全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第11期
基因组定点编辑技术，可以实现对一个或多个
目的基因的敲除，或是把外源基因敲入到指定位点，
也可以利用转录因子在转录水平上对目的基因的表
达水平进行调控，这项技术是研究基因功能并对基
因的功能加以利用的最有效手段。
基因组定点编辑工具主要有锌指核酸酶（Zinc-
finger nucleases，ZFNs）、转录激活样效应因子核酸
酶（Transcription activator-like effector nucleases，TA-
LEN）、归巢核酸内切酶（Meganucleases）和成簇间隔
短回文重复（The type II clustered regularly interspaced
short palindromic repeats，CRISPR），以上工具均可
以对基因组进行精确的定点修饰，工作原理基于核
酸内切酶在基因组的特定位点进行切割，从而形成
DNA 双链断裂（Double strand break，DSB）。细胞中
存在天然的 DNA 损伤应答机制，DSB 会被同源重组
收稿日期 ： 2014-01-26
基金项目 ：深圳市战略新兴产业发展专项资金项目（CXZZ20120615141322654）
作者简介 ：吴璐，女，硕士，研究方向 ：分子生物学 ；E-mail ：wulu@genomics.cn
通讯作者 ：原辉，男，博士，研究方向 ：动植物分子育种 ；E-mail ：yuanhui@ genomics.cn
基因组编辑技术研究进展
吴璐  王磊  任远  原辉
（深圳华大基因研究院，深圳 518083）
摘 要 ： 利用基因组编辑技术可以对生物基因组特定位点进行人工修饰，研究相关基因的功能，进而应用于基础研究和临
床治疗方面。序列特异性的 DNA 结合结构域与非特异性的 DNA 修饰结构域组合而成的人工酶是基因组编辑工具的重要组成部分。
主要介绍了锌指核酸酶（ZFNs）、转录激活样效应因子核酸酶（TALEN）、归巢核酸内切酶（Meganucleases）和成簇间隔短回文重
复（CRISPR）4 种基因组编辑技术的特点、原理、构建方法及应用，为相关的研究和应用提供参考。
关键词 ： 基因编辑 ZFNs TALEN CRISPR 同源重组
The Research of Genome Editing
Wu Lu Wang Lei Ren Yuan Yuan Hui
（BGI-Shenzhen，Shenzhen 518083）
Abstract: Genome Editing can be used to operate artificially almost any gene in cells or organisms. This research method of gene function
is useful for fundamental research and clinic treatment. The major component of this tool is artificial nuclease with specific DNA-binding domain
and non-specific DNA-modifying domain. This article reviews the characteristics, principle, construction and application of ZFN, TALEN and
CRISPR/Cas, which would be useful reference for related research.
Key words: Gene editing ZFNs TALEN CRISPR Homologous recombination
修复（Homology directed recombination repair，HDR）
