全 文 ：·综述与专论· 2013年第5期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
RNA 干 扰（RNA interference，RNAi） 现 象 是
指内源性或外源性双链 RNA（double strands RNA，
dsRNA）与细胞内的同源序列 mRNA 相结合并使之
降解的现象，是一种序列特异转录后的基因沉默机
制，其作用相当于基因敲除。同传统的基因敲除技
术相比，RNAi 技术具有高效、特异、操作简单及
设备依赖性低的优点，已经成为生物学实验室中一
种强大的实验工具。目前，实验中常用的 RNAi 手
段主要包括直接转染小或短干扰 RNA（small/short
interfering RNA，siRNA）以及转染携带小或短发卡
RNA（small/short hairpin RNA，shRNA）的质粒。其
中，siRNA 是一类 20 多个核苷酸长度的双链 RNA
收稿日期 ：2012-11-27
基金项目 ：河北青年科学基金项目（C2012401039）
作者简介 ：杨文思，女，研究方向 ：生物化学与分子生物学 ；E-mail ：qingren32497@sohu.com
通讯作者 ：王洋，男，博士，讲师，研究方向 ：疾病相关新基因 ；E-mail ：ricaniidae@yahoo.com.cn
RNA 干扰介导的抗 HIV 治疗研究进展
杨文思1  王沂2  王洋3
（1. 河北大学生命科学学院，保定 071000 ；2. 河北联合大学附属医院，唐山 063000 ；
3. 河北联合大学生命科学学院，唐山 063000）
摘 要 : 人类免疫缺陷病毒（HIV）是引起获得性免疫缺陷综合征（AIDS）的病原体，即艾滋病，目前尚无有效的治愈方法，
严重危害着人类的健康。RNA 干扰（RNAi）是一种由双链 RNA 所引起的序列特异性基因沉默，被广泛应用于生物医学研究。目前，
已经有多个研究机构将 RNAi 作为对抗 HIV 感染的可行手段并通过试验进行了验证，其采取的方法主要包括靶向 siRNA 治疗和载
体介导的 shRNA 治疗。就 HIV RNAi 治疗的研究现状作一综述。
关键词 : HIV RNAi siRNA shRNA 靶向治疗 适体 慢病毒载体
Research Progress of Anti-HIV Therapy Mediated by RNAi
Yang Wensi1 Wang Yi2 Wang Yang3
（1. College of Life Sciences，Hebei University，Baoding 071000 ；2. Hebei United University Affiliated Hospital，Tangshan 063000 ；3.
College of Life Sciences，Hebei United University，Tangshan 063000）
Abstract:  Human immunodeficiency virus（HIV）is the pathogen of Acquired Immune Deficiency Syndrome（AIDS）, which is an
incurable disease and has become a serious public health problem. RNA interference （RNAi） is a post-transcriptional process triggered by the
introduction of double-stranded RNA （dsRNA） which leads to gene silencing in a sequence-specific manner. RNAi technology has been widely
used in biological and medical research. At present, many researchers have taken RNAi technology as a possible anti-HIV method and tested
it in experiments. The main means in RNAi mediated anti-HIV experiments included siRNA targeted therapy and shRNA plasmid mediated
therapy. This article will review the research progress of anti-HIV therapy mediated by RNAi.
Key words:  HIV RNAi siRNA shRNA Targeting therapy Aptamer Lentivector
分子，可以通过化学方法直接在体外合成，也可以
体外转录合成或者由长片段 dsRNA 体外经 RNaseIII
类酶降解后产生，然后通过转染的方法导入细胞，
作用时间相对较短。而 shRNA 是一段具有紧密发卡
环（tight hairpin turn）的 RNA 序列，首先将其编码
DNA 克隆到专门的表达载体中，通过载体导入细胞，
在细胞中，shRNA 被加工成 siRNA，发挥抑制特异
mRNA 表达的作用。这种装载了 shRNA 的载体可以
通过筛选稳定传递到子代细胞中去，从而使基因的
沉默可被遗传，因而作用时间更加长久稳定［1］。自
RNAi 技术问世并成熟以来，因其高效、安全、作用
特异的优点很快就成为生物医学领域所关注的对象。
2013年第5期 29杨文思等 ：RNA 干扰介导的抗 HIV 治疗研究进展
目前，RNAi 疗法已经在包括肿瘤、炎症、遗传病、
抗病毒及代谢性疾病等多个领域展现了良好的应用
前景，其中部分已经进入了临床实验阶段。
人 类 免 疫 缺 陷 病 毒（human immunodeficiency
virus，HIV）属于反转录病毒科，慢病毒属，其基
因组由两条相同的正链 RNA 构成，感染靶细胞后能
