全 文 ：生物技术通报
·技术与方法· BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第1期
酵母双杂交及其衍生系统
黄欣媛1 范红波2
（1. 湖北工程学院特色果蔬质量安全控制湖北省重点实验室，孝感 432000 ；2. 湖北职业技术学院，孝感 432000）
摘 要 ： 酵母双杂交系统是一种研究蛋白质相互作用的分子生物学方法，过去 20 多年里，大量衍生系统的出现使得这套双
杂交技术体系更加完善和高效，成为研究蛋白质 -配体相互作用的重要技术手段，广泛应用于功能基因组学、蛋白质组学、病理学
等研究领域。对酵母双杂交及其衍生系统的基本原理和应用进展进行综述。
关键词 ： 酵母双杂交系统 蛋白质相互作用 双杂交技术体系
The Yeast Two-Hybrid System and Its Several Derived Systems
（1. Hubei Key Laboratory of Quality Control
Huang Xinyuan1 Fan Hongbo2
of Characteristic Fruits and Vegetables，Hubei Engineering University，Xiaogan 432000 ；2.Hubei
Polytechnic Institute，Xiaogan 432000）
Abstract:  The Yeast two-hybrid（Y2H）system is a molecular biology approach to detect protein-protein interactions. A diverse series
of technologies derived from it have emerged in the past 20 years, which makes this two-hybrid methodology system more complete and efficient.
They have been among the most important and powerful tools to study ptotein-ligand interactions that widely used in functional genomics,
proteomics and pathology study. This article provides an overview on the basic principles and application progress of Y2H system and some
derived techniques.
Key words:  Yeast two-hybrid（Y2H）system Protein-protein interaction Two-hybrid methodology system
生物大分子间的相互作用是有机体细胞活动的
基础， 在蛋白质层面上揭示生命活动本质是现代生
物学的一个主要目标。1989 年诞生的酵母双杂交
（Yeast two-hybrid，Y2H） 系统以及随后出现的各种
衍生系统是研究蛋白质之间以及蛋白质和 RNA 、小
分子化合物之间相互作用的最重要的工具， 已成功
揭示了大量的蛋白相互作用， 在细胞信号转导、蛋
白质组学、病理学、药物研发等方面有着广泛应用［1］。
本文对 Y2H 系统的基本原理、衍生系统和应用进展
等方面进行介绍。
酵母双杂交系统的原理
酵母 GAL4 转录因子由两个可以分开的结构
域 组 成 ：DNA 结 合 域（DNA binding domain，BD）
负 责 结 合 基 因 的 上 游 激 活 序 列， 将 转 录 激 活 域
（Transcriptional activation domain，AD） 募集到启动
收稿日期 ：2013-08-03
子区域从而激活基因的转录。两者分开时不能激活
基因转录， 只有 BD 和 AD 通过一定方式在空间上足
