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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第12期
丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein
kinase，MAPK）是生物体内一类重要的丝氨酸 / 苏
氨酸蛋白激酶［1］，它可通过磷酸化作用将胞外信号
转化到胞内，从而激活一系列的转录因子或其他效
应分子，使机体产生对外界刺激的应答［2］。MAPKs
包括 4 个亚家族 ：细胞外调节激酶（ERK）、c-jun
收稿日期 ： 2014-03-27
基金项目 ：广东省国际合作项目（2012B050600029），广东高校国际合作创新平台项目（2013gjhz0008）
作者简介 ：夏洪丽，女，硕士，研究方向 ：水产动物病害防治 ；E-mail ：xiahongli0427@163.com
通讯作者 ：鲁义善，男，博士，硕士生导师，研究方向 ：水产动物免疫学及病害防治 ；E-mail ：fishdis@163.com
红笛鲷 p38β MAPK 基因的克隆及原核表达
夏洪丽1，2，3  蔡佳1，2，3  鲁义善 1，2，3  简纪常1，2，3  吴灶和2，3，4
（1. 广东海洋大学水产学院，湛江 524088 ；2. 广东省水产动物病原生物学及流行病学重点实验室，湛江 524088 ；3. 广东省教育厅水产经济
动物病害控制重点实验室，湛江 524088 ；4. 仲恺农业工程学院，广州 510225）
摘 要 ： 鱼类 p38 MAPK 基因在宿主免疫调控及抵御病原侵染的过程中具有重要作用。利用 RACE 技术克隆了红笛鲷 p38β
MAPK 基因（Ls-p38β，GenBank 登录号为 KJ502277）。序列分析结果显示，Ls-p38β cDNA 全长 1 628 bp，开放阅读框 1 086 bp，可
编码 361 个氨基酸，预测其编码蛋白的分子量为 41.6 kD，理论等电点为 5.74。该基因推导的氨基酸序列含有 p38 MAPK 家族保守
的双磷酸化激活环（TGY），与尼罗罗非鱼的 p38β 有 97% 的相似性。将此基因定向插入原核表达载体构建重组表达质粒 pET32-
p38β 后导入 BL21（DE3）菌株，利用 IPTG 进行诱导表达。SDS-PAGE 与 Western blot 分析显示约在 60 kD 出现特异蛋白条带，与
预期分子量大小相符，说明 Ls-p38β 融合蛋白表达成功。
关键词 ： 红笛鲷 p38β 丝裂原活化蛋白激酶 原核表达
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.12.030
Cloning and Prokaryotic Expression of p38β MAPK from
Lutjanus sanguineus
Xia Hongli1，2，3 Cai Jia1，2，3 Lu Yishan1，2，3 Jian Jichang1，2，3 Wu Zaohe2，3，4
（1. Fisheries College，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088 ；2. Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenic Biology and
Epidemiology for Aquantic Economic Animals，Zhanjiang 524088 ；3. Key Laboratory of Control for Disease of Aquatic Animals of Guangdong
Higher Education Institutes，Zhanjiang 524088 ；4. Zhongkai University of Agriculture and Engineering，Guangzhou 510225）
Abstract: Humphead snapper（Lutjanus sanguineus）p38β MAPK（Ls-p38β）was cloned using RACE method. The GenBank
accession number is KJ502277. The full-length cDNA of p38β MAPK was 1 628 bp containing an open reading frame of 1 086 bp, encoding
361 amino acids with an estimated molecular weight of 41.6 kD and a theoretical pI of 5.74. Amino acid alignment indicated that Ls-p38β
possessed a Thr-Gly-Tyr（TGY）dual phosphorylation motif of p38 MAPK family and shared 97% similarity with Oreochromis niloticus p38β.
The prokaryotic expression vector pET-p38β was constructed and then transformed into BL21（DE3）. SDS-PAGE and Western blotting
analysis indicated that the recombinant protein of Ls-p38β was successfully expressed and molecular weight of expressed fusion protein was
60 kD.
