡藻 云杂袁 宰葬贼葬灶葬遭藻 晕袁 云怎躁蚤憎葬则葬 杂袁 栽葬噪葬赠葬皂葬 杂袁 陨泽燥早葬蚤
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葬增藻灶葬藻 皂藻凿蚤葬贼藻泽 匀圆韵圆 早藻灶藻则葬贼蚤燥灶 葬糟糟燥皂责葬灶赠蚤灶早 澡赠责藻则泽藻灶泽蚤贼蚤增藻
糟藻造造 凿藻葬贼澡 葬灶凿 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 燥枣 孕粤蕴袁 悦澡贼鄄员袁 葬灶凿 孕月在员袁 遭怎贼 灶燥贼 燥枣
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凿燥增燥则葬曾 葬增藻灶葬藻 泽怎遭泽责援 葬增藻灶葬藻 泽贼则葬蚤灶 晕月园园员援 月蚤燥贼藻糟澡灶燥造燥早赠 月怎造鄄
造藻贼蚤灶袁 渊苑冤院 苑愿 原 愿员 渊蚤灶 悦澡蚤灶藻泽藻冤 咱伍甜袁 刘莹袁 余超袁 边强袁
田芳袁 黄琼袁 陈华民袁 何晨阳援 圆园员猿援 燕麦嗜酸菌鞭毛素的
提纯及其生物活性检测援 生物技术通报袁 渊苑冤院 苑愿 原 愿员暂
宰怎 载蕴袁 悦澡藻灶 匀酝袁 宰怎 酝杂袁 匀藻 悦再援 圆园员员援 云造葬早藻造造蚤灶 泽蚤早灶葬造造蚤灶早 蚤灶
责造葬灶贼 凿藻枣藻灶泽藻 则藻泽责燥灶泽藻泽援 孕造葬灶贼 孕则燥贼藻糟贼蚤燥灶袁 猿苑渊猿冤院 员圆 原 员远 渊蚤灶
悦澡蚤灶藻泽藻冤 咱武晓丽袁 陈华民袁 吴茂森袁 何晨阳援 圆园员员援 细菌
鞭毛素对植物免疫防卫反应及其信号机制的激发援 植物保
护袁 猿苑渊猿冤院 员圆 原 员远暂
再葬灶早 云匀袁 栽蚤葬灶 云袁 杂怎灶 蕴袁 悦澡藻灶 匀酝袁 宰怎 酝杂袁 再葬灶早 悦匀袁 匀藻 悦再援
圆园员圆援 粤 灶燥增藻造 贼憎燥鄄糟燥皂责燥灶藻灶贼 泽赠泽贼藻皂 孕凿藻运 辕 孕凿藻砸 则藻早怎造葬贼藻泽 糟鄄
凿蚤鄄郧酝孕 贼怎则灶燥增藻则 葬灶凿 增蚤则怎造藻灶糟藻 燥枣 载葬灶贼澡燥皂燥灶葬泽 燥则赠扎葬藻 责增援
燥则赠扎葬藻援 酝燥造藻糟怎造葬则 孕造葬灶贼鄄酝蚤糟则燥遭藻 陨灶贼藻则葬糟贼蚤燥灶泽袁 圆缘渊员园冤院 员猿远员 原
员猿远怨
渊责任编辑院高摇 峰冤
员苑员 期 刘摇 莹等院 鞭毛素蛋白 云造蚤悦葬葬葬诱导水稻免疫反应的活性测定