全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2016, 42(8): 11601167 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由广东省公益研究与能力建设转型项目(20150209), 国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2011AA10A101)和国家现代农业
产业技术体系建设专项(CARS-01-12)资助。
This study was supported by Public Welfare Research and Capacity Building Transformation Funds in Guangdong (20150209), the National
High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (2011AA10A101), and the China Agricultural Research Sys-
tem (CARS-01-12).
* 通讯作者(Corresponding authors): 郭涛, E-mail: guoguot@scau.edu.cn, Tel: 020-38604903; 陈志强, E-mail: chenlin@scau.edu.cn, Tel:
020-85283237
第一作者联系方式: E-mail: bcjfwang@gmail.com, Tel: 020-38604903
Received(收稿日期): 2015-12-17; Accepted(接受日期): 2016-05-09; Published online(网络出版日期): 2016-05-23.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160523.0853.008.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2016.01160
基于 CRISPR/Cas9技术的水稻千粒重基因 tgw6突变体的创建
王加峰 郑才敏 刘 维 罗文龙 王 慧 陈志强* 郭 涛*
华南农业大学国家植物航天育种工程技术研究中心, 广东广州 510642
摘 要: 利用 CRISPR/Cas9技术对调控水稻产量千粒重基因 TGW6定点编辑, 获得了一套有重要育种价值的 tgw6突
变体。设计了分别由 U3、U6a和 U6b启动子驱动、长 20 bp的 guide RNA (gRNA)靶点以靶向编辑 TGW6基因的外
显子 , 首先将这 3 个靶点一起组装到 pYLCRISPR/Cas9-MT(I)载体上 , 然后利用农杆菌介导侵染水稻材料 H447
(R819/玉针香//R819 的 BC3F6); 提取 T0代转基因植株的基因组 DNA 并对编辑位点附近的 DNA 片段进行 PCR 检测
及测序分析。结果表明, T0代材料中 tgw6的突变频率高达 90%, 其中纯合缺失突变率约占 51%。对 T1代纯合缺失突
变体的千粒重性状的调查分析结果表明, 部分 tgw6 的缺失突变能显著提高千粒重(大于 5%)。不同类型 tgw6 突变体
的成功创建不仅丰富了 tgw6的变异类型, 为水稻的高产稳产奠定了重要的材料基础, 还证实了 CRISPR/Cas9技术在
水稻基因工程育种中高效、易操作的特点。
关键词: 水稻; 基因编辑; CRISPR/Cas9; TGW6; 千粒重
Construction of tgw6 Mutants in Rice Based on CRISPR/Cas9 Technology
WANG Jia-Feng, ZHENG Cai-Min, LIU Wei, LUO Wen-Long, WANG Hui, CHEN Zhi-Qiang*, and GUO
Tao*
National Engineering Research Center of Plant Space Breeding, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China
Abstract: A set of tgw6 (Thousand-grain weight 6) mutants were constructed using CRISPR/Cas9 technology in this study. Three
sites of 20 nt guide RNA (gRNA) targeted to the exon of TGW6 were designed and transcribed from the U3, U6a, or U6b promo-
ters, respectively. The three target sites of gRNA were then ligated to the vector pYLCRISPR/Cas9-MT(I) based on golden gate
cloning strategy. The recombinant plasmid was transferred to a rice cultivar, H447 (R819/Yuzhenxiang//R819 BC3F6) by Agro-
bacterium-mediated transformation. Sequencing for the genomic DNA of TGW6 locus in T0 rice showed the mutagenesis fre-
quency for TGW6 was more than 90%, including 51% of homozygous deletion mutations. Further analysis for the T1 mutants
showed that almost all the homozygous deletion mutants improved the thousand-grain weight significantly (more than 5%). The
successful tgw6 editing not only provided a series of tgw6 mutants for high and stable yield of rice but also proved that
CRISPR/Cas9 is a facile and powerful means of rice genetic engineering for scientific and agricultural applications, which has
important theoretical and practical significance for rice breeding.
Keywords: Rice; Genome editing; CRISPR/Cas9; TGW6; Thousand-grain weight
水稻(Oryza sativa L.)是世界上重要的粮食作物
之一。由于人口的不断增长, 人们对粮食的需求也
越来越大, 但水稻的单位面积产量一直没有太大提
升, 而且水稻的种植面积也在持续下降, 严重威胁
着我国的粮食安全。要解决这一问题, 必须借助新
技术和新的遗传改良策略。粒重是水稻产量构成的
第 8期 王加峰等: 基于 CRISPR/Cas9技术的水稻千粒重基因 tgw6突变体的创建 1161