和 非 同 源 末 端 连 接（Non-homologous end joining，
NHEJ）两种方式修复。在同源序列（外源引入或同
源染色体）存在的情况下，同源重组修复（HDR）
可实现外源基因的插入或基因的靶向修复 ；在没有
同源序列的情况下，细胞趋向于利用非同源的末端
连接（NHEJ）进行 DNA 的修复，它可能引入或删
除一个或多个碱基从而造成基因移码突变，使相关
基因被敲除。4 种基因组编辑技术的序列靶向识别、
人工构建方法等均有很大不同。
1 锌指核酸酶（ZFNs）
ZFN 是一种人工改造的核酸内切酶，它由特异
性的 DNA 结合结构域和非特异性的切割域两部分
构成，其中结合域由一系列串联的具有 Cys2-His2
结构的锌指蛋白构成，切割域主要是指核酸内切酶
2014年第11期 85吴璐等：基因组编辑技术研究进展
Fok I。在基因组靶标位点左右两边各设计一个 ZFN
（分别根据正负链的序列），识别结构域将两个 ZFN
结合到基因组特定位点，当两个识别位点的间距为
6-8 bp 时，两个 Fok I 单体相互作用形成二聚体，行
使酶切功能对靶标位点进行切割，从而实现基因修
饰的目的［1，2］（图 1）。
锌指蛋白源自转录调控因子家族，在真核生物
中广泛存在，其骨架结构保守，每个锌指蛋白能够
识别特定 3 bp 长的 DNA 序列，早期的研究中多采
用左右两边各 3 个锌指蛋白来识别总共 18 bp 的序
列（3×3×2），也有的构建方法增加锌指蛋白数目
到左右两边各 6 个，从而增强识别特异性［3］（图 1）。
中切割域和锌指核酸酶的切割域类似，均为 Fok I 内
切酶 ；TALEN 的结合域是经过人工改造的 TALE 蛋
白，这种蛋白最初来源于一种植物病原菌——黄单
胞杆菌（Xanthomonas）。与锌指核酸酶类似，也是
根据靶标位点两侧的序列设计一对 TALEN，结合
到对应的识别位点后，两个 Fok I 单体相互作用形
成二聚体，对靶标序列进行切割，实现基因修饰的
目的［8］。
TALEN 系 统 中， 除 去 N 端 和 C 端 序 列 的 中
间区域包含一系列的长度为 34 个氨基酸的重复单
元（Monomers），该重复单元为 TALEN 系统识别和
结合的基本单位。自然界发现的 TALE 蛋白包含的
monomers 个数从 1.5 到 33.5 不等，每个 monomer 的
序列高度保守，但是在第 12 位和 13 位的两个氨基
酸是可变的，称之为 RVD（Repeat variable diresidu-
es）［9］。研究发现了 RVD 和其所识别碱基的一一对
应关系，其中 NI 识别 A，HD 识别 C，NG 识别 T，
NN 识 别 G 或 是 A（ 图 2）。 不 同 的 monomers 和 不
同的排列顺序即可决定识别不同的 DNA 序列。在
植物基因组中，原始的 TALE 识别序列一般从 T 开
始，推测是由 TALE 的 N 端序列来识别的。此外，
TALEN 的结合域一般以半个 monomers 的重复结束。
因此，TALEN 识别的 DNA 序列包含首端的一个 T
碱基、中间的多个 RVDs 识别的碱基、末端半个
monomers 识别的一个碱基。另外 TALE 识别 DNA 序
列具有方向性，从 DNA 的 5 到 3［10］。
由于 TALEN 中存在多个重复序列，所以通过传
统分子克隆和人工合成等方法并不能进行有效地组
装。目前已开发出了多种方便快捷的组装方法，如
Golden-Gate 组装、顺序组装和高通量固相组装。应
用最广泛的是 Golden-Gate 组装方法，它的核心策略
是采用Ⅱ S 型限制性内切酶和 T4 连接酶同时进行酶
切和连接。Ⅱ S 型内切酶的特点是切割位点位于识
别位点之外，例如，Bsa I 识别位点为 GGTCTC，而
Fok I
Fok IZFN-L
ZFN-R
图 1 ZFN 作用原理示意图
ZFN 的构建方法主要有 3 种 ：直接组装法、筛