够靠近， 才能发挥完整的 GAL4 转录因子活性。基
于此特点，Fields 和 Song［2］设想以一对能相互作用
的蛋白质为桥梁， 将空间上分开的 BD 和 AD 彼此
拉近， 从而重建出具有活性的转录因子， 以此创立
了 Y2H 系统。在该系统中， 将 BD 和 AD 基因分别
和诱饵蛋白（Bait） 和猎物蛋白（Prey） 基因构建
成融合蛋白表达载体， 使其在酵母中共表达出 BD-
Bait 和 AD-Prey， 借助 Bait 和 Prey 的物理性相互作
用使 BD 和 AD 相互靠近而产生具有功能的转录因
子， 进而激活 1 个或多个报告基因（ 如 lacZ、HIS3
和 URA3 等） 的转录。
2 酵母双杂交系统的衍生系统
Y2H 系统是在酵母菌这种真核细胞环境中研究
基金项目 ： 特色果蔬质量安全控制湖北省重点实验室开放基金项目（2013K04）
作者简介 ： 黄欣媛， 女， 博士， 研究方向 ： 生物化学与分子生物学 ；E-mail ：huangxycn@gmail.com
1
76 生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第1期
蛋白相互作用的一种技术， 具有操作简便、无需繁
琐的蛋白纯化操作、可以检测较弱的相互作用等优
点［3］。但是也存在假阳性率较高（ 检测到的相互作
用有 20%-50% 在真正生理环境下并不发生［4］）、技
术灵敏度较低（ 一次检测只能涵盖 5%-20% 的真正
相互作用［5］） 等缺陷。针对此， 很多学者不断改进
试验设计和操作技术， 开发出许多衍生系统， 提高
了传统 Y2H 系统的灵敏度和特异性， 极大地扩展了
Y2H 系统的应用范围。
2.1 筛选模式的多元化
在 Vidal 等［6］建立的反向双杂交系统（Reverse
two-hybrid system） 中， 使 用 URA3 作 为 报 告 基 因，
其表达产物对酵母菌具有毒性， 使其不能生长。当
Bait 和 Prey 没有相互作用或互相解离时， 毒性报告
基因不表达， 菌株能正常生长。这种反向筛选（ 负
筛选） 法可鉴定出阻断蛋白间相互作用的因子， 在
研究蛋白质重要结构域和作用位点以及影响蛋白质
结合或解离的因素等方面发挥重要作用［7］。
研究蛋白质 -DNA 相互作用的酵母单杂交系统
（Yeast one-hybrid system）［8］的原理在于 ：Prey 蛋白
可直接与 DNA 相结合， 使得与 Prey 融合的 AD 激活
报告基因的表达， 而无需 BD-Bait 蛋白参与， 故被
命名为“ 单” 杂交系统， 它为转录因子的分离鉴定
研究提供了有效方法［9］。
某些蛋白质的相互作用需要第三个分子如小分
子配体、RNA 等来介导， 三杂交系统（Three-hybrid
system）［10］就是研究这些第三分子的技术。第三分
子通过对 Bait 或 Prey 蛋白进行修饰， 或诱导其构象
发生改变， 从而使两者产生相互作用， 进而激活报
告基因表达。
双 诱 饵 酵 母 双 杂 交 系 统（Dual bait yeast two-
hybrid system）［11］在同一酵母细胞中转入一个 AD-
Prey 和两个不同的 BD-Bait， 如果一个 Bait 与 Prey
之间有相互作用， 则可激活该 Bait 对应的报告基因
的表达， 两个 Bait 都可以和 Prey 作用的话就会激活
所有报告基因。它的优点是仅一次实验就能同时进
行两次独立筛选， 并可比较出这两对蛋白结合能力
的差异。该系统被成功地应用于研究靶蛋白上的作
用位点， 以及药物对蛋白互作的破坏作用［12］。
2.2 报告基因的改进
多个报告基因的引入有利于提高 Y2H 技术的灵
敏度和选择性， 如广泛应用的 PJ69-4A 酵母菌株［13］
包含 HIS3 、ADE2 和 lacZ 三个报告基因。Shaffer 等［14］
以此酵母菌为基础， 改造成 BAPJ69-4A 菌株， 加
入 URA3 作为第 4 个报告基因， 使得基于该菌株的