三因子之一, 主要决定于籽粒胚乳中淀粉的合成与
积累和籽粒的大小, 表现为典型的数量性状, 适当
提高千粒重, 有利于产量的提高[1]。目前, 已经克隆
的千粒重相关基因有qSW5/GW5[2-3]、TGW6[4]、GS3[5]、
GS5[6]、GW2[7]、GW8[8]、qGL3/qGL3-1/GL3.1[9-11]等。
其中, TGW6 (Thousand-Grain Weight 6)是调控水稻
千粒重性状的最重要的基因之一。TGW6基因编码吲
哚乙酸-葡糖糖水解酶, 其功能缺失突变(313 bp)会
引起胚乳中吲哚乙酸含量下降 , 进而细胞数量增
加、粒长和粒重增加, 使水稻抽穗前籽粒的碳水化
合物积累 , 使日本晴产量增加15%, 且不影响稻米
品质[4]。
CRISPR/Cas9系统是近几年发展的一种准确、
便捷、高效率的生物基因组编辑方法。该系统仅需
要短的gRNA和核酸酶(Cas9)就可以使特定的生物
靶基因定点突变, 为生物定点编辑技术的发展注入
了新的活力[12-14]。目前, CRISPR/Cas9系统不但在酵
母、果蝇、鼠、人等生物中, 而且已成功在拟南芥、
烟草、甜橙、水稻、小麦、高粱、玉米以及苔藓植
物地钱等植物中实现了定点基因组编辑 [15-19], 但
对水稻育种中有重要价值的产量、品质、育性等关
键基因的定向编辑研究鲜有报道 , 更缺乏对相关
突变体的育种价值评价。本研究利用CRISPR/Cas9
技术定点编辑了调控水稻千粒重的TGW6基因 , 获
得了一套具有重要应用价值的水稻 tgw6突变体新
种质 , 为进一步提高水稻产量奠定了重要的材料
基础。
1 材料与方法
1.1 水稻材料、CRISPR/Cas9及 gRNA载体
水稻材料H447为籼稻恢复系R819与优质米常
规籼稻品种玉针香杂交后 , 以R819为轮回亲本回
交、自交得到的BC3F6代品系。该品系具有抗稻瘟病、
株型紧凑、米质优等特点。Cas9载体pYLCRISPR/
Cas9-MT(I)及gRNA载体pYL-U3/U6a-b-gRNAs (图1)
由华南农业大学刘耀光研究员馈赠。
1.2 gRNA靶点选择及其寡核苷酸链引物的设计
根据调控水稻TGW6的外显子序列(GenBank登
录号为AB513135.1), 设计TGW6的gRNA。按A/G(N)
20NGG序列设计20 nt的寡核苷酸gRNA核心序列 ,
在水稻基因组数据库中比对设计好的gRNA序列以
排除非特异性的靶切位点。寡核苷酸序列见表1。同
时设计CRISPR鉴定引物Cas9-TGW6testF: 5-CAAC
CAAACCAAAGCCTGC-3和Cas9-TGW6testR: 5-C
CAATGCCTCATCAACTTAC-3。所有寡核苷酸链引
物均由Thermo Fisher Scientific公司合成。

图 1 YLCRISPR/Cas9-MT(I)及 pYL-U3/U6a-b-gRNA质粒图
Fig. 1 Maps of YLCRISPR/Cas9-MT(I) and pYL-U3/U6a-b-gRNA vectors
1162 作 物 学 报 第 42卷


