全 文 ：2 0 09 年9 月
第 4 6卷 第 5期
四川大学学报 (自然科学版 )
J ou r nal of S ie ha u nU n is e r v it y (N at a u rl Se ie e e n Ed it io n)
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2 0 09
.
05
.
9 4
拟南芥 AT P6一 与 PS AL蛋白质
之间的相互作用研究
宋荣秀 , 王健美 , 杨 毅 , 李旭锋
(四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室 , 成都 6 1 0 0 6 4)
摘 要 : 本文利 用酵母双杂交系统研究 了拟南芥中全长 at p 6 与不 同长度 p as L 之间的相互作
用 ,通过观察含有共转化质粒的 酵母 , 在组氨酸 ( H I S )和腺漂吟 ( A de ) 营养缺 陷条件下 的 生长
情况 , 以及对 肠半乳糖普酶 ( L ac Z 基因编码 ) 的 定性和定量分析 ,表 明 A T 6P 与 P S A L 之间具
有较强的相互作用 ,并且这种相互作用在全长 a t p 6 和 p sa L 的 中间 区段 , P S A L 的信号肤和 C
端的存在 阻碍 了这种相互作用 .
关键词 : 酵母双杂交系统 ; A T P 6 ; P S A L ; 定性分析 ; 定量分析
中图分类号 : Q 78 文献标识码 : A 文章编号 : 0 4 9于 6 7 5 6 ( 2 0 0 9 ) 05 一 1 4 73 一肠
R e s e a r C h o n t h e i n t e r a C t i o n b e t w e e n A T P 6 a n d
P S A L o f A r a b i d o P s i s t h a l i a n a
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A b s t r a e t : T h e i n t e r a e t i o n b e t w e e n t h e f u l l l e n g t h o f a t p 6 a n d t h e d i f f e r e n t l e n g t h s o f p s a L o f A r a b i d o P
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51 5 t h a l i a n a h a s b e e n s t u d i e d b y t h e y e a s t t w o
一
h y b r id s y s t e m
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s t r o n g i n t e r a e t i o n b e t w e e n t h e m b y o b s e r v in g t h e g r o w t h o f t h e e o
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d i u m w i t h o u t h i s t id i n e ( H i s ) a n d a d e n i n e ( A d e )
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z in g t h e q u a l i t a t i v e a n d q u a n t i t a t i v e a s s a y o f 户
g a l a e t o s id a s e ( e o d e d b y L a e Z g e n e )
.
T h e i n t e r a e t i o n w i t h t h e f u l l l e n g t h o f a t p 6 w a s t h e m id d le s e e t i o n
o f P s a L
.
T h e r e s u l t s a l s o i l l u s t r a t e d t h a t t h e i n t e r a e t i o n h a d b e e n b l o e k e d b y t h e e x i s t e n e e o f t h e s i g n a l
p e p t id e a n d t h e e a r b o x y
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t e r m i n a l i n t h e P S A L p r o t e i n
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K e y w o r d s : y e a s t t w o
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P S A L
,
t h e q u a l i t a t i v e a s s a y
,
q u a n t i t a t i v e a s s a y
1 引 言