Y2H 既可用于正筛选， 也可用于负筛选。
lacZ 报告基因的转录主要靠定性或定量的 β-
半乳糖苷酶活性分析来检测， 需要使用发色底物
X-Gal， 而荧光蛋白作为报告蛋白的优点在于不需要
添加额外的底物， 可以通过流式细胞术直接检测并
分离出阳性细胞， 无需繁琐的选择性培养基筛选操
作。如 Chen 等［15］将酵母加强绿色荧光蛋白（Yeast
enhanced green fluorescent protein，yEGFP） 基因、Da-
mon 等［16］ 将 加 强 黄 色 荧 光 蛋 白（Enhanced yellow
fluorescent protein，eYFP） 基因作为报告基因引入
Y2H 系统， 可用荧光显微镜观察报告蛋白的表达，
并可方便地应用流式细胞仪来鉴定筛选蛋白质相互
作用［17］。
2.3 载体构建策略的改进
在表达载体构建上的一些改进措施可以降低
Y2H 系统的假阳性和假阴性率。传统 Y2H 系统中
构建的融合表达载体是将 Bait 或 Prey 蛋白与 BD 或
AD 的 N 端融合，Stellberger 等［18］设计了两个新载
体 ：pGBKCg 和 pGADCg， 分别用于将 BD 的 C 端和
Bait， 以及 AD 的 C 端和 Prey 蛋白融合。在 Y2H 筛
选中， 将这两个载体和已有的两种 N 端融合载体联
用， 可形成 4 种不同的 Bait-Prey 作用组合， 即 NN 、
NC 、CC 和 CN 。经过对水痘带状疱疹病毒的 70 种
蛋白质组合成的约 4 900 个候选作用配对进行测试
发现， 综合使用 4 种载体组合所筛选到相互作用是
传统 Y2H 使用单一 NN 组合的两倍， 显著降低了假
阴性率。此外， 各组合得到的相互作用结果还可以
互相印证， 进一步削减了假阳性率［19］。
2.4 宿主系统的扩展
细菌双杂交和哺乳动物双杂交的出现将 Y2H
的宿主由酵母细胞扩展到细菌和哺乳动物细胞内。
细 菌 双 杂 交 系 统（Bacteria two-hybrid system） 由
Karimova 等［20］设计， 利用腺苷酸环化酶缺陷型大
77 2014年第1期 黄欣媛等 ： 酵母双杂交及其衍生系统
肠杆菌中 Bait 和 Prey 蛋白的相互作用， 重建腺苷酸
环化酶催化功能， 引起 cAMP 的合成， 进一步活化
cAMP/CAP 依赖型启动子， 激活报告基因转录进而
引发信号转导级联反应。该系统最大优点是细菌的
转化效率比酵母更高， 可综合性分析更大更复杂的
蛋白互作网络，因而得到了广泛应用［21］。如 Kim 等［22］
利用细菌双杂交筛选出人 CPI-17 蛋白的 14 个作用
蛋白， 其中桥粒斑珠蛋白可能参与 CPI-17 介导的内
皮细胞骨架重组。经 Battesti 等［23］改良的细菌双杂
交系统可适用于研究带标签的重组蛋白， 而且可方
便地将其基因转移到带有 6-His 、钙调蛋白结合肽或
pBAD 标签的载体上， 更利于蛋白质的亲和纯化。
酵 母 属 低 等 真 核 生 物， 对 蛋 白 质 的 翻 译 后
修饰水平有限， 某些蛋白质在酵母中不能被糖基
化、磷酸化或不能正确折叠。哺乳动物双杂交系
统（Mammalian two-hybrid system，M2H） 可 适 用 于
检测相互作用依赖于翻译后修饰的蛋白质［24，25］。
其基本原理和 Y2H 系统类似， 借由 Bait 和 Prey 在
哺乳动物细胞中相互作用而激活报告基因的表达。
哺乳动物双杂交系统内容丰富， 各方法采用的表
达载体、宿主细胞以及报告基因等种类各异， 如
MAPPIT 系 统（Mammalian protein-protein interaction
trap system）［26］ 利用的是哺乳动物细胞中由蛋白
相互作用引起的 STAT 转录因子的激活 ；trM2H 系
统（Tetracycline repressor-based mammalian two-hybrid