表 1 gRNA靶点以及寡核苷酸序列
Table 1 Target sites of the gRNA and the oligonucleotide
sequences
引导 RNA
gRNA
寡核苷酸序列
Oligonucleotide sequence (5–3)
TGW6U3-T1-F ggcaGCCAGCATCTGGACCTCGG
TGW6U3-T1-R aaacCCGAGGTCCAGATGCTGGC
TGW6U6a-T2-F gccGGCTACAGCCATGAGAAGCA
TGW6U6a-T2-R aaacTGCTTCTCATGGCTGTAGC
TGW6U6b-T3-F gttgAGGCAAGCGGCGACCGCGG
TGW6U6b-T3-R aaacCCGCGGTCGCCGCTTGCCT

1.3 三靶点 pYLCRISPR/Cas9-tgw6-gRNA载体
的构建
参照Ma等[18]的方法略作修改。(1)制备双链接
头。分别取等量每个靶点的1对gRNA寡核苷酸链的
上游引物与下游引物混合(终浓度1 µmol L–1), 95℃
处理30 s, 然后移至室温冷却完成退火; (2)酶切。取
pYL-U3-gRNA、pYL-U6a-gRNA及pYL-U6b-gRNA
质粒各1 μg, 制备20 μL反应体系, 用5~10 U Bsa I
(NEB)酶切20 min, 70℃处理10 min使酶失活; (3)连
接和PCR扩增 : 分别将酶切过的pYL-U3-gRNA、
pYL-U6a-gRNA及pYL-U6b-gRNA质粒与各自所对
应双链接头连接, 然后分别利用引物B1’/B2 (B1’:
5-TTCAGAGGTCTCTCTCGCACTGGAATCGGCA
GCAAAGG-3; B2: 5-AGCGTGGGTCTCGTCAGG
GTCCATCCACTCCAAGCTC-3)、B2’/B3 (B2’: 5-
TTCAGAGGTCTCTCTGACACTGGAATCGGCAGC
AAAGG-3; B3: 5-AGCGTGGTCTCGTCTTGGTC
CATCCACTCCAAGCTC-3)、B3’/BL (B3’: 5-TTCA
GAGGTCTCTAAGACACTGGAATCGGCAGCAAA
GG-3; BL: 5-AGCGTGGGTCTCGACCGGGTCCA
TCCACTCCAAGCTC-3)对 gDNA (gRNA对应的
DNA序列)进行扩增 , 先95℃ 1 min, 然后按95℃
15 s、60℃ 15 s和68℃ 30 s进行30个循环的反应; (4)
产物纯化、酶切和连接。将所有靶点gDNA PCR产物
回收混合后用20 U Bsa I在37℃酶切30 min, 然后75
℃处理5 min; 将酶切片段纯化后与Bsa I酶切回收的
pYLCRISPR/Cas9-MT(I) 载 体 片 段 利 用 T4 DNA
ligase (NEB) 20℃连接2 h; (5)转化及质粒测序。连接
产物转化DH5α感受态细胞后, 挑取单克隆接种培养,
抽提质粒后利用Asc I进行酶切鉴定 , 并挑取酶切
(Asc I)验证正确的克隆送Thermo Fisher Scientific公
司测序。
1.4 农杆菌介导水稻愈伤遗传转化
参照Hiei等 [20]的方法 , 将构建好的三靶点
pYLCRISPR/Cas9-tgw6-gRNA载体通过电击转化到
农杆菌EHA105中, 将PCR检测呈阳性的克隆用于水
稻愈伤组织转化。
1.5 水稻基因组 DNA提取、突变体的 PCR检测
及测序
采用CTAB法提取转基因水稻基因组DNA[21]。
PCR扩增体系含2.5 μL 10×buffer for KOD-Plus、0.5
μL KOD plus聚合酶(5 U μL–1)、1 μL 25 mmol L–1
MgSO4、2.5 μL 2 mmol L–1 dNTPs、各0.5 μL引物(10
μmol L–1, Cas9-TGW6testF与Cas9-TGW6testR)、0.5
μL模板DNA, 以超纯水补至25 μL。反应条件为94℃
3 min; 32个循环的94℃ 30 s、55℃ 30 s和68℃ 60
s的反应, 最后68℃延伸5 min。扩增产物经1%琼脂
糖凝胶电泳(电泳缓冲液1×TAE), BIORAD凝胶成像
系统观察、照相, 并送Thermo Fisher Scientific公司
测序, 每个样品测序2次。
1.6 无 T-DNA元件 tgw6突变体的鉴定及其千粒
重性状的调查分析
将PCR测序鉴定为突变的T0代转基因单株自交
结实后得到T1代种子。T1代种子播种成苗后提取叶
片基因组DNA进行PCR检测, 对经鉴定tgw6发生了
纯合突变的个体进一步利用引物hptF: 5-AAGCTG
CATCATCGAAATTGC-3与 hptR: 5-AAGAATCTC
GTGCTTTCAGCTTCG-3进行PCR检测以获得不含
T-DNA成分的纯合tgw6突变株系。
采用随机区组设计种植不含T-DNA成分的纯合
tgw6突变株系及H447, 2个重复, 各小区中每个株系
种植6行, 每行6株。株行距为20 cm × 20 cm, 单本栽
插。按大田常规栽培要求实施田间管理(水、肥、病
虫害防治等)。收获成熟种子烘干后从中随机数取饱
满、无病种子1000粒, 称重(g), 2个重复。保证重复
间的差数与平均数之比<5%。采用SPSS13.0计算平
均值和标准误 , 采用单因素方差分析 (One-Way
ANOVA)及Duncan法多重比较, 差异显著性水平为
P≤0.05。
2 结果与分析
2.1 gRNA靶点以及寡核苷酸序列设计
为利用CRISPR/Cas9技术获得 tgw6的突变体 ,
根 据 CRISPR/Cas9 技 术 的 原 理 , 利 用 载 体
pYLCRISPR/Cas9-MT(I)及 pYL-U3/U6a-b-gRNA构
建基因编辑载体。设计了3个靶点以定点编辑千粒重
基因TGW6 (表1), 分别从起始密码子附近开始设计
第 8期 王加峰等: 基于 CRISPR/Cas9技术的水稻千粒重基因 tgw6突变体的创建 1163