植物细胞质雄性不育 ( C y t o p l a s m i e M a l e S t e -
ilr it y
,简称 CM s) 现象十分普遍 , 到 目前 为止 , 在
1 50 种植物中发现了 CM S[ 1〕 . 植物 C M S 是一种母
性遗传现象 ,表现 为不能产生有功能的花粉 ,这种
花粉的不育性在恢复 ( R e s t o r e f e r t i l i t y , 简称 R f )
基因的作用下恢复可育 , 因此植物 C M S / R f 系统
不仅在农业生产上有重要经济价值 , 同时成为核基
因组和细胞质基因组互作研究 的典型材料 21[ . 很
多实验结果表明线粒体基 因组重组产生嵌合基因 ,
其表达产物对小抱子 的发生 和发育产生毒性或抑
收稿日期 : 20 0 9一 0 2一 18
基金项目 : 国家 自然科学基金 ( 3 0 8 7 1 32 2 )
作者简介 : 宋荣 秀 , ( 1 9 8 3一 ) , 女 , 硕士研究生 , 主要从事植物遗传和分子生物学研究 . E一m ial : so ng r on g xZ O06 @ 16 3 . co m
通讯作者 : 王健美 . E一 m a i l : w a n gj i a n m e i@ s e u . e d u . c n
7 4 14四 川大学学报 (自然科学版 )第 4 6卷
制作用 ,从而 引起雄性不育〔2一 5〕 . 至今 已 经克隆和
定位分析了多种植物的 C M S 相关嵌合基因 , 分析
这些嵌合基因的特点后 ,发现这些嵌合基 因部分来
源于 A T P 酶 、 细胞色素氧化酶 ( CO X )等线粒体能
量代谢相关的复合体的亚单位图 , 如水稻 珍 CM S
的 o r f 7 9 部分序列来源于 。 o x l [`〕 ; 向 日葵 P E T I -
C M S 的 o r f H 5 2 2 基 因 5 ’ 端 5 7 b p 来源于 a t p s [ ,〕 ;
矮牵牛 S一 CM S 的 cP f 基 因起始 35 个密码 子 与
a t p g 相同 , 中间 1 5 6 个密码子来源于 c o x l [ 8〕 , 油
菜 P o l CM S 的 o r f 2 2 4 和 N a p C M S o r f 2 2 2 的 N 端
58 个密码子来 源于 at SP 〔 ’ 习. 这些嵌合基因与邻近
的 A T P 酶 、 细胞色素氧化 酶基 因共转录 , 例如向
日葵 o r f H 5 2艺与 a t p A 共转 录 , 水 稻 珍 CM S 的
o r f 7 9
、 油菜 o r f2 2 4 、 o r f 2 2 2 与 a t p 6 共转录等等 , 即
线粒体 A T P 合成 酶的一个亚基 A T P 6 与细胞质
雄性不育 ( C M )S 相关 . 并且 C M S 相关基因的转录
产物的大小和丰度受核恢 复基 因的调控2[, ’ , “ 一 `01 .
植物细胞质雄性不育与线粒体能量代谢相关的基
因及其表达产物密切相关 已是不争的事实 ,但是到
目前 为止 , 植物 细胞 质雄 性 不育 及育 性恢复 与
A T P 酶等有什么样 的内在关系 ? 相关基 因及其表
达产物在核基因组与线粒体基因组之间 ,线粒体基
因组与叶绿体基 因组之间到底有什么样的信号 网
络和相互作用机制 ? 这些 问题都还不清楚 . 因此 ,
我们 以油菜 A T P 6 蛋 白为诱饵蛋 白 , 通过酵母双
杂交系统筛选油菜中与其具有相互作用的蛋白质 ,
发现在酵母 中油菜 A T P 6 与 光系 统 工亚单位 L
( P S A L )之间有很强的相互作用 (尚未发表 ) . 为了
进一步证明两者之间的相互作用 ,我们从模式植物
拟南芥 中分别克隆了 at p 6 与 p sa L 两个基因 ,并构
建含有不同长度片段的载体 ,通过观察含有共转化
质粒的酵母在组氨酸 ( H i s ) 和腺嚷吟 ( A d e )营养缺
陷条件下的生长情况和对 户半乳糖昔酶 ( L ac z 基
因编码 ) 的定性 和定量分析表明 A T P 6 与 P S A L
之间具有较强的相互作用 , 而且这种相互作用在全
长 at p 6 和 p sa L 的中间区段 , P SA L 的信号肤和 C
端的存在阻碍了这种相互作用 . 为 p sa L 功能的进
一步揭示提供了依据 .
2 材料与方法
2
.
1 材 料
2
.
1
.
1 植 物材料 和 菌株 植 物材 料 为拟 南芥
R L D 生态型 ,酵母菌为 A H 1 09 .
2
.
1
.
2 克隆载体和试剂 本研究采用基于 G aI 4
的酵母双杂交系统 ,该 系统 以 H i s 、 A d e 为营养缺
陷筛选条件 , Lac z 作 为报告基因 , p G A D T 7一 R ec T
和 p G B K T 7一 5 3 为 阳性 对 照 , p G A D T 7一 R e e T 和
p G B K T 7
一
aL m 为 阴性 对 照 . 双 杂 交 试 剂 盒 购 自
C l o n t e e h 公司 . p M D 1 8一 T 载体 , T 4 D N A 连接酶 、
研究所需限制性 内切酶均购 自 T A K A R A 公司 ;引
物合成和测序由北京三博远志公司完成 ,其他常规
分子生物学试剂购 自成都博瑞克生物技术公司 .
2
.
1
.
3 引 物 克隆 at p 6 基因和 sP a L 基因及系
列片段所用的引物见表 1 .