system）［27，28］利用 HEK293 细胞中四环素阻遏蛋白
因为 Bait-Prey 相互作用而形成二聚体， 再和四环素
操纵基因结合， 进而激活报告基因 GFP（ 绿色荧光
蛋白） 表达。哺乳动物双杂交系统目前仍在不断完
善和发展中， 广泛应用于多种哺乳动物蛋白互作研
究［29］。如 Guo 等［30］利用 M2H 系统发现了 p300 蛋
白的 Ser12 以及 CBP 蛋白的 Ser92 磷酸化位点分别
是调节二者和 β-catenin 之间相互作用的重要位点。
2.5 核外双杂交系统
传统 Y2H 检测的相互作用发生在酵母细胞核
中， 而 SOS 募集系统（SOS recruitment system）［31］、
分裂泛素系统（Split ubiquitin system）［32］以及分裂
TEV 蛋白酶系统（Split TEV protease system）［33］ 等
核外双杂交系统把相互作用场所转移到了细胞核外。
SOS 募集系统利用待测蛋白的相互作用， 将 SOS 蛋
白从胞浆中募集到细胞膜上， 激活 RAS 信号通路，
使得温度敏感型宿主酵母菌株可以在 37℃ 生长。该
系统可用于研究膜蛋白以及在胞浆中行使功能的蛋
白质， 如研究拟南芥 PEPINO/PASTICCINO2 蛋白的
膜定位［34］， 水疱性口炎病毒核衣壳蛋白在 HeLa 细
胞胞浆中的互作蛋白［35］等。
分裂泛素系统［32］将整合在膜上的 Bait 与泛素
的 C 半段以及一个转录因子构建成融合蛋白，Prey
融合于泛素的 N 半段，Bait 和 Prey 二者的互作将重
建出完整泛素分子， 使其被胞浆的泛素降解酶识别
并切割， 释放出和泛素 C 半段融合的转录因子， 进
而激活报告基因表达。该系统具有高度的适用性，
在研究多种生物的膜蛋白互作中发挥重要作用［36］，
如 Harty 等［37］用该系统分析了内质网膜上蛋白易位
通道蛋白 Sec61 和 Ssh1 蛋白的相互作用。
由 Wehr 等开发的分裂烟草蚀纹病毒（Tobacco
etch virus，TEV） 蛋白酶系统［33］利用蛋白互作重
建 TEV 蛋白酶活性， 裂解作为报告蛋白的荧光或
发光蛋白原， 使其发光进而被检测到。该系统适用
于检测哺乳动物细胞胞浆和细胞膜上的蛋白相互作
用［38，39］。Gray 等［40］用该系统研究了人肾上皮细
胞中凋亡相关的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 caspase-
3 、-6 和 -7 的功能， 结果显示三者都被短暂地激活，
但是只有 caspase-3 或 -7 能够诱导凋亡的发生。
2.6 定量分析技术
Y2H 技术的优点之一就是可以对相互作用强
度进行定量 / 半定量检测， 主要原理是检测报告基
因的激活程度。目前主要的定量方法有 β 半乳糖苷
酶（lacZ 基因编码产物） 活性分析［41］， 酵母菌生
长曲线分析（ 利用 HIS3 基因产物影响酵母在 SD-
His 培养基中的生长状态）［42，43］， 荧光报告蛋白荧
光强度检测［15］等。这些方法均检测的是报告基因
转录后被翻译而成的蛋白质产物的数量， 由于一些
mRNA/ 蛋白稳定性以及翻译活性是可变的， 检测蛋
白质水平不一定能真实反映出基于报告基因转录活
性的 mRNA 水平。因此 Maier 等［44］利用实时定量
PCR（QT-PCR） 法对 Y2H 系统中报告基因转录成的
mRNA 表达水平进行定量检测， 经验证比传统 Y2H
78 生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第1期
的灵敏度更高， 部分解决自激活（ 单独的 Bait 融合
蛋白激活报告基因转录） 和假阴性问题， 可用于检
测普通 Y2H 系统不适用的蛋白相互作用。
2.7 有关试验操作方法的改进和探讨
在试验操作方法上做一些改进可以提高 Y2H
的筛选效率。提高酵母转化率会提升杂交信号的强
度， 更加有利于筛选。Lin 等［45］改进了酵母的醋酸