Key words: Lutjanus sanguineus p38β MAPK Prokaryotic expression
氨基末端激酶（JNK）、p38 MAPK 和大丝裂素活化
蛋白激酶 1（BMK1）。其中 p38 MAPK 能在宿主受
到紫外线照射、热激、高渗透压、炎症因子和生长
因子等外界刺激时被激活，进而参与炎症、细胞生长、
细胞分化和细胞死亡等多个生理过程［3］。
目 前， 已 报 道 的 p38 MAPK 基 因 包 括 p38α、
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第12期178
p38β、p38γ、p38δ 四 种 亚 型［4，5-8］， 其 中 p38α 和
p38β 几乎在所有组织都表达，p38γ 和 p38δ 只在肌
肉、胰腺、肠和肾等组织中表达［6，7，9］。该家族的
所有成员均具有“T-G-Y” 结构域［10］，在 经典的
三级级联反应中，MAPK 激酶的激酶（MAPKKK）
和 MAPK 激酶（MAPKK）可以同时磷酸化激活环
“T-G-Y”中的 T（苏氨酸）和 Y（酪氨酸），从而
活化 p38 MAPK［11］，调控下游基因的表达。哺乳动
物中 p38 MAPKs 参与了多种炎症因子，如 TNF-α、
IL-6 和 IL-2 的诱导表达，与机体炎症反应的调节
有关［12-15］；此外，病毒感染也能激活哺乳动物 p38
MAPKs， 如 柯 萨 奇 病 毒 B3 型（coxsackievirus B3）
的感染能激活机体 p38，从而可抑制 p38 的磷酸化
并能够减少病毒诱导的细胞死亡以及病毒粒子的释
放［16］；而在 2 型猪圆环病毒（PCV2）的感染中，
抑制 p38 MAPK 的激活能降低病毒诱导的 Caspase 活
性［17］。以上结果表明哺乳动物的 p38 MAPK 在宿主
免疫反应中发挥着重要作用。
目前，鱼类 p38 MAPK 仅在斑马鱼［18］、大西
洋鲑［19］和点带石斑鱼［20］等少数物种中有报道。红
笛鲷（Lutjanus sanguineus）是我国南方重要的海水
养殖鱼类，但近年来由于养殖密度的提高与养殖环
境的恶化，红笛鲷养殖中病害频发［21］。鉴于鱼类
p38 MAPK 在免疫调控及抵御病原侵染发挥着重要
的作用［19，20，22-24］，且目前学术界尚未见红笛鲷 p38
MAPK 的相关研究报道，本研究通过同源克隆与
RACE-PCR 扩增得到了红笛鲷 p38β cDNA 全长序列
（Ls-p38β），并成功获得了体外表达的重组蛋白，为
后续该基因的功能研究奠定坚实的基础。
1 材料与方法
1.1 材料
试验用鱼（500 g 左右）购于湛江市东风市场 ；
克隆载体 pMD18-T Vector 购自 TaKaRa 公司 ；UNIQ-
10 柱式 Trizol 总 RNA 抽提试剂盒购自上海生工生物
技术有限公司 ；Ex Taq DNA 聚合酶、PrimeSTARTM
HS（Premix）、Reverse Transcriptase M-MLV 购自 Ta-
KaRa 公司 ；SMARTerTM RACE 试剂盒购自 CLONTE-
CH ；DNA 胶回收试剂盒购自 Thermo 公司 ；限制性核
酸内切酶 EcoR I 和 Xho I、T4 DNA 连接酶购自 NEB
公司 ；PCR 引物均由上海生工生物技术有限公司合
成 ；Eschericia coli DH5α 和 BL21（DE3） 菌 株、 原
核表达载体 pET-32a（+）Vector 由本实验室保存。
1.2 方法
1.2.1 总 RNA 的提取 无菌操作取红笛鲷脾脏组织
10-20 mg，加入 1 mL Trizol，研磨处理，按的 UNIQ-
10 柱式 Trizol 总 RNA 抽提试剂盒（上海生工）说明
书提取红笛鲷脾脏组织的总 RNA。
1.2.2 片段扩增 利用所得到的 mRNA，按照 Ta-
KaRa 公司的 Reverse Transcriptase M-MLV 说明书进
行 cDNA 第一链的合成，根据已报道的人类（NP_0-
02742）、小家鼠（NP_035291）、斑马鱼（NP_001002095）
和点带石斑鱼（JN408833）p38β 基因设计简并引物
p38-F 和 p38-R（表 1），以上述 cDNA 为模板，在下
列缓冲体系中 ：模板 1 μL，引物 p38-F、p38-R 各 1
μL，Ex Taq buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，Ex Taq 0.2 μL，