选法和商业定制法。直接组装法基于锌指蛋白和碱
基间的识别对应关系，直接按照目的序列选择锌指
进行组装，这个方法简单易行，但识别效率较低，
目前经典的方法主要有 MA 法（Modular assembly）
和 CoMA 法（Context-dependent assembly）［4-6］。筛选
法的思想是采用一步或多步的筛选策略，以 OPEN
法（Oligomerized pool engineering）为代表，首先构
建一个待筛选的锌指库，而后筛选出特异性高的锌
指进行下一步的组装，工作量较大，但是效率较高［7］。
Sangamo 公司成功对 ZFN 技术进行了商业推广，直
接从该公司订购的 ZFN 表达载体可保证打靶的质量
和效率。
2 转录激活样效应因子核酸酶（TALEN）
TALEN 是人工改造的核酸内切酶，也是由特异
性的结合域和非特异性的切割域共两部分构成，其䟽༽অݳ≘ส䞨ᒿࡇ˖TALEN㳻ⲭݳԦ˖Nㄟ䇶࡛DNAᒿࡇ˖ 䇶࡛⻡ส˖
RVD˖ CㄟṨᇊսǃ䖜ᖅ◰⍫ㅹݳԦ䖜䘀ㅹݳԦ
图 2 TALEN 结构示意图
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第11期86
切割模式则是 GGTCTCN^NNNN。在酶切连接的过
程，每个片段两端均设计上Ⅱ S 型酶的识别序列来
产生需要的粘性末端，在连接酶的作用下与含有互
补粘性末端的片段连接，达到片段延伸的效果，而
Ⅱ S 型内切酶的识别位点则在酶切过程中被消除。
优化的 Golden Gate 组装便捷度更是得到提升，可在
1 d 内完成组装［11，12］。顺序组装的方法在一定程度
上借鉴合成生物学的 Bio-Brick 的思想，即利用限制
性内切酶处理后将每个模块一步一步连接而成［13］。
尽管这种方法大大简化了 TALEN 的构建，但仍需
要一定的时间和工作量投入，这造成无法批量生
产 TALEN，而 FLASH 技术则可以实现批量化生产。
FLASH 主要采用固相策略来对 TALE 的单元片段进
行连接，按照所需的 monomers 的连接顺序，重复性
地进行片段连接和洗涤，最终的连接产物则通过限
制性消化而从固相中释放出来，而后通过亚克隆连
接到表达载体上，完成 TALEN 的构建［14］。
在人、小鼠、斑马鱼、大鼠、猪等动物和拟南芥、
水稻、烟草等植物［10，13，15-18］中成功验证了 TALEN
对基因组进行编辑的有效性，在这些研究中实现了
目的基因的敲除、外源基因的定点插入、基因组大
片段删除（利用两对 TALEN）和基因的转录调控（用
转录因子替代 Fok Ⅰ内切酶）［19］。2014 年中国科学
家成功利用 TALEN 技术对食蟹猴进行了基因敲除，
这是利用这项技术构建出的首个非人类灵长类动物
模型［20］。
在疾病治疗方面，报道了利用 TALEN 技术对
诱导多能干细胞（iPS）的突变基因进行了人工修
复，也有研究证明这项技术可应用于线粒体基因突
变的修复工作，这些研究都为 TALEN 的临床应用奠
定了基础［21］。Y 染色体结构的特殊性使得对 Y 染色
体的研究相对滞后，TALEN 技术成功地实现了对小
鼠 Y 染色体的基因修饰，可作为研究哺乳动物 Y 染
色体的有效工具［22］。TALEN 技术也可以用来研究
miRNA，敲除目标 miRNA 在染色体上的对应序列，
从而研究其生物学功能［23］。
3 归巢核酸内切酶
归巢核酸内切酶也是一种工程化的内切酶，它
可识别的位点序列较长，从 12 bp 到 40 bp 不等。应
用最广泛的是 LAGLIDADG 家族，它广泛地存在于
真核生物的线粒体和叶绿体中，常见的有 I-SceI、
I-CreI 和 I-DmoI，其家族成员在结构上具有一定的
保守性，均包含 DNA 结合结构域和酶切活性结构
域［24］。这项技术早在 1990 年就被应用于基因修饰，
天然存在的归巢核酸内切酶具有高特异性和低细胞
毒性的特点，局限性在于已知的归巢核酸内切酶的
种类有限，识别的 DNA 序列也有限。工程化的归巢