这3个靶点 (图2-A), 以保证可以彻底破坏TGW6的
功能 , 然后利用Golden gate的克隆方法 [18]将这3个
靶点 gRNA组装到 pYLCRISPR/Cas9-MT(I)载体上
(图2-B)。

图 2 gRNA靶位点及 CRISPR/Cas9-gRNA的组装示意图
Fig. 2 Target sites of the gRNA and cloning of gRNA cassette into the CRISPR/Cas9 vector
A: 3个靶点分别在 TGW6基因内的位置; B: 3个靶点组装到 pYLCRISPR/Cas9-MT(I)载体而成的 T-DNA元件。
A: positions of three targets in the TGW6 gene locus; B: T-DNA fragment assembled with the three targets and the pYLCRISPR/Cas9-MT(I)
vector.

2.2 pYLCRISPR/Cas9-tgw6-gRNA载体的鉴定
将构建的三靶点pYLCRISPR/Cas9-tgw6-gRNA
载体利用Asc I酶切, 如图3所示, 3个靶点gDNA序列
能被同时切出(1.8 kb左右), 表明三靶点gRNA元件
顺利插入到pYLCRISPR/Cas9-MT(I)载体上。为进一
步确定靶位点的准确性 , 利用引物U3s (5-GCATG
GATCTTGGAGGAATCAGA-3)、U6as (5-GGCTA
TCGAGATGCCATACA-3)及U6bs (5-AGAGAAGC
CTAGTGTGCTCT-3)分别对各个靶点(Target 1~3)测
序分析。结果表明(图4), 通过Bsa I位点组装的3个靶
点序列都与所设计靶点序列(表1)一致, 因此所构建
的pYLCRISPR/Cas9-tgw6-gRNA载体适宜于下一步
农杆菌介导的水稻遗传转化。