表 1 克隆 at p 6 基因和 sP a L 基 因及其 系列片段所用的引物
T
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1 P r im e r s u s e d f o r e lo n i n g a t p 6 g e n e a n d p s a L g e n e a dn
s e r记 5 o f it s f r a g m e n t s
基因 上游引物 (5 ’— 3 ’ ) 下游引物 ( 5 ’— 3 ’ ) 产物大小 ( b p )
曰以月了ō,习11日二任。é去洲扫r左儿卜,rdùUta,口h0L以5(象rsa t P 6
P s a L I
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2
.
2 方
2
.
2
.
1
法
构建重组质粒 酵母双杂交试验方法参照
C fo nt ec h 公司的说明书 , 并稍作修改 . 试验 中所有
载体的构建及分子克隆操作参 见文献山〕 , a t p 6 及
全长 p sa L 基 因扩增后 , 分别克隆到 p M D 18 一 T 中
间载体中 ,经 B a m H I 及 尸 st l 双酶切位点将 a t p 6
定向克隆至 p G B K T 7 , 得到的重组质粒 p G B K T 7 -
at 6P
. 经 H in d l 单酶切补平末端后再经 cE o R I 酶
切将 p sa L 定向克隆至由 E co R I 和 S m a l 双酶切
的 p G A D T 7 ,得 到重组质粒 p G A D T 7一 p sa L . p sa L
第5 期 宋荣秀等: 拟南芥 AP T 6与P S AL 蛋 白质之间 的相 互作用 研究15 4 7
缺失片段( 如图1) 利用经P R C 引人 Ec oRI 韵上
游引物和相应下游引物用f Pu 酶扩增后 ,用类似
p G A D T 7
一
sP aL 的方法构建重组质粒 , 得到一 系列
含 p sa L 缺失片段的重组质粒 . 所有重组质粒由北
京三博远志生物技术有限公 司测序验证 .
P s a L
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P s a L
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11
P s孔 一111
P s a L
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p s a L
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卜 2 1 9 a a
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2 19 a a
5 1
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13 4 a a
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一
19 0 a a
19 1
一
2 19 a a
重悬菌体 (浓度因子为 5 ) ;取 0 . 1 m L 重悬菌到 1 . 5
m L 离心管中 ,液氮速冻 45 5 , 37 ℃水浴 1 m in , 重
复两次 (取 0 . 1 m L -Z buf fe r 作空 白对照 ) ; 向离心
管中加 0 . 7 m L Z 一b uf fer 和 户琉基乙醇的混合液 ,
加人 0 . 16 m L O N P G 30 ℃温浴并开始记时 ; 当液
体变为黄色时 , 加 0 . 4 m L 碳酸钠 (1 m ol / L )于实
验管和对照管 以终 止反应 , 同时记 录时间 , 14 。。 0
r / m i n 离心 1 0 m i n , 取上清测量 4 2 0 n m 的 O D 值
( A
4 2。 一 o · 02 一 1 . 0) . 利用公式 :户半乳糖昔酶活性
单位 = 1 0 0 0 火 A 4 2 。 / ( t X V X A 6。。 ) ,其 中 t = 显色时
间 (单位 : m in) , V 一 0 . 1 m L X 5( 浓度因子 ) .
图 1 p s a L 的全 长及各 片段
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.
1 F
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一
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s e e t io n o f p
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2
.
2
.
2 IL A 。 介导 的 酵母 转化 制备 酿酒 酵母
A H l o g 的感受态细胞 , 用 IL A 。 介导的小量转化法
将重组的 p G A D T 7 和 p G B K T 7 质粒共转化到感
受态细胞中 ,同时共转化正 、 负对照质粒 .
.2 .2 3 户半乳糖普酶定性测 定 户半乳糖昔酶定
性定量测定参考 lC o nt ec h 说 明书及文献仁’ 3〕 . 定性
测定时 ,将阳性酵母在 S D / L e u 一 T r p 一 培养基上划
线 , 3 0℃ 培养 24 h . 然后将菌 落用牙签挑 印在滤纸
上 , 液氮冷冻 30 5 , 37 ℃ 保温 2 m i山重复一次 . 取
出滤纸室温凉干 , 将该 滤纸 放于预先经底物溶液
( Z
一
b u f f e r
,含 0 . 1% X 一 g a l ) 润湿的普通滤纸上 , 使
印有菌体 的滤纸充分湿润 , 30 ℃避光温育 , 3 h 内
观测滤纸上 的菌斑的颜色变化 .