锂电转化法， 使用标准浓度 5 倍的转化试剂， 即 0.5
mol/L 的 LiAc 、50 mmol/L Tris-HCl 和 5 mmol/L EDTA
（pH 7.5）， 对 Y2H 常用的 3 种酵母菌株进行电转化
试验，结果使转化率显著提升到 1.84×106 转化子 /μg
DNA 。
不同实验室由于使用不同的双杂交系统， 或不
同载体、菌株和报告基因， 造成各自结果之间差异
很大［46］。Liu 等［47］的研究表明， 培养基的不同配
制方法和酵母氮源的来源不同也会影响信号的强度，
以及结果是否呈现为阳性或阴性， 因而认为更换培
养基配方可能会减少各独立试验之间的信号差异，
研究报告中培养基配制方法必须详细描述以利于不
同试验结果的准确对比和进行重复研究。
在大规模的 Y2H 矩阵筛选操作方面， 为使结果
更加严谨，Worseck 等［48］提出以下要求 ：（1） 载体
上使用很弱的启动子， 使 Bait 和 Prey 融合蛋白极低
水平表达， 即用 Western Blot 检测酵母总蛋白裂解
液也不能够检出 ；（2） 使用最严谨的报告基因（ 如
HIS3）， 即使是长期培养后， 报告基因也不能在没有
Prey-Bait 相互作用时激活 ；（3） 为检测较弱的相互
作用， 试验操作中必须使用新鲜的酵母菌， 并进行
重复试验。
3 酵母双杂交的应用
Y2H 及其衍生系统的应用范围广泛， 由最初
的研究蛋白质之间相互作用扩展到研究蛋白质和
DNA 、RNA 以及其他小分子等配体间的相互作用。
在细胞信号转导、免疫学、病理学以及蛋白质组学
等领域发挥重要作用。
3.1 筛选已知蛋白质在cDNA 文库中的相互作用对象
应用 Y2H 系统筛选 cDNA 文库中和已知蛋白
有相互作用的蛋白质已经成为研究已知蛋白新功能
主要途径。主要操作流程为 ： 以已知蛋白作为 Bait，
在指定的 cDNA 文库中筛选出有报告基因激活的阳
性酵母克隆， 从中分离纯化出 Prey 载体， 测定其
DNA 序列， 在 GeneBank 中获取该序列信息， 即可
获知 Prey 蛋白的相关信息。Yoon 等［49］ 用 Y2H 系
统筛选出拟南芥中赤霉素受体 GID1 直接作用的信
号转导蛋白 DELLA， 以及一种抑制这种相互作用
的 化 合 物 ：TSPC（3-（2-thienylsulfonyl）pyrazine-2-
carbonitrile）该研究对于研究植物中赤霉素信号通路，
具有重要意义。Kim 等［50］为研究黑腹果蝇中刺激转
录延伸的关键因子 Cyclin T/CDK9 异源二聚体的组装
方式， 利用大规模 Y2H 筛选法鉴定出该复合物的温
度敏感型变异体， 表明两者结合的关键在两者作用
界面的 α2 和 α3 螺旋上， 该突变体通过影响 Cyclin T
的构象直接或间接干扰 Cyclin T 和 CDK9 的结合。
3.2 绘制蛋白质相互作用网络图谱
机体内蛋白质之间的复杂的相互作用网络是相
互作用物组（Interactome） 的一个重要组成部分， 对
该网络作图也是蛋白质组学的重要研究内容。目前
开发出的一些高通量 Y2H 方法， 可以对多达数千的
候选蛋白进行筛选， 是绘制蛋白质相互作用网络图
谱的重要手段。在这一技术的辅助下， 一些模式生
物的蛋白互作组草图相继被绘制， 如 ： 酵母［51，52］、
黑腹果蝇［53］、人类［54，55］及秀丽新杆线虫［56］等。
现今对蛋白互作组图谱的描绘越来越精细， 如对胞
内核心信号通路——MAPK 信号通路所涉及的蛋白
互作网络进行分析， 对于更好地揭示细胞信号转导
机制具有重要意义。Bandyopadhyay 等［57］用 Y2H 筛
选出人 MAPK 相关蛋白和其他胞内蛋白之间的 2 269
对相互作用， 对其进行作图， 经分析发现其中 641
对互作在酵母中也存在， 这种保守性证明这些作用
对在信号网络中起核心作用。Singh 等［58］也对水稻
的 MAPK 互作组进行了系统性的图谱绘制， 找出了
MAPK 的 74 个非冗余作用对象， 对这些蛋白进行基