图 3 AscI酶切鉴定 pYLCRISPR/Cas9-tgw6-gRNA载体
Fig. 3 Identification of the pYLCRISPR/Cas9-tgw6-gRNA
plasmid digested with Asc I
M: 1 kb DNA ladder marker; 1: pYLCRISPR/Cas9-tgw6-gRNA.
2.3 tgw6突变体的鉴定
采用CTAB法提取T0代再生水稻植株的叶片 ,
对潮霉素基因检测为阳性的植株利用引物Cas9-
TGW6testF及Cas9-TGW6testR对 tgw6编辑位点上下
游200 bp左右区域DNA片段进行PCR扩增。电泳结
果(图5-A)表明, 扩增产物中多为tgw6片段缺失纯合
体, 也有部分双等位杂合突变体存在。进一步对扩
增产物的测序分析表明(图5-B), tgw6突变频率高达
90%, 其中51%为片段缺失纯合体(缺失片段长度均
在100 bp以上), 39.5%是双等位杂合突变体。
2.4 无 T-DNA元件 tgw6突变体的鉴定及其千粒
重分析
为进一步获得无 T-DNA 插入元件的 tgw6突变
体, 将 T1代 tgw6缺失纯合突变的种子播种成苗, 苗
期利用引物 hphF与 hphR对潮霉素基因进行 PCR检
测。结果表明, T1代转基因苗中潮霉素基因的分离符
合孟德尔定律 (数据未列出 ), 图6中列出了对部分
tgw6突变体潮霉素基因 PCR 检测的结果, 以进一步
对这些材料进行千粒重性状的分析。对 T2代种子千
粒重调查结果表明(表2), 所分析的5种类型的纯合
缺失突变都显著提高了水稻的千粒重(大于5%)。
3 讨论
CRISPR/Cas9是一种新兴的基因定点编辑技术,
具有较高的特异性和编辑效率。相对于锌指核酸酶
(zinc-finger nucleases, ZFNs)[22-24]及 TALE 核酸酶
1164 作 物 学 报 第 42卷



图 4 3个靶点序列的测序结果
Fig. 4 Sequencing results for the three target sequences

图 5 tgw6突变体的 PCR检测及其与野生型序列比对分析
Fig. 5 PCR identification and sequence alignment of tgw6 mutants compared to the WT line
A: T0代(1~22)水稻 tgw6编辑位点附近 DNA片段的 PCR检测结果, 野生型(WT)为 H447, 水稻扩增长度为 953 bp; B: 对应于 A的 PCR
产物的测得序列与野生型(WT)的序列比对结果。“Frequency”指 A电泳图对应的突变体中同一类型编辑位点突变个体出现的频率。
A: PCR identification results for the DNA fragments near the edited locus of the tgw6 T0 mutants (1–22) and WT line (H447); B: sequence
alignment of tgw6 mutants compared to the WT line. “Frequency” refers to the frequency of the same edited mutation among the corre-
sponding mutants in the electrophoresis map of A.

(transcription activator like effector nucleases,
TALENs)[25-27] 2种基因编辑技术, CRISPR/Cas9技术
构建简便灵活 , 仅需要一个gRNA及一个核酸酶
(Cas9)即可实现对靶基因DNA序列的剪切。目前的
研究主要集中于CRISPR/Cas9技术的开发及特定基
因敲除。
第 8期 王加峰等: 基于 CRISPR/Cas9技术的水稻千粒重基因 tgw6突变体的创建 1165



图 6 部分 tgw6突变体潮霉素基因的 PCR检测
Fig. 6 PCR identification for hph gene of parts of tgw6 mutants
1: WT; 2~5: 缺失 103 bp的突变体; 6~9: 缺失 123 bp的突变体; 10~13: 缺失 141 bp的突变体; 14~17: 缺失 144 bp的突变体;
18~21: 缺失 148 bp的突变体。
1: WT; 2–5: the 103-bp deletion-mutants; 6–9: the 123-bp deletion-mutants; 10–13: the 141-bp deletion-mutants; 14–17: the 144-bp
deletion-mutants; 18–21: the 148-bp deletion-mutants.

表 2 不同类型 tgw6缺失突变体的千粒重测定结果
Table 2 Thousand grain weight of different types of homozygous deletion mutants of tgw6
突变类型
Mutant type
缺失碱基数
Base deletion (bp)
千粒重
Thousand-grain weight (g)
增加比例
Percentage increased (%)
野生型 Wide type 0 22.0±0.50 a 0
1 103 23.1±0.57 b 5.0
2 123 23.4±0.50 b 6.3
3 141 23.1±0.47 b 5.0
4 144 23.7±0.38 b 7.7
5 148 24.0±0.35 b 8.2
表中所列数据为平均值±标准误; 表中同列数据后字母相同者表示在 0.05水平上差异不显著(Duncan’s法)
Data listed in the table are mean±standard error; values followed by the same letter within the same column are not significantly
different at the 0.05 probability level (Duncan’s method).