2
.
2
.
4 片半乳糖普酶定量测 定 以 O N P G (邻硝
基苯尹D 一半乳毗喃糖昔 )为底物定量测定液体 户
半乳糖昔酶活性 .
用接种环从划有正负对 照 , N o . 1~ N o . 5 的培
养基上分别挑取等量 的正对照菌落 ( 直径 2 m m )
于 s m L 新鲜的 S D / L e u 一 T rP 一 H is 一 液体培养基 ;
负对照 , N o . 1 ~ N o . 5 菌 落于 5 m L 新 鲜 的 S D /
L e u 一 T r p一 液体培养基 , 30 ℃ , 2 40 r / m in 培养过
夜 . 取 2 m L 过夜培养物到 8 m L 液体 Y P D A 培养
基中 ,做好标 记 . 30 ℃ , 2 40 r / m in 培养 3 h 后 以
Y P D A 液体培养基为空 白对 照测菌液 O D 值 , 当
O D
60 。
= 0
.
5一 0 . 8 时 , 取 1 . 5 m L 培养物 1 3 0 0 0 r /
m i n 离心 3 0 5 ; 去 掉上清 , 用 Z 一b u f f e r 重悬 菌体 ,
13 0 00 r /m i n 离心 3 0 5 ;去上清 ,用 0 . 3 m L Z一 b u f f -
e r
3 结果与分析
实验结果 表 明所有 组合 ( 表 1) 的转 化子 在
SD / L eu
一 T rP 一 培养基 上正常 生长 ( 图 Z A , 生长
3 d )
, 在 S D / L e u 一 T r p一 H i s 一 及 S D / L e u 一 T r p -
A de
一 培养基上 ,只有 N o . 3 和 N 0 . 4 两对组合能够
生长 (图 Z B , 生长 4 d) . 介半乳糖昔酶定性测定表
明在被 X 一 g a l 浸湿的滤纸上 N o . 2 、 N o . 3 和 N o . 4
蓝色程度接近正对照 ,而 N o . 1 、 N o . 5 的颜色接近
负对照 (图 Z C ) . N o . 3 和 N o . 4 组合能较强的启动
iH
s 、 A d e 以及 L a c Z 等报告基因的表达 , 而且表达
活性最高 , 即全长 at p 6 与 sP aI J 中间区段之间在酵
母中存在直接的相互作用 (表 2 , 图 1 , 图 2 ) , P S A L
的信号肤以及 C 端结构可能阻碍了蛋 白质之间的
相互作用 . 以 o N P G 为底物定量测定 产半乳糖昔
酶活性结果进一步证实了上述结论 (图 3) .
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口麟腿鳅瞿地寸.ON点枷哪酬樱赓阶
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图 3 共 转化子 户半乳糖 替酶活性 定量刚定
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3 Q
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o
f t h
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1 4 7 6 四 川 大学学报 ( 自然科学版 ) 第 4 6 卷
表 2 酵母双杂交系统共转化 子的生长情况及 介半乳糖普 酶定性测定
T
a b
.
2 G
r o w t h
o
f t h e e o
一 t r a n s f o r m a n t s i n y e a s t t w o
一
h y b r i d s y s t e m
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d 介g a la e t o s id a s e q u a li t a t i v e a s s a y
共转化子 S D / L e u 一 T r p一 H i s - S D / L e u 一 T r p一 A d e - X 一 g a l
正对照 p G A L〕T 7一 R e e T + p G B K T 7一 5 3
负对照 p G A D T 7一 R e e T + p G B K T 7一 l a m
N o
.
1 p G A D T 7
一 p s a L
一
I + p G B K T 7
一 a t p 6
N o
.
2 p G A D T 7
一 p s a L 一 1 + p G B K T 7
一 a t p 6
N o
.
3 p G A D T 7
一 p s a L
一
m + p G BK T 7
一 a t p 6
N o
.
4 v G A D T 7
一 p s a L
一
lV + p G B K T 7
一 a t p 6
N o
.
5 p G A D T 7
一 p s a L
一
V + p G B K T 7
一 a t p 6
+ + + + + +
十
+ + + + +
+
十
+ + + +
+ + 十 +
+
+ 十 + +
+ 十 + +
+ + 十 +
+
+
+ + +
+ + +
+ + +
+
: 能生长或有活性 ; 一 : 不生长或无活性
图 2 共 转化子在 S D 培养基上的生长情况及 产半乳糖等酶定性测 定
F ig
.