ddH2O 补足至 25 μL。按照如下程序进行 PCR 反应 ：
94℃预变性 3 min ；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，
共 34 个循环，72℃延伸 10 min。电泳检测 PCR 产
物，将目的条带切胶回收，回收产物连接 pMD18-T
载体，转化到 DH5α 感受态细胞中，挑取单菌落，
利用菌落 PCR 鉴定，将阳性克隆送到上海生工测序。
1.2.3 RACE PCR 扩增 p38β 的全长 根据所得基因
片段，设计 3RACE 特异性引物 3-1、3-2 和 5RACE
特异性反向引物 5-1、5-2（表 1），RACE PCR 模板
的制备参照 CLONTECH 的 SMARTerTM RACE 试剂盒
说明书。利用 3/5 cDNA 一链，特异引物 3-1/5-1
和 UPM Mix 进行第一轮 PCR 扩增，反应体系如下 ：
3/5 cDNA 一链 1 μL，UPM Mix 1 μL，3-1/5-1 1 μL，
Primer Star Mix 10 μL，ddH2O 补足至 20 μL。PCR 反
应条件 ：98℃预变性 3 min ；94℃ 30 s，72℃ 2 min，
4 个循环 ；94℃ 30 s，70℃ 30 s，72℃ 1 min 4 个循
环 ；94℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃ 1 min，24 个循环 ；
72℃延伸 10 min 。将第一轮的 PCR 产物稀释 10 倍
作为模板，进行巢式 PCR，反应体系如下 ：模板
1 μL，引物 3-2、5-2 各 1 μL，LA Taq buffer 2.5 μL，
dNTP 2 μL，LA Taq 0.2 μL，ddH2O 补足至 25 μL。反
应条件为 98℃预变性 3 min ；94℃ 30 s，68℃ 30 s，
72℃ 1 min，34 个循环，72℃延伸 10 min。3 巢式
2014年第12期 179夏洪丽等 ：红笛鲷 p38β MAPK 基因的克隆及原核表达
PCR 产物的切胶回收，连接，转化，菌落 PCR 鉴定，
测序同 1.2.2。
表 1 本试验所用引物
引物 序列（5-3）
p38-F CAGGAGVTVAMYAARAVATHTGGGAGGT
p38-R ACATTWTCRTGYYTCATRTGYTTGAG
3-1 CCGGAGCGGTACCAGAACCTG
3-2 GATGTCGTCCTGCGGCAGAAG
5-1 CAGGTTCTGGTACCGCTCCGG
5-2 ACCTCCCAGATGGTCTTATTGA
UPM MIX CTAATACGACTCACTATAGGGC
NUP AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT
pET-p38-F CGGAATTCATGTCCGCCAGACCAGGATTTT
pET-p38-R CCGCTCGAGTTACTGCTCCACCTGAAGGCTATCA
1.2.4 序列分析 测序结果经 DNAMAN 软件拼接
得到的 cDNA 序列在 NCBI 上进行同源比对和相似
性 分 析 ；利 用 NCBI 的 ORF finder 确 定 ORF， 利
用 Genetyx 7.0 翻译得到氨基酸序列 ；利用 Clustal X
2.0 进行氨基酸多重序列比对 ；利用 Clustal X 2.0 和
MEGA 5.0 构建系统进化树。
1.2.5 构建重组质粒 根据测序结果，设计 p38β
基因的开放阅读框的引物。在引物的 5 和 3 端分
别加上 EcoR I 和 Xho I 酶切位点。扩增红笛鲷 p38β
的 ORF， 所 得 PCR 产 物 切 胶 回 收 后 与 T 载 体 连
接、转化、阳性克隆鉴定方法同 1.2.2。将构建成
功的质粒命名为 pMD18-p38β，根据全式金公司的
EasyPure Plasmid MiniPrep Kit 说明书提取 pET-32a 以
及 pMD18-p38β 质粒。利用 EcoR I 和 Xho I 分别对其
进行双酶切，将酶切产物用 T4 连接酶连接，其余步
骤同 1.2.2。将测序正确的克隆命名为 pET-p38β，扩
大培养后提取质粒转化到 BL21 感受态细胞，阳性
克隆鉴定同 1.2.2。
1.2.6 重组蛋白的诱导表达 阳性克隆菌液接种于
50 mL LB 液体培养基（Amp+），37℃，200 r/min 培
养过夜，次日按 1∶100 接种到新的 LB 培养基（Amp+）