因本体分类分析发现其归属于 34 种功能类别， 提示
MAPK 参与多种重要生理功能。
3.3 研究疾病作用原理
利用 Y2H 系统研究一些疾病相关蛋白的作用
靶标可以为更好地揭示疾病的发病机制提供思路。
Chen 等［59］发现被 SARS 病毒侵染的宿主细胞中，
79 2014年第1期 黄欣媛等 ： 酵母双杂交及其衍生系统
病毒的解螺旋酶可以和 Ddx5（Asp-Glu-Ala-Asp box
polypeptide 5） 蛋白结合， 抑制 Ddx5 的表达可以抑
制 SARS 病毒的复制， 提示 Ddx5 在 SARS 病毒 - 宿
主相互作用中起重要作用。Silva 等［60］利用 Y2H 系
统筛选出登革热病毒糖蛋白 NS1 在人肝脏中的一个
新作用蛋白 C1q， 后续试验表明，NS1 和 C1q 的作
用在补体系统和登革热病毒感染病理进程中起重要
作用。
在癌症机理研究方面，Lopez-Mateo 等［61］利用
Y2H 筛选出抑癌蛋白 p53 的一个作用蛋白 ： 转录因
子 CREBZF 。CREBZF 的表达可增强 p53 的转录活性，
保护 HCT116 细胞免受紫外线诱导的细胞死亡， 还
使得细胞对 5-氟尿嘧啶这种能活化 p53 的抗癌化学
治疗药物敏感， 提示 CREBZF 对 p53 的抑癌活性起
正调作用， 是一个重要的癌症调节因子。
3.4 筛选药物作用靶点以及新药开发
Y2H 及其衍生系统在药物研究方面有着非常广
泛的应用， 如筛选和验证药物的作用靶点、研究药
物对蛋白互作的调控作用、筛选和设计新药等［62］。
在研究抗体性药物的作用位点方面，Vielemeyer 等［63］
报道了以 Y2H 技术为基础的一种高效的方法 ： 以单
链抗体（scFv）作为 Bait，筛选高复杂度的 cDNA 文库，
对得到的 cDNA 片段进行多重比对可获知其上的选
择性相互作用域（SID） 信息， 从而高效地定位抗体
靶标蛋白上的表位区域。他们筛选到 AA2 和 ROF7
这两种 scFv 的专一性作用靶标 ： 小 GTP 酶 Rab6 和
Rab1 。这种结合具有构象特异性， 只有当靶标蛋
白包含整个 SID 核心区域才能够被筛选到。由此可
见， 该方法具有很高的特异性。也可将已知蛋白作
为 Bait， 筛选与之结合的 scFv 。如 Ding 等［64］成功
筛选出 3 种与人 IL-8 特异性结合的 scFv 。
在抗病毒药物开发方面，Urano 等［65］利用 SOS
募集系统从 20 000 个候选的小分子中筛选出抑制人
（benzothiazol-2-ylmethy-lthio）-4-methylpyrimidine）
免疫缺陷病毒（HIV）Gag 蛋白装配的化合物 BMMP
（2- ，
若以 BMMP 为基础， 可设计开发出新的抗 HIV 病毒
药物。
4 结语
Y2H 是试验技术发展和酵母遗传学相结合的产
物， 其原理在于通过一对蛋白的相互作用将转录因
子活性进行重建， 这种自我重组装 / 功能重建的概
念催生了一大批相关的衍生技术， 揭示了细胞中大
量复杂的生物大分子互作网络， 为进一步解码这些
作用网络的功能提供基础［66］。这些相关的改进包
括 ： 设计新的筛选方案、改进载体和菌株、使用酵
母以外的生物作为宿主、反向筛选法、分析蛋白质
和 DNA 、RNA 或其他配体相互作用、检测胞浆或细
胞膜上蛋白互作、开发其他的可以被分裂拆开的报
告蛋白（ 如泛素、荧光蛋白、荧光素酶和腺苷酸环
化酶等） 等。Y2H 及其衍生系统共同组成一套内容
丰富的“ 双杂交” 技术体系， 是研究生物大分子相
互作用的重要手段。Y2H 系统创始人 Fields 展望了
这一技术体系的前景［66］： 随着试验技术的进步和研
究者的不断努力， 以及生物分子优良的工具属性被
深入揭示， 双杂交这一技术体系会不断向前发展，
内涵会更加丰富， 应用平台会更加广阔。
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（责任编辑 狄艳红）