全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ　 ４５(２): １５１￣１５７(２０１５)
收稿日期: ２０１４￣０３￣１１ꎻ 修回日期: ２０１４￣１２￣１９
基金项目: 国家“８６３”计划项目(２０１２ＡＡ１０１５０４)ꎻ国家“９７３”计划项目(２０１１ＣＢ１００７００)
通讯作者: 何晨阳ꎬ研究员ꎬ主要从事分子植物病理学研究ꎻＥ￣ｍａｉｌ: ｃｙｈｅ＠ｃａａｓ.ｎｅｔ.ｃｎ
共同第一作者: 刘维振ꎬ男ꎬ博士研究生ꎬ研究方向为植物抗病性分子机制ꎻＥ￣ｍａｉｌ: ｗｅｉｚｈｅｎ５１０＠１６３.ｃｏｍꎻ
陈华民ꎬ 男ꎬ博士ꎬ硕士生导师ꎬ 研究方向为植物抗病性分子机制ꎻＥ￣ｍａｉｌ: ｈｍｃｈｅｎ＠ ｉｐｐｃａａｓ.ｃｎꎮ
ｄｏｉ:１０.１３９２６ / ｊ.ｃｎｋｉ.ａｐｐｓ.２０１５.０２.００５
鞭毛素蛋白 ＦｌｉＣｘｃｖ对水稻免疫反应的诱导功能鉴定
刘维振１ꎬ ２#ꎬ 陈华民２#ꎬ 于 清２ꎬ 田 芳２ꎬ 唐嘉义１ꎬ 何晨阳２*
( １云南农业大学植物保护学院 云南省植物病理重点实验室ꎬ昆明 ６５０２０１ꎻ
２中国农业科学院植物保护研究所ꎬ植物病虫害生物学国家重点实验室ꎬ北京 １００１９３)
摘要:为揭示来源于番茄细菌性斑点病菌(Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ. ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａꎬ Ｘｃｖ)菌株 ＸＶ１８鞭毛素(ＦｌｉＣｘｃｖ)作为一
种病原相关分子模式(ＰＡＭＰ)诱导水稻免疫反应的功能ꎬ本研究对 ＦｌｉＣｘｃｖ编码基因 ｆｌｉｃｘｃｖ进行了基因克隆、序列分析、原
核表达、蛋白纯化和诱导活性测定ꎮ 结果表明ꎬ通过 ＰＣＲ特异性扩增ꎬ从 Ｘｃｖ菌株 ＸＶ１８中克隆了 １ ２００ ｂｐ的 ｆｌｉＣｘｃｖ基因
片段ꎬ其序列与 ＧｅｎＢａｎｋ中己测序菌株的完全一致ꎮ 在大肠杆菌中对该基因全长、Ｎ端和 Ｃ端截短序列进行了原核表达ꎬ
并获得了纯化的 ＦｌｉＣｘｃｖ全长及其截短蛋白ꎮ 将纯化蛋白浸润接种到水稻品种日本晴叶片组织ꎬ发现 ＦｌｉＣｘｃｖ全长及其截
短蛋白均能诱导水稻叶片细胞死亡、Ｈ２Ｏ２产生以及防卫基因(ＯｓＰＡＬ 和 ＯｓＰＲ１ｂ)表达等免疫反应ꎬ但诱导活性存在差异ꎮ
因此ꎬ本研究验证了 ＦｌｉＣｘｃｖ具有激发水稻细胞免疫反应的 ＰＡＭＰ功能ꎬ为水稻免疫诱导制剂的研发提供了材料ꎮ
关键词:番茄细菌性斑点病菌ꎻ 鞭毛素ꎻ 病原相关分子模式ꎻ 水稻ꎻ 免疫反应
Ｔｈｅ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ. ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ ｆｌａｇｅｌｌｉｎ ＦｌｉＣｘｃｖ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｓ ａ ＰＡＭＰ
ｔｏ ｔｒｉｇｇｅｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｒｉｃｅ ｌｅａｖｅｓ　 ＬＩＵ Ｗｅｉ￣ｚｈｅｎ１ꎬ ２ꎬ ＣＨＥＮ Ｈｕａ￣ｍｉｎ２ꎬ ＹＵ Ｑｉｎｇ２ꎬ
ＴＩＡＮ Ｆａｎｇ２ꎬ ＴＡＮＧ Ｊｉａ￣ｙｉ１ꎬ ＨＥ Ｃｈｅｎ￣ｙａｎｇ２ 　 ( １Ｙｕｎｎａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ Ｆａｃｕｌｔｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ
Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬ Ｙｕｎｎａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｋｕｎｍｉｎｇ ６５０２０１ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ２ Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ
Ｉｎｓｅｃｔ Ｐｅｓｔｓꎬ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｂｅｉｊｉｎｇ １００１９３ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｔｏ ｅｌｕｃｉｄａｔｅ ｗｈｅｔｈｅｒ ｔｈｅ ｆｌａｇｅｌｌｉｎ (ＦｌｉＣｘｃｖ) ｆｒｏｍ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ. ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ(Ｘｃｖ) ａｃｔ
ａｓ ａ ＰＡＭＰ ｔｏ ｉｎｄｕｃｅ ＰＴＩ (ＰＡＭＰ￣ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ￣ｉｍｍｕｎｉｔｙ) ｉｎ ｒｉｃｅꎬ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｃｌｏｎｉｎｇꎬ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓꎬ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎꎬ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ＰＡＭＰ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｓｓａｙ ｏｆ ＦｌｉＣｘｃｖ ａｎｄ ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｅｒｅ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｉｎ
ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｆｌｉＣｘｃｖ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ＰＣＲ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｉｃ
ＤＮＡ ｏｆ Ｘｃｖ ｓｔｒａｉｎ ＸＶ１８ꎬ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｗｈｉｃｈ ｉｓ ｉｄｅｎｔｉｃａｌ ｔｏ ｔｈａｔ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ ｓｔｒａｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ＧｅｎＢａｎｋ.
Ｍｏｒｅｏｖｅｒꎬ ｔｈｅ ｆｕｌｌ￣ｌｅｎｇｔｈꎬ Ｎ￣ ａｎｄ Ｃ￣ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｏｍａｉｎｓ ｗｅｒｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ａｎｄ
ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｔｏ ｇｅｔ ＦｌｉＣｘｃｖ ａｎｄ ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ＦｌｉＣｘｃｖ￣Ｎ ａｎｄ ＦｌｉＣｘｃｖ￣Ｃ. Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ
ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈꎬ Ｈ２Ｏ２ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｄｅｆｅｎｓｅ￣ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅｓꎬ ｓｕｃｈ ａｓ ＯｓＰＡＬ ａｎｄ ＯｓＰＲ１ｂ
ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ｒｉｃｅ ｌｅａｖｅ ｔｉｓｓｕｅｓ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅｓｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ. Ｔｈｅｓｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔ Ｘｃｖ ｆｌａｇｅｌｌｉｎ
ｗａｓ ａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ＰＡＭＰ ｔｏ ｅｌｉｃｉｔ ＰＴＩ ｉｎ ｒｉｃｅꎬ ｗｈｉｃｈ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ａｇｅｎｔ ｏｆ
ｒｉｃｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ. ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａꎻ ｆｌａｇｅｌｌｉｎꎻ ＰＡＭＰｓꎻ ｒｉｃｅꎻ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ
中图分类号: Ｓ４３２.４２　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１５)０２￣０１５１￣０７
　
植物病理学报 ４５卷
　 　 在与病原物长期互作中ꎬ植物进化出由病原物
相关分子模式(ＰＡＭＰｓ)激发的免疫反应(ＰＴＩ)和
效应子激发的免疫反应(ＥＴＩ)的 ２ 种先天免疫反
应[１ꎬ２]ꎮ ＰＡＭＰｓ是微生物中相对保守的结构或分
子ꎬ近年来分离和鉴定的主要有鞭毛素、几丁质、脂
多糖和延伸因子 ＥＦ￣Ｔｕ 等[３ꎬ４]ꎮ 其中研究比较深
入的是鞭毛素和 ＥＴ￣Ｔｕ 以及它们的相关受体及其
介导的 ＰＴＩ途径[５~７]ꎮ
　 　 鞭毛素是组成细菌鞭毛丝的亚基ꎬ可作为一种
ＰＡＭＰ诱发植株的防卫反应[８]ꎮ 例如ꎬ丁香假单胞
鞭毛素能够诱导番茄细胞介质碱化、烟草植株产生
过敏性坏死反应[９ꎬ１０]ꎮ 水稻非致病菌的鞭毛素也
可诱导水稻细胞产生类似免疫反应[１１ꎬ１２]ꎮ 作为一
种 ＰＡＭＰꎬ非致病菌鞭毛素将为植物诱导免疫制剂
的研发提供更多的选择材料ꎮ 鞭毛素具有特定的
活性位点和识别机制来诱导植物 ＰＴＩꎮ 例如ꎬ铜绿
假单胞鞭毛素蛋白 Ｎ端 ２２ 个氨基酸(Ｆｌｇ２２)能够
比全长蛋白更好地诱导拟南芥和番茄等植物细胞
ＰＴＩꎬ这样的类似结构域被认为是鞭毛素活性中
心[１３]ꎮ 然而ꎬ丁香假单胞 Ｆｌｇ２２ 虽能高效地诱导
十字花科植物免疫反应ꎬ但诱导水稻悬浮细胞产生
ＰＴＩ的能力较弱[１４]ꎮ 燕麦嗜酸菌水稻不亲和亚种
菌株 Ｎ１１４１鞭毛素能引起水稻 ＰＴＩꎬ然而 Ｆｌｇ２２ 却
缺乏此诱导功能[１２]ꎮ 一般认为ꎬ鞭毛素诱导水稻
ＰＴＩ反应机制与诱导拟南芥等植物的不同ꎬ水稻细
胞免疫反应的诱导活性中心也有可能存在于 Ｆｌｇ２２
区域以外[１５]ꎮ
　 　 番茄细菌性斑点病菌(Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓ￣
ｔｒｉｓ ｐｖ. ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａꎬ Ｘｃｖ)是水稻上的一种不亲和