中，37℃培养至 OD 值为 0.4-0.6 时，加入 IPTG 至
终浓度为 0.7 mmol/L，37℃继续振荡培养，6 h 后离
心收集沉淀，用 PBS 重悬菌体，置于冰上进行超声
破碎，SDS-PAGE 检测蛋白表达情况。
1.2.7 Western blot 分析 使用 Bio-Rad 公司的蛋白
印迹装置将 pET-p38β 蛋白的电泳产物转印到 PVDF
膜上，用 6-His-Tag 单克隆抗体作为一抗，37℃孵育
2 h ；TBST 清洗 4 次，每次 10 min ；HRP-标记的羊
抗鼠 IgG 作二抗，孵育 2 h，TBST 清洗 4 次，每次
10 min ；加入 DAB 显色液至有清晰的目的条带出现，
用 ddH2O 终止反应，并冲洗 10 min 以终止显色，拍
照记录。
2 结果
2.1 红笛鲷p38β基因的克隆
红笛鲷 p38β 基因 cDNA 序列全长 1 628 bp，包
括 5UTR 108 bp、3UTR 434 bp 和 ORF 1 086 bp，
可 编 码 361 个 氨 基 酸（ 图 1）， 预 测 蛋 白 分 子 量
41.6 kD。
2.2 序列分析
氨基酸的比对结果（图 2）显示 Ls-p38β 的氨基
酸序列与尼罗罗非鱼（O.niloticus）、斑马鱼（D.rerio）、
青鳉（O.latipes）、点带石斑鱼（E.coioides）、红鳍东
方鲀（T.rubripes）高度同源（图 3），其中与尼罗罗
非鱼的氨基酸序列相似度高达 97%。
2.3 原核表达
SDS-PAGE 电 泳（ 图 4） 表 明， 重 组 质 粒
pET32-p38β 在大肠杆菌 BL21 中表达，表达的融合
蛋白分子量约 60 kD，和理论值相符。Western blot
检测结果和 SDS-PAGE 电泳结果一致。
3 讨论
p38 MAPK 是一类真核生物中高度保守的信号
转导因子，在多种生理及病理过程中扮演着重要角
色。目前 p38MAPK 的功能研究主要集中在大西洋
鲑［19］和点带石斑鱼［20］中，在其他鱼类的研究中还
相对较少。本试验克隆得到了红笛鲷 p38β MAPK 基
因（Ls-p38β），氨基酸序列比对结果显示，Ls-p38β
与其他鱼类的 p38β 相似度较高，进化分析显示 Ls-
p38β 与其他鱼类的 p38β 聚为一枝，与哺乳类 p38β
蛋白进化距离较远，表明鱼类 p38β 具有高度保守性。
氨基酸序列分析表明 Ls-p38β 具有该家族保守
的“T-G-Y”结构域和“ATRW”底物结合位点。两
者在 p38 MAPK 的磷酸化以及与底物的相互作用中
都具有重要作用。“T-G-Y”三肽序列存在于蛋白
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第12期180
图中用灰色阴影标记的氨基酸表示“T-G-Y”结构域和“ATRW”底物结合位点 ；黑体字和 * 分别代表起始和终止密码子
图 1 红笛鲷 p38β 基因 cDNA 全长及编码的氨基酸序列
激酶第Ⅶ和第Ⅷ结构域之间，该区域被称作 T 环
（L12 环状结构），由于 T 环最接近激活位点，是决
定 MAPK 激酶活性的关键部分，T 环的长度会影
响其底物的特异性和自主磷酸化作用［25］。研究表
明，哺乳动物 p38β 的 T 环结构较短，使得 Y（酪氨
酸）位点难以被磷酸化。经典的 MKK 途径通过同
时磷酸化活化环上的苏氨酸和酪氨酸位点而激活人
类 p38 信号，但是 p38 活化还存在非经典的激活方
式。2005 年，Salvador 等［26］发现，在活化的人类 T
细 胞 中，ZAP-70 磷 酸 化 p38α 和 p38β 的 Tyr323 以
后，引起 Thr180 和 Tyr182 发生自身磷酸化，从而
导致 p38 信号被激活。近年来越来越多的研究表明，
p38 MAPK 在炎症反应和细胞因子表达的调控中都
发挥着关键作用［27］，姜勇和 Chen 等［28-31］通过 p38
MAPK 无活性突变体以及负显性突变技术，发现哺
乳类 p38 MAPK 发挥生物功能依赖于“T-G-Y”结构
域 和 Thr180、Tyr182 位 点。2011 年，Ulli 等［32］ 通
过研究大西洋鲑的 p38α 的结构及其新的功能域交
换的二聚活化模式，发现 Tyr323 的磷酸化及二聚化
能够活化 p38α 信号，揭示鱼类 p38 MAPK 的激活能
够通过一种非经典的磷酸化传导构象来完成。而本
研究中红笛鲷 p38β MAPK 是否也具备相似的特征还