本研究中利用多靶点gRNAs对水稻的TGW6基
因进行一次性定点编辑, 获得了一系列不同类型的
tgw6突变体 , T0代 tgw6的突变频率高达90%, 其中 ,
tgw6纯合缺失突变比例约占51%, 表明多靶点的定
点编辑利于在T0代获得纯合缺失突变的类型。对T1
代的幼苗所含潮霉素基因的PCR检测结果与大多农
杆菌介导的水稻遗传转化一致, 潮霉素基因的分离
也符合孟德尔定律, 因此通过转基因T0代植株自交
便可以在T1代分离出无转基因成分的tgw6纯合缺失
突变株系。虽然Xu等[19]指出, T1代转基因植株的突
变将具有不确定性, 到T2代以后该突变才能稳定遗
传, 这主要是由基因编辑时选用的靶点过少(通常为
1个)造成的 , 单靶点很难造成大片段的缺失 , 多是
碱基的替换或者插入等突变, 使得T1代转基因植株
靶基因的编辑位点还可能存在gRNA靶点识别的序
列, 导致发生再次编辑, 从而使得突变具有不确定
性; 相反, 利用2个以上靶点进行的基因定点编辑可
以提高纯合缺失突变的频率, 在T0代就可能获得可
以稳定遗传给T1代的突变。虽然单靶点的基因编辑
也会出现纯合突变的变异类型, 但是突变率大多在
20%以下 [19], 而且难以利用PCR鉴定出来 , 一般需
要借助对变异位点附近的DNA片段测序才能鉴定出
来。另一方面, 由于gRNA识别序列较短(20 bp左右),
靶点多造成脱靶的可能性越大[28], 水稻等植物可以
通过回交等手段来降低脱靶的影响。在利用
CRISPR/Cas9技术进行水稻等植物相关性状突变体
的创建过程中, 需要综合考虑合理选择转化受体及
靶点位置和数量, 如本研究中对突变体千粒重性状
分析发现, 突变体的千粒重都比对照提高了5%以上,
但与已知的tgw6突变体(313 bp缺失)会使日本晴产
量增加15%[9]的结果不太一致 , 推测可能是材料背
景差异或者突变位点的差异引起的。
随着人类对粮食的高产、高品质需求的不断提
高, 仅对基因进行定向改良是远远不够的, 如何对
特定育种材料进行多基因的一次性导入成为亟待解
决的问题。随着研究的不断深入, 人们已经发现利
用CRISPR/Cas9剪切形成的缺口可促进外源基因片
段高效重组到基因组中, 这一发现已先后在细菌、
1166 作 物 学 报 第 42卷


酵母、老鼠、果蝇、斑马鱼、线虫上取得了成功[29-35]。
由于植物的特殊性 , 使得依赖于CRISPR/Cas9的基
因导入技术发展相对较慢, 即使如此, 有研究小组
已经利用双生病毒载体系统在烟草、番茄中取得了
成功[36-37]。相信在1~2年内该技术也会在水稻中被成
功应用, 这一技术的发展将会对水稻品种抗性、品质
等改良起到重大推动作用, 具有广阔的应用前景。
4 结论
获得了类型较为丰富(多碱基缺失、插入等)的
tgw6突变体, 为进一步应用于水稻的高产、稳产育种
奠定了重要材料基础。为快速创建稻米品质(fgr、
Chalk)、雄性不育(tms5)等生产上有重要应用价值的
水稻优异新种质提供了重要参考, 并有望为水稻种
质资源创新提供安全、高效的新途径, 具有重要的
理论和实践意义。

致谢 : 感谢华南农业大学刘耀光研究员提供的
pYLCRISPR/Cas9-MT(I)及 gRNA载体(pYL-U3/U6a-
b-gRNAs)。
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