病菌ꎮ 至今尚不清楚 Ｘｃｖ鞭毛素(ＦｌｉＣｘｃｖ)是否具
有 ＰＡＭＰ功能、诱导水稻细胞免疫反应ꎮ 本研究
分析了 ＦｌｉＣｘｃｖ 蛋白对水稻细胞防卫反应的诱导
能力ꎬ探讨该蛋白 Ｎ 端和 Ｃ 端不同结构域的免疫
活性ꎬ为进一步探究其对植物抗病性诱导的作用机
理以及研发水稻免疫诱导制剂提供了科学依据ꎮ
１　 材料与方法
１.１　 供试细菌菌株、培养条件和试剂
　 　 Ｘｃｖ菌株 ＸＶ１８和水稻品种日本晴(本实验室
保存)ꎻ大肠杆菌(Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ)ＤＨ５α 和 ＢＬ２１
(北京天根生化科技有限公司)ꎻ克隆质粒 ｐＭＤ￣
１８Ｔ (ＴａＫａＲａ 公司)ꎻ表达载体 ｐＣｏｌｄ￣ＳＵＭＯ (哈
尔滨海基生物公司)ꎮ
　 　 Ｘｃｖ菌株在 ２８ ℃下 ＫＢ培养基(蛋白胨 ２０ ｇ /
Ｌ、甘油 １０ ｍＬ / Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４１.５ ｇ / Ｌ、ＭｇＳＯ４􀅰７Ｈ２Ｏ
１.５ ｇ / Ｌ)上培养ꎻＥ.ｃｏｌｉ 菌株在 ３７℃下 ＬＢ 培养基
(蛋白胨 １０ ｇ / Ｌ、酵母提取物 ５ ｇ / Ｌ、ＮａＣｌ １０ ｇ / Ｌ)
上培养ꎮ 抗生素种类和浓度:卡那霉素(Ｋａｎ)为
５０ μｇ / ｍＬ、氨苄青霉素(Ａｍｐ)为 ５０ μｇ / ｍＬꎮ
　 　 ＴａｑＴＭ ＤＮＡ 聚合酶、高保真酶 Ｐｒｉｍｅ ＳＴＡＲ
Ｍａｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｔ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ 和各种限制
性内切酶(ＴａＫａＲａ 公司)ꎻ胶回收试剂盒、核酸和
蛋白 Ｍａｒｋｅｒ (北京天根生化科技有限公司)ꎻＢＣＡ
蛋白定量试剂盒(康为生物公司)ꎻ蛋白纯化 Ｎｉ￣
ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ填料 (ＧＥ 公司)ꎮ ＰＣＲ 仪和电泳仪
(Ｂｉｏ￣Ｒｏｄ公司)ꎻ酶标仪(Ｔｈｅｒｍｏ公司)ꎻ超声波破
碎仪 ＶＣＸ７５０(Ｓｏｎｉｃ 公司)ꎻ用 Ｐｒｉｍｅｒ ｐｒｅｍｉｅｒ ５.０
软件设计特异性引物(表 １)ꎬ引物均由北京华大基
因生物公司合成ꎮ
１.２　 基因克隆及其序列分析
　 　 根据 Ｘｃｖ 己测序菌株 ＸＶ８５￣１０ 基因组序列
(登录号 ＡＭ０３９９５２.１)中鞭毛素基因全长序列、Ｎ
端和Ｃ端结构域序列ꎬ设计和使用不同的特异性
Ｔａｂｌｅ １　 Ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ
Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ (５′￣３′) Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ Ｐｒｏｄｕｃｔ
ｆｌｉＣｘｃｖ￣Ｆ１ ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＡＣＡＧＧＴＡＡＴＣＡＡＣＡＣＣ ＢａｍＨ Ｉ ｆｌｉＣｘｃｖ
ｆｌｉＣｘｃｖ￣Ｒ１ ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＣＴＧＣＡＧＣＡＧＧＣＴＣＡＧＣＡ Ｘｂａ Ｉ
ｆｌｉＣｘｃｖ￣Ｆ１ ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＡＣＡＧＧＴＡＡＴＣＡＡＣＡＣＣ ＢａｍＨ Ｉ ｆｌｉＣｘｃｖ￣Ｎ
ｆｌｉＣｘｃｖ￣Ｒ２ ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＧＡＡＣＧＡＣＡＧＧＣＴＧＡＴＧＣＣＧ Ｘｂａ Ｉ