核酸内切酶是利用生物技术的手段，通过在天然存
在的归巢核酸内切酶上引入一定数量的其他氨基酸
序列，或是将不同的识别结构域进行融合，从而实
现识别 DNA 序列的目的［25］。目前归巢核酸内切酶
技术的研发和应用主要集中在某些较大的生物公司，
如 Cellestis 和 Bayer Crop Science。研究表明工程化
归巢核酸内切酶可应用于玉米基因组的修饰［26］。在
基因治疗方面，有成功应用于修复着色性干皮病的
报道［27］。
4 成簇间隔短回文重复（CRISPR）
CRISPR 是一种 RNA 诱导的获得性免疫系统，
发现于细菌和古生菌中，用来抵抗外来病毒或是
质粒的入侵。该系统由成簇间隔的短回文重复序
列（Clustered regularly interspaced short palindromic
repeat sequences） 和 Cas 基 因（CRISPR-associated
genes）组成。CRISPR/Cas 系统首先产生与靶标序
列对应的 RNA 序列，与病毒或质粒的 DNA 进行互
补作用，然后引导 Cas 内切酶对互补的序列进行双
链切割［28］。其中 Cas 基因家族中的 Cas9 广泛地应
用于该系统中，它是一种天然存在的内切酶，具有
两个酶切活性结构域 ：HNH 核酸酶结构域和 Ruv-C-
like 结构域，分别切割互补链和非互补链。切割过
程需要另外两个 RNA 的帮助，分别为 CRISPR RNA
（crRNA）和反式 CRISPR RNA（trans -acting CRISPR
RNA，tracrRNA），人们已经将这两种 RNA 改造融
合成一个向导 RNA（single-guide RNA，sgRNA），单
个 sgRNA 足以帮助 Cas9 实现定点切割的效果［29］
（图 3）。
经过人工改造的 CRISPR/Cas 系统一般分为两
种，一种主要由 Cas9、tracrRNA 和 crRNA 三部分构
成 ；另一种主要由 Cas9 和 sgRNA 两部分构成。载
2014年第11期 87吴璐等：基因组编辑技术研究进展
体的构建过程简便快捷，仅需人工合成一段和靶标
序列相同的序列，连接至载体特定位点即可，具有
高通量高效率的特点［30］。
2013 年，Science 等 杂 志 报 道 了 CRISPR 技 术
的开发和应用，该技术迅速成为分子生物学研究热
点［29，30］。接下来的研究集中在 CRISPR 技术在不
同的生物中的应用，在大肠杆菌、酵母、水稻、拟
南芥、烟草、斑马鱼、人、小鼠和猪等生物中都成
功验证了这项技术的功能性，涵盖单基因敲除、外
源基因插入、基因靶向修复、多基因敲除、大片段
敲除和调控基因表达等［30-39］。南京大学模式动物研
究所利用 CIRSPR 技术对食蟹猴基因组进行了修饰，
这是人类首次将基因编辑技术应用在灵长类动物中，
这对人类遗传性疾病的基因治疗具有里程碑式的
意义［40］。
CRISPR/Cas 载体的构建具有高通量高效率的特
点。英国洛桑研究所构建了小鼠基因组导向 RNAs
文库，可靶向基因组中的绝大多数基因［41］。两个实
验室构建了针对人类基因组的 sgRNA 文库，sgRNAs
数量分别为 73 000 和 64 751，实现了基因组编辑技
术在人全基因水平上的应用［42，43］。
CRISPR/Cas 技术的局限性在于存在一定的脱
靶现象。多个实验室首先报道了 CRISPR 系统的脱
靶现象，sgRNA 与 DNA 互补配对时，在某些位置
上允许 1 个或两个的碱基不配对，甚至会存在 5 个
碱基不配对的情况［44-46］。这在一定程度上打击了
科学家们将 CRISPR 技术应用于医疗临床的积极性。
CRISPR 技术最初的开发者张峰带领的实验室利用一
对 sgRNA 来识别靶标位点，大大降低了脱靶效率［47］。
南京大学黄兴许课题组也是利用 Cas9 切口酶和成对
sgRNA 大大降低 CRISPR 系统的脱靶效应［48］。