2 G r o w t h o f t h e e o
一 t r a n s f o r m a n t s in t h e SD m
e d iu m a n d 片g a la e t o s id a s e q u a l it a t i v e a s s a y
A
: 生长在 S D / L eu 一 T rp 一培养基上的转化子 ; B :生长在 S D / L eu 一 T印一 H is 一 培养基上的转化子 ;
C
: 户半乳糖昔酶定性检测结果
4 讨 论
细胞内的信号 网络十分复杂 ,到 目前为止对细
胞器之 间 的信号 网 络更 是知 之甚 少 . 玉 米 N C S
( n o n
一 c h r o m o s o m a l s t r i p e ) 突变体为研究线粒体和
叶绿体之间的相互作用提供了一个模型 . 在一个缺
失线粒体细胞色素氧化酶亚单位 2 ( C O X 2) 的玉米
N C 6S 突变体 中 , 叶绿 体光 系统 I 多个 亚单位 的
m R N A 和蛋白质含量都减少 了 l[’ 〕 . A T P 6 是线粒
体 F 。 F l 一 A T P a s e 复合体的亚单位 6 ,多数由线粒体
基因编码 ,其成熟蛋白在真菌 、 植物 、 动物中的保守
性很强 , 但是其 p r e S A T p 6 ( p r e s e q u e n e e o f A T p 6 )
有很 大 差 异 . 拟 南 芥线粒 体 中存 在 两 个 p r e -
S A T P 6
, 两者的加工后的成熟 A T P 6 是相同的 ,但
是加工位点之前的氨基酸序列完全不同 比〕 . 最近
的研究表明甘蔗的 p er S A T P 6 是一个独立的线粒
体膜蛋白 le[ 口. 是否拟南芥 p r e S A T P 6 除 了加工成
成熟的 A T P 6 参与装配成 F 。 F : 一 A T P as e 以外 ,还
以单体形式存在 ? 缺失线粒体 A T P 6 亚单位 ,是
否会导致类似玉米 N C 6S 一样对光系统 I 的严重
影响 ? 拟南芥 A T P 6 和 P S A L 在植物细胞 内是否
具有相互作用 ? 这些问题的解决需要进一步的研
究 .
参考文献 :
〔3〕
徐夙霞 , 刘公社 . 向 日葵细胞质雄性不育性的机制
与利用 [ J〕. 作物学报 , 2 0 0 6 , 3 2 ( 1 0 ) : 1 5 7 4 .
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b y e y t o t o x i e p e p t id e a n d 15 r e s t o r e d b y t w o r e l a t e d
P P R m o t i f g e n e s v i a d is t in e t m o d e s o f m R N A s il e n
-
e in g〔J〕. T h e P l a n t C e l l . 2 0 0 6 , 1 5 : 6 7 6 .
1月门.JJ .工心自厂Lr.J
第 5期 宋荣秀等 :拟南芥 AP 6 T与 P S AL蛋 白质之间的相互作用研究1 4 7 7
[4〕 Co n ley C A, H a n s o n M R . H o w d o a l t e r a t io n s in
p l
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m e n t ? 〔J〕. J B io e n e r g B i o m e m b r , 1 9 9 5 , 27 : 4 4 7 .
〔5 ] H a n d a H , G u a l b e r t o J M , G r ie n e n b e r g e r J M . C h a r -
a e t e r i z a t io n o f t h e m it o e h o n d r ia l o r f B g e n e a n d i t s d e
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) [ J〕. C u r r G e n e t , 1 9 9 5 , 28 ( 6 ) : 5 4 6 .
[ 6〕 N o t s u Y , M a s o o d S , N i s h i k a w a , , t a l . T h e 。 o m -
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[ J〕 . M o I G e n e t G e n o m i e s , 2 0 0 2 , 2 6 8 : 4 3 4 .
[ 7〕 S a b a r M , G a g l ia r d i D , B a l k J , e t a l . O R F B 15 a s u b -
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2 0 0 3
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4 : 1
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[ 8〕 Y o u n g E G , H a n s o n M R . A f u s e d m it o e h o n d r i a l
g e n e a s s o e ia t e d w i t h e y t o p la s m ie s t e r i li t y 15 d e v e lo p
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1 9 5 7
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[ 9〕 S i n g h M , B r o w n G G , S u p p r e s s io n o f 。 y t o p l a s m ie
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〔责任编辉 : 白林含〕