ｆｌｉＣｘｃｖ￣Ｆ２ ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＡＧＧＡＣＧＣＣＡＧＣＧＧＴＴＣＧ ＢａｍＨ Ｉ ｆｌｉＣｘｃｖ￣Ｃ
ｆｌｉＣｘｃｖ￣Ｒ１ ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＣＴＧＣＡＧＣＡＧＧＣＴＣＡＧＣＡ Ｘｂａ Ｉ
　 Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｓｉｔｅｓ ａｒｅ ｉｎ ｂｏｌｄ ｔｅｘｔ.
２５１
　
　 ２期 刘维振ꎬ等:鞭毛素蛋白 ＦｌｉＣｘｃｖ对水稻免疫反应的诱导功能鉴定
引物(表 １)ꎬ以 ＸＶ１８ 菌株基因组 ＤＮＡ 为模板ꎬ
ＰＣＲ扩增全长基因片段 ｆｌｉＣｘｃｖ、Ｎ 端结构域片段
ｆｌｉＣｘｃｖ￣Ｎ与 Ｃ 端结构域片段 ｆｌｉＣｘｃｖ￣Ｃꎮ 用 １％琼
脂糖凝胶电泳检测 ＰＣＲ扩增产物ꎮ 扩增产物纯化
后ꎬ连接至克隆载体 ｐＭＤ１８￣Ｔꎮ 将重组质粒
ｐＭＤ１８￣Ｔ￣ｆｌｉＣｘｃｖ、 ｐＭＤ１８￣Ｔ￣ｆｌｉＣｘｃｖ￣Ｎ 和 ｐＭＤ１８￣
Ｔ￣ｆｌｉＣｘｃｖ￣Ｃ分别转化 Ｅ. ｃｏｌｉ 菌株 ＤＨ５α 感受态细
胞ꎬ获得阳性质粒ꎬ测序确认ꎮ
　 　 使用 ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ 数据库对 ｆｌｉＣｘｃｖ 基因和
蛋白序列同源性进行分析ꎻ通过 ＳＭＡＲＴ 和 ＣＤＳ
分析蛋白结构ꎻ序列分析采用软件 ＤＮＡＳｔａｒ ７.１ 和
ＤＮＡＭＡＮ ６.０ꎻ聚类分析采用 ＭＥＧＡ ４.０软件ꎮ
１.３　 原核表达载体构建和蛋白质分离纯化
　 　 将经 ＢａｍＨ Ｉ / Ｘｂａ Ｉ 酶切后获得的 ｆｌｉＣｘｃｖ、
ｆｌｉＣｘｃｖ￣Ｎ和 ｆｌｉＣｘｃｖ￣Ｃ 片段ꎬ分别连接到表达载体
ｐＣｏｌｄ￣ＳＵＭＯ上ꎬ构建重组表达载体ꎬ转化 Ｅ. ｃｏｌｉ
菌株 ＢＬ２１(ＤＥ３)感受态细胞ꎮ 获得阳性转化子ꎬ
测序确认ꎮ
　 　 接种单菌落于 ５ ｍＬ ＬＢ(Ａｍｐ)培养基中ꎬ在
３７℃下培养过夜(２００ ｒ / ｍｉｎ)ꎻ然后转接到 ５００ ｍＬ
相同培养基中培养生长ꎻ 收集菌体、用 ＰＢＳ溶液悬
浮、加入蛋白酶抑制剂、超声波破碎、收集上清液ꎮ
用 Ｎｉ￣ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ纯化蛋白ꎬ用 １００ ｍｍｏｌ / Ｌ 咪唑
溶液洗脱ꎬＳＤＳ￣ＰＡＧＥ 检测ꎮ 用 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 进行
验证ꎮ 纯化蛋白分别用 Ｔｒｉｓ￣ＨＣｌ (ｐＨ ８.０)置换出
咪唑ꎬ超滤浓缩、定量ꎮ
１.４　 水稻叶片诱导处理及其细胞死亡和 Ｈ２Ｏ２产
生的检测
　 　 将 ２ μｍｏｌ / Ｌ纯化蛋白用 １ ｍＬ 无针头注射器
浸润接种到苗龄 １４ ｄ 的水稻叶片ꎬ以 １０ ｍｍｏｌ / Ｌ
Ｔｒｉｓ￣ＨＣｌ (ｐＨ ８.０) 缓冲液作为对照ꎮ
　 　 参照文献[１６]方法检测叶细胞过敏性坏死反
应ꎮ 取样接种 ２４ ｈ 的叶片组织ꎬ置于台酚蓝溶液
(１０ ｍｇ台酚蓝、２０ ｍＬ 乙醇、１０ ｍＬ Ｔｒｉｓ 饱和酚、１０
ｍＬ乳酸、１０ ｍＬ水)ꎬ煮沸 ３ ｍｉｎꎬ之后用 ２.５ ｍｇ / ｍＬ
的水合氯醛溶液脱色至叶片底色显白后ꎬ用清水洗
涤ꎬ在光学显微镜(Ｏｌｙｍｐｕｓ ＳＺＸ１６)下观察ꎮ
　 　 参照文献[１７]方法检测Ｈ２Ｏ２产生ꎮ 取样接种 ２４
ｈ的叶片组织ꎬ置于 ＤＡＢ染色液中(１ ｍｇ / ｍＬꎬ０.０１％
Ｔｒｉｔｏｎ￣Ｘ￣１００)染色ꎬ在低真空压力下处理 ２ ｈ左右后ꎬ
在室温下放置过夜ꎮ 将叶片放在乙醇￣乳酸￣酚
(９５％乙醇 ∶ 乳酸 ∶ 苯酚)２ ∶ １ ∶ １、６５℃水浴 ３０ ｍｉｎꎬ
用水合氯醛(２.５ ｍｇ / ｍＬ)脱色至叶片透明ꎬ用清水洗
涤ꎬ在光学显微镜(Ｏｌｙｍｐｕｓ ＳＺＸ１６)下观察ꎮ
１.５　 水稻防卫基因表达的 ｑＲＴ￣ＰＣＲ检测