5 总结及展望
以上介绍的基因编辑技术都是采用内切酶在
DNA 上打开缺口，然后利用细胞内自有的修复机制
来实现基因编辑，但每种基因编辑工具都各有特点，
总结归类如表 1 所示。
表 1 不同基因组编辑技术比较
ZFN TALEN CRISPR
识别模式 蛋白质 -DNA 蛋白质 -DNA RNA-DNA
识别长度 （3-6）×3×2 bp （12-20）×2 bp 20 bp
识别序列特点 以 3 bp为单位 5 前一位为 T 3 序列为 NGG
特异性 较高 一般 一般
构建难易 难度大 较容易 容易
细胞毒性 大 较小 较小
有效地提高特异性、减少脱靶率是基因组编
辑技术应用于临床治疗的最核心问题，可利用生物
信息学的方法尽量选择在基因组上无同源或相似性
序列的位点，以减少脱靶效率。需要指出的是，不
同基因组编辑技术对不同序列的识别效率存在一定
NNN
N N
N N
N N
N N
ੁሬRNACas9㳻ⲭ䶦ḷᒿࡇ ࠷ࢢ PAMᒿࡇN NN NN NN NN N NNNNNNN3˃NNNNNNNN3˃NNNNNNNN5˃สഐ㓴ᒿࡇN NNG C CC G GC G C G A G C G T T C C A C G A C T A G5 G˃ C G C U C G C A A G G U G C U G A U C C G G5 N˃NNNN5 N˃NNNN G C G C T C G C A A G G T G C T G A T C
图 3 人工改造 CRISPR/Cas9 系统作用原理示意图
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第11期88
的差异，原因可能与染色体的结构和不同技术的识
别机制有关，例如，在 TALEN 系统识别切割过程
中，染色体的状态可能会影响两个 TALE 间的距离，
从而影响了左右两个 Fok I 形成二聚体的效率，在
CRISPR 识别过程中，高 G+C 含量可能会使 gRNA
与 DNA 互补配对更稳定，从而提高切割效率。
对基因组编辑技术的优化改造是当下研究的
热 点， 对 于 ZFN、TALEN 和 CRISPR 三 种 技 术 来
讲，一部分研究集中在优化保守性切割域 ：Fok I 和
Cas9。利用优化后的 Fok I、TALEN 元件的 C 端和 N
端以及 TALE 和 Fok I 的 linker，可提高打靶效率［15］。
对于来源于 S. spyogenes 的 Cas9，目前已经有其突变
型 D10A 用于产生单链缺口而不是双链断裂［47］。对
于 Cas9 的另一个问题是其编码序列较大，后续研究
有望进一步简化 Cas9 序列或是找出其同源的内切
酶，以期提高转染效率和切割特异性。
基因编辑工具对于基础研究和临床应用均有重
大意义。早期经典的突变技术及同源重组技术为反
向遗传学的研究做出了重大贡献，新一轮的 ZFN、
TALEN、CRISPR 等技术使基因敲除和插入技术变得
更为简便快捷，这对研究基因功能非常重要。在疾
病模型方面，很多单基因疾病的研究尚未建立小鼠
疾病模型，利用基因编辑技术在小鼠胚胎干细胞中
进行单基因敲除，进而得到基因敲除小鼠，这对研
究单基因疾病非常重要，是进行病理学研究和药物
筛选的基础 ；在动植物育种方面，利用基因敲除技
术可以得到某特定基因敲除的动植物，获得特定的
性状。例如，敲除 myostain 基因后可获得肌肉量增
多的牛品种［49］。也可利用基因插入技术获得转基因
动物，如乳腺反应器，将某些药物蛋白敲入到牛或
羊的 β-catenin 启动子下，得到可在乳汁中分泌药物
蛋白的动物个体 ；在疾病治疗方面，利用基因编辑
技术对疾病相关的基因突变进行靶向修复，进而达
到基因治疗的目的。总之对于基因的研究离不开基
因组编辑技术，基因组编辑技术的不断更新发展是
必然的趋势。
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（责任编辑 李楠）