有待于进一步的研究。而在本研究中鉴定的红笛鲷
p38β MAPK 也含有 p38 MAPK 家族保守的功能结构
2014年第12期 181夏洪丽等 ：红笛鲷 p38β MAPK 基因的克隆及原核表达
L. sanguine ：
O. niloticu ：
E. coioides ：
O. latipes ：
T. rubripes ：
D. rerio ：
H. sapiens ：
M. musculus：
L. sanguine ：
O. niloticu ：
E. coioides ：
O. latipes ：
T. rubripes ：
D. rerio ：
H. sapiens ：
M. musculus：
L. sanguine ：
O. niloticu ：
E. coioides ：
O. latipes ：
T. rubripes ：
D. rerio ：
H. sapiens ：
M. musculus：
L. sanguine ：
O. niloticu ：
E. coioides ：
O. latipes ：
T. rubripes ：
D. rerio ：
H. sapiens ：
M. musculus：
L. sanguine ：
O. niloticu ：
E. coioides ：
O. latipes ：
T. rubripes ：
D. rerio ：
H. sapiens ：
M. musculus：
：79
：79
：79
：79
：79
：79
：80
：80
ED site TGY motif Substrate bindine site
：239
：239
：239
：239
：239
：239
：240
：240
：319
：319
：319
：319
：319
：319
：320
：320
：361
：361
：361
：361
：361
：361
：364
：364
：159
：159
：159
：159
：159
：159
：160
：160
箭头表示保守的氨基酸识别位点，方框表示“T-G-Y”磷酸化结构域和保守的底物结合位点“ATRW”
图 2 红笛鲷 p38β 与其他物种 p38β 氨基酸序列比对结果
M.musculus
H.sapiens
T.rubripes
X.maculatus
▲L.sanguineus
O.latipes
E.coioides
O.niloticus77
72
75
43
97
D.rerio
100
0.02
116.0
kD
M 1 2 3 4 5 6
66.2
45.0
35.0
25.0
18.4
▲表示红笛鲷 p38βMAPK 的氨基酸序列
图 3 红笛鲷 p38β 的进化分析
M ：蛋 白 分 子 Marker ；1 ：未 诱 导 pET32-p38β ；2 ：诱 导 pET32-p38β ；
3 ：pET32-p38β 诱导，超声分离的上清 ；4 ：pET32-p38β 诱导、超声分离的沉
淀 ；5 ：纯化的蛋白 ；6 ：pET32-p38β 免疫印迹
图 4 pET32-p38β 重组蛋白的纯化与免疫印迹检测
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第12期182
域“T-G-Y”，但是其作用模式及作用机制尚不清楚，
今后我们将通过定点突变、RNA 干扰等技术进一步
去验证，为阐明鱼类 p38 MAPK 的作用机制提供理
论依据。
pET 载体是目前应用最广泛的原核表达系统，
pET-32a 作为宿主菌，能够特异性地识别 T7 启动
子，并且该载体含有 His-Tag 标签，便于蛋白的分
离纯化。刘召民等［33］利用文昌鱼的 p38 重组蛋白
制备的（Amphi-p38）抗体进行了免疫组化试验，发
现 Amphi-p38 在体表皮、肠和肛盲囊都有强烈的表
达信号，这些组织和外界环境直接接触，是文昌鱼
抵御病原侵入的第一道防线，推测文昌鱼的 p38 可
能参与了机体的免疫防御过程。本试验通过构建原
核表达载体 pET32-p38β，成功获得了体外重组蛋白。
以上研究为进一步了解 Ls-p38β 在细胞中的分布和
功能奠定了坚实的基础。
4 结论
本研究从红笛鲷脾脏组织中克隆得到 p38β 基
因；Ls-p38β 具有保守的“T-G-Y”结构域和“ATRW”
底物结合位点，和其他已报道的 p38β 基因高度同源；
构建了原核表达载体 pET32-p38β，转化大肠杆菌，
通过诱导表达获得了大小约 60 kD 的 p38β重组蛋白。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）