　 　 参照文献[１８]方法对接种 ２４ ｈ的水稻叶片进
行总 ＲＮＡ的提取和反转录ꎮ 用 Ｐｒｉｍｅｒ ｐｒｅｍｉｅｒ ５.０
软件对水稻防卫基因进行引物设计(表 ２)ꎮ 按照
ＩＱＳＹＢＲ􀅹 Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ 试 剂 盒 ( Ｂｉｏ￣Ｒａｄꎬ
ＵＳＡ)方法[１９]ꎬ用 ｉＣｙｃｌｅｒ ＩＱＴＭ实时定量 ＰＣＲ 仪
(Ｂｉｏ￣ＲａｄꎬＵＳＡ)进行荧光定量 ＰＣＲ(ｑＲＴ￣ＰＣＲ)的
检测ꎮ 参照文献[２０] 的方法ꎬ以 ＯｓＡｃｔｉｎ 基因为
内标参照ꎬ对水稻防卫基因表达进行定量分析ꎮ 靶
基因相对表达量 ＝ ２－ΔΔＣｔꎬ其中 ΔΔＣｔ ＝ (Ｃｔｔａｒｇｅｔ －
ＣｔＯｓＡ ｃｔｉｎ)Ｔｉｍｅ Ｘ－(Ｃｔｔａｒｇｅｔ －ＣｔＯｓＡ ｃｔｉｎ)Ｔｉｍｅ ０ꎬＣｔ 为荧
光阈值ꎮ 釆用 ＳＡＳ 假设检验的配对法ꎬ对定量分
析数据进行 ｔ检验ꎬ分析样品与对照间的差异显著
性(Ｐ < ０.０５)ꎮ
２　 结果与分析
２.１　 ｆｌｉＣｘｃｖ基因克隆和序列鉴定
　 　 通过 ＰＣＲ特异性扩增ꎬ从菌株 ＸＶ１８中获得
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｑＲＴ￣ＰＣＲ ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｒｉｃｅ ｄｅｆｅｎｓｅ ｇｅｎｅｓ
Ｇｅｎｅ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ (５′￣３′) Ｐｒｏｄｕｃｔ ｌｅｎｇｔｈ / ｂｐ
ＯｓＰＡＬ
ＣＡＴＣＣＡＧＧＧＣＧＧＣＴＴＣＴＴＣＧ
ＣＣＧＧＧＴＧＧＴＧＣＴＴＣＡＧＣＴＴＧＴ
２１３
ＯｓＰＲ１ｂ
ＣＧＡＴＣＡＧＣＧＣＣＣＴＴＡＣＴＡＧＣ
ＡＣＡＣＡＣＡＡＴＣＣＧＧＣＴＡＣＡＴＡＧＡＴ
２０７
ＯｓＡｃｔｉｎ
ＡＡＧＧＡＴＣＴＡＴＡＴＧＧＣＡＡＣＡＴＣＧ
ＡＴＣＣＡＣＡＴＣＴＧＣＴＧＧＡＡＴＧＴＧ
２０１
３５１
　
植物病理学报 ４５卷
了 ｆｌｉＣｘｃｖ基因全长片段ꎮ 经回收纯化后ꎬ连接克
隆载体 ｐＭＤ１８￣Ｔꎬ构建质粒 ｐＭＤ１８￣Ｔ￣ｆｌｉＣｘｃｖꎮ 测
序分析表明ꎬ其序列与 ＧｅｎＢａｎｋ 中 Ｘｃｖ 己测序菌
株的序列完全一致ꎮ 进一步以此基因片段为模板ꎬ
克隆了 Ｎ 端和 Ｃ 端序列片段ꎮ 构建了质粒
ｐＭＤ１８￣Ｔ￣ｆｌｉＣｘｃｖ￣Ｎ和 ｐＭＤ１８￣Ｔ￣ｆｌｉＣｘｃｖ￣Ｃꎬ并测序
验证ꎮ 生物信息学分析表明ꎬ ｆｌｉＣｘｃｖ 全长基因
(１ ２００ ｂｐ)编码蛋白由 ３９９个氨基酸组成ꎬ预测分
子量大小为 ４３.８９ ｋＤꎬ具有 Ｆｌａｇｅｌｌｉｎ＿Ｎ、Ｆｌａｇｅｌｌｉｎ＿
ＩＮ和 Ｆｌａｇｅｌｌｉｎ＿Ｃ ３个保守结构域(图 １￣Ａ)ꎮ
Ｆｉｇ. １　 Ｄｏｍａｉｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＦｌｉＣｘｃｖ (Ａ)ꎬ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＦｌｉＣ
(Ｂ) ａｎｄ ｆｌｇ２２ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｎａｌｙｓｉｓ (Ｃ) ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｔｒａｉｎｓ
４５１
　
　 ２期 刘维振ꎬ等:鞭毛素蛋白 ＦｌｉＣｘｃｖ对水稻免疫反应的诱导功能鉴定
　 　 通过系统进化分析ꎬ来源不同病原细菌的 ＦｌｉＣ
可聚类为黄单胞、燕麦嗜酸菌、铜绿假单胞和丁香
假单胞 ４类ꎮ ＦｌｉＣｘｃｖ 序列与水稻白叶枯病菌(Ｘ.
ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚａｅꎬ Ｘｏｏ)和十字花科黑腐病菌(Ｘ.
ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ. ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓꎬ Ｘｃｃ)的同源性最高ꎬ与
燕麦嗜酸菌(Ａｃｉｄｏｒｖｏｒａｘ ａｖｅｎａｅꎬ Ａａ)的亲缘关系
较远ꎬ与丁香假单胞菌(Ｐｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇｅꎬ Ｐｓ)
的亲缘关系最远(图 １￣Ｂ)ꎮ
　 　 进一步将 ＸＶ１８ 中 ＦｌｉＣｘｃｖ 的 ｆｌｇ２２ 与其他不
同细菌菌株的进行了序列比对分析ꎬ发现 ＸＶ１８ 与
Ｘｏｏ 菌 株 ( ＰＸＯ９９Ａ、 ＭＡＦＦ３１１０１８ 和
ＫＡＣＣ１０３３１)、Ｘｃｖ 菌株(ＸＶ５ 和 ＸＶ８５￣１０)中的
ｆｌｇ２２ 序 列 完 全 相 同ꎻ 与 Ｘｃｃ 菌 株 ( ８００４、
ＡＴＣＣ３３９１９和 ＸＣＣ１８６)的有个别氨基酸的差异ꎻ
与其余测定菌株的序列差异较大(图 １￣Ｃ)ꎮ
２.２　 ｆｌｉＣｘｃｖ基因原核表达和蛋白纯化及其定性
　 　 分别将克隆的基因序列定向克隆至表达载体
ｐＣｏｌｄ￣ＳＵＭＯ中ꎬ得到重组表达质粒 ｐＣｏｌｄ￣ＳＵＭＯ￣
ｆｌｉＣｘｃｖ、 ｐＣｏｌｄ￣ＳＵＭＯ￣ｆｌｉＣｘｃｖ￣Ｎ 和 ｐＣｏｌｄ￣ＳＵＭＯ￣
ｆｌｉＣｘｃｖ￣Ｃꎮ 经 ＢａｍＨ Ｉ / Ｘｂａ Ｉ 酶切验证后ꎬ分别得
到大小约为 １ ２００、６００和 ６００ ｂｐ片段ꎬ与预期结果
一致ꎮ 对构建质粒进行测序ꎬ得以验证ꎮ 将上述重
组表达载体转化至 Ｅ. ｃｏｌｉ菌株 ＢＬ２１(ＤＥ３)中ꎬ经
ＩＰＴＧ诱导后ꎬ在上清液中获得了大小为 ５８. ８９、
３６.８９和 ３６.８９ ｋＤ的可溶性蛋白(未列出资料)ꎮ
　 　 通过对诱导表达蛋白进行 Ｎｉ￣ｓｅｐｈａｒｏｓｅ 分离、
咪唑溶液洗脱、凝胶电泳检测ꎬ获得了分子量大小
与预期一致的 ３ 种表达蛋白质(图 ２￣Ａ)ꎮ 对纯化
蛋白进行Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析验证ꎬ表明蛋白质表达
的正确性(图 ２￣Ｂ)ꎮ
Ｆｉｇ. ２　 ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ (Ａ) ａｎｄ Ｗｅｓｔｅｒｎ￣ｂｌｏｔ (Ｂ)
ｏｆ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ＦｌｉＣｘｃｖ ａｎｄ ｔｒｕｎｃａｔｅｄ
ｐｒｏｔｅｉｎｓ
Ｌａｎｅ Ｍ: Ｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｒｋｅｒꎻ Ｌａｎｅ １: ＦｌｉＣｘｃｖꎻ Ｌａｎｅ ２: ＦｌｉＣｘｃｖ￣
Ｎꎻ Ｌａｎｅ ３: ＦｌｉＣｘｃｖ￣Ｃ.
２.３　 ＦｌｉＣｘｃｖ对水稻叶片细胞死亡和 Ｈ２Ｏ２产生的
诱导作用
　 　 将纯化的 ＦｌｉＣｘｃｖ 全长及其截短蛋白浸润
接种到水稻幼苗叶组织ꎬ分别用台酚兰和 ＤＡＢ
染色法测定了其诱导水稻细胞死亡和 Ｈ２Ｏ２产生的
能力ꎮ 结果显示ꎬ处理 ２４ ｈ 后ꎬ ＦｌｉＣｘｃｖ 及其截
短蛋白均能引起叶片细胞死亡(图 ３)和组织 Ｈ２Ｏ２
产生(图 ３)ꎬ其诱导能力 ＦｌｉＣｘｃｖ ﹥ ＦｌｉＣｘｃｖ￣Ｃ ﹥
ＦｌｉＣｘｃｖ￣Ｎꎬ而对照 (Ｔｒｉｓ￣ＨＣｌ 缓冲液和标签蛋白
ＳＵＭＯｔａｇ)处理未发现明显的细胞死亡和 Ｈ２Ｏ２的
产生ꎮ
Ｆｉｇ. ３　 Ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ａｎｄ Ｈ２Ｏ２ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＦｌｉＣｘｃｖ ａｎｄ ｔｒｕｎｃａｔｅｄ
ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｒｉｃｅ ｌｅａｖｅｓ ｒｅｖｅｌｅｄ ｂｙ ｔｒｙｐａｎ￣ｂｌｕｅ ａｎｄ ＤＡＢ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ
５５１
　
植物病理学报 ４５卷
２.４　 ＦｌｉＣｘｃｖ对水稻防卫基因 ＯｓＰＡＬ 和 ＯｓＰＲ１ｂ
表达的诱导作用
　 　 将纯化蛋白浸润接种到水稻幼苗叶组织ꎬ用
ｑＲＴ￣ＰＣＲ方法测定了其诱导水稻叶组织中 ２ 种主
要防卫基因表达的能力ꎮ 结果显示ꎬ处理 ２４ ｈ 后ꎬ
ＦｌｉＣｘｃｖ及其截短蛋白均能显著地诱导水稻组织中
ＯｓＰＡＬ和 ＯｓＰＲ１ｂ 基因转录本增加ꎬ其诱导能力
ＦｌｉＣｘｃｖ>ＦｌｉＣｘｃｖ￣Ｃ>ＦｌｉＣｘｃｖ￣Ｎ (图 ４)ꎮ
Ｆｉｇ. ４ 　 Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＯｓＰＡＬ ａｎｄ ＯｓＰＲ１ｂ
ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｒｉｃｅ ｌｅａｖｅｓ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ
ＦｌｉＣｘｃｖ ａｎｄ ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ
３　 讨论
　 　 前期研究发现ꎬ作为一种不亲和病原细菌ꎬ
Ｘｃｖ菌体能显著地诱导水稻悬浮培养细胞过敏性
死亡以及防卫相关基因(ｎｏｓ、ｇｓｔ、ｐａｌ 和 ｐｏｘ)显著
表达[２１]ꎮ 为了进一步确定起 ＰＡＭＰ功能的菌体组
分ꎬ本研究对 Ｘｃｖ 鞭毛素基因进行克隆、分段原核
表达以及表达蛋白的 ＰＴＩ 诱导活性测定ꎮ 确证了
ＦｌｉＣｘｃｖ作为一种 ＰＡＭＰ 分子ꎬ可以显著地诱导水
稻叶片细胞死亡和 Ｈ２ Ｏ２产生ꎮ 由于 ＯｓＰＡＬ 和
ＯｓＰＲ１ｂ是水稻中重要的防卫反应标志基因[１１ꎬ ２２]ꎬ
这 ２个基因对 ＦｌｉＣｘｃｖ 蛋白的应答表达显著增加ꎬ
初步揭示该蛋白可能在转录水平上诱导水稻的抗
病反应ꎮ 需要对其他更多重要防卫基因的转录情
况进行分析ꎬ对此进行验证ꎮ 通过分析试验结果ꎬ
本研究认为 ＦｌｉＣｘｃｖ 蛋白具有水稻细胞免疫反应
的激发活性功能ꎬ可以用作水稻免疫诱导制剂的研
发材料ꎮ
　 　 通过生物信息学分析ꎬ发现 ＦｌｉＣｘｃｖ 蛋白含有
３个保守结构域 Ｆｌａｇｅｌｌｉｎ＿Ｎ、Ｆｌａｇｅｌｌｉｎ＿ＩＮ和 Ｆｌａｇｅｌ￣
ｌｉｎ＿Ｃꎮ 由于 Ｆｌａｇｅｌｌｉｎ＿Ｎ 和 Ｆｌａｇｅｌｌｉｎ＿Ｃ 结构非常
保守ꎬ推测它们可能具有免疫反应激活功能ꎮ 鉴此
设计特异性引物ꎬ分别扩增含有 Ｆｌａｇｅｌｌｉｎ ＿Ｎ 和
Ｆｌａｇｅｌｌｉｎ＿Ｃ 序列ꎬ进行了蛋白 Ｎ 端和 Ｃ 端截短表
达ꎬ初步验证了 ＰＴＩ 诱导活性ꎮ 虽然 ＦｌｉＣｘｃｖ 及其
截短蛋白均能诱导水稻细胞免疫反应ꎬ但诱导活性
存在一定的差异ꎬＦｌｉＣｘｃｖ 诱导能力大于 ＦｌｉＣｘｃｖ￣Ｃ
和 ＦｌｉＣｘｃｖ￣Ｎ肽段ꎮ 其可能的原因是后两者活性
位点不完整ꎬ导致了诱导活性略为下降ꎬ推测其活
性位点可能位于 Ｆｌａｇｅｌｌｉｎ＿ＩＮ 位点附近ꎮ 因此ꎬ需
要继续通过该基因分段表达ꎬ对该蛋白活性位点进
行深入的探究ꎬ以期彻底阐明 ３ 个保守结构域与
ＦｌｉＣｘｃｖ蛋白免疫激活功能的关系ꎮ
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责任编辑:于金枝
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