够逆转录为 DNA 并整合到宿主细胞基因组中，随
宿主细胞的基因复制并表达，是引起人类获得性免
疫缺陷综合征（acquired immunodeficiency syndrome，
AIDS）的病原体。随着医疗水平的进步，艾滋病已
经成为一种可控的慢性传染病。目前，高效抗逆转
录病毒治疗（HAART）是艾滋病的最根本的治疗方
法。但该方法只能控制病毒感染，降低死亡率和并
发症的发生率，并不能完全治愈 AIDS，患者需要终
生服药，昂贵的治疗费用令普通患者难以承担。因此，
AIDS 的治疗仍是医学界的一大难题。RNAi 技术为
AIDS 的治疗提供了新的手段，世界各地的多个研究
小组致力于通过 RNAi 技术治疗 AIDS，并且已经取
得了初步的成果。本文是就 RNAi 抗 HIV 治疗的研
究进展所作综述。
1 抗 HIV RNAi 治疗靶点的选择
RNAi 治疗最关键的一点就是寻找合适的靶点。
一般来说，抗 HIV RNAi 治疗的靶点可以是 HIV 基
因组本身，也可以是编码 HIV 复制或感染关键蛋白
的、宿主细胞来源的 mRNA。到目前为止，几乎所
有的 HIV 编码和调控基因都已经被用作抗 HIV RNAi
治疗的靶点并在体外实验中加以验证。其中效果比
较好的包括 tat、rev 基因等［2］。来自宿主的 RNAi 靶
点， 目 前 已 经 通 过 实 验 证 明 有 效 的 包 括 NF-κB、
CD4、 趋 化 因 子 受 体 CCR5 和 CXCR4 等， 其 中
NF-κB 是激活 HIV-1 基因表达的主要转录因子，而
CD4、CCR5 和 CXCR4 是 HIV-1 入侵靶细胞的主要
受体，抑制这些分子的表达可以有效的抑制病毒复
制和病毒感染过程［3，4］。
HIV 病毒可以产生针对抗 HIV RNAi 的抵抗能
力。产生这种抵抗现象的原因主要包括 ：（1）RNAi
作用的靶 RNA 发生单一点突变 ；（2）靶点附近发生
突变导致作用靶 RNA 空间结构改变 ；（3）靶 RNA
发生缺失突变［5］。这些突变均可引起 siRNA 与靶
RNA 亲和力降低甚至缺失，产生特异 siRNA 抵抗的
病毒株。因而，采用单一 siRNA 很难达到长期抑制
HIV 复制的效果，为了解决此问题，一方面应该尽
量选择病毒基因组中保守性比较强的序列作为 RNAi
的靶点 ；另一方面，可以选择宿主细胞中对病毒复
制起关键作用基因的转录本作为 RNAi 的靶点，因
为宿主细胞的编码基因极少会发生突变，因此也能
减少逃逸突变发生的几率 ；再者，解决此问题最好
的方法是将多种针对不同靶点的 siRNA 组合应用，
从多个角度抑制病毒的复制、感染等过程［6，7］。此外，
最近还发现，HIV 存在一种交叉抵抗机制，即 HIV
对某一种 siRNA 突变产生逃逸的同时，可以对另一
种针对不同靶点的 siRNA 产生逃逸，此两种 siRNA
的靶点可能相距几千个碱基，但其产生的具体机制
仍然未知［8］。这一发现为 RNAi 抗 HIV 治疗靶点的
选择提出了更高的要求。
鉴于宿主细胞基因产物在抗 HIV RNAi 治疗中
不易产生突变逃逸的优点，目前，抗 HIV 新靶点的
开发主要集中在人类病毒复制相关基因上。近年来，
世界各地的多个研究团队通过全基因组 RNAi 技术
对人类基因组进行筛选，各团队在实验设计和研究
角度上略有不同，导致鉴定出的结果不尽相同。自
2008 年以来，累计鉴定出了上千个与 HIV 复制密切
相关的宿主来源基因，首次发现其中很大一部分基
因与 HIV 的复制相关，这些研究为抗 HIV 的 RNAi
治疗提供了大量可能的靶点，有些靶点已经被用于
实验性抗 HIV 治疗，并取得了比较好的效果［9-17］。
2 抗 HIV RNAi 治疗的手段
目前，RNAi 介导的抗 HIV 治疗主要包括不需
要载体的 siRNA 治疗以及载体介导的 shRNA 治疗。
2.1 SiRNA介导的靶向抗HIV治疗
SiRNA 用于体内抗 HIV 治疗所面临的最大难点
是缺乏有效的 siRNA 体内传递机制，这一瓶颈严重
限制了其在临床上的应用。siRNA 的生物学本质决
定了其极不稳定、很容易被核酸酶降解，同时容易
引发宿主的免疫反应，不易透过细胞膜，因而直接
注射到血液中几乎完全不能发挥作用。因此，探索
一种将 siRNA 通过血液循环高效准确的输送进入靶
细胞的转运机制成为了 RNAi 技术应用于临床函待
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第5期30
解决的关键问题，同时也是最具挑战性的问题。目
前，已经有多种能够保护 siRNA 在血液中不被短期
内降解的方法被报道。例如，将 siRNA 进行化学修
饰、构建包含 siRNA 的纳米颗粒等。但血液中细胞
成分多种多样，注射入血液的 siRNA 即使不被降解，
也很有可能被血管内皮细胞、中性粒细胞和红细胞
等非靶细胞吸收而失去效应。并且在实践中，HIV
的靶细胞——T 细胞、巨噬细胞和树突细胞对于
siRNA 来说都是难以被转染的细胞。针对这一问题，
最近的一些研究均采用了靶向传递方法并取得了较
好的效果。
2.1.1 抗体介导的 siRNA 靶向治疗 一直以来，抗
体都是介导靶向治疗最经典、最有效的媒介物。目前，
已在实验中用于介导 RNAi 治疗的抗体包括抗 CD7、
gp120 和 LFA-1 抗体等。一般来说，与抗原结合后
能够发生内化的抗体是靶向 RNAi 治疗的最佳选择，
在 siRNA 和内化抗体的嵌合体中，抗体既能起到靶
向作用又能介导 siRNA 进入靶细胞。但能够介导内
化的抗体并不容易制备，研究者常常通过一些基因
工程或者化学修饰的方法实现抗体介导的内化，目
前常用的方法包括穿透肽导入法及免疫脂质体法。
穿透肽通常是一段富含碱性氨基酸残基的短肽，与
抗体相连后能够介导抗体内化。Kumar 等［18］将 CD7
单链抗体与 9 个精氨酸残基构成的穿透肽相连成为
内化抗体，将此融合抗体与针对 HIV-1 vif、tat 基因
以及针对宿主细胞 CCR5 基因的 siRNA 相连后注射
入人源化 HIV-1 病毒血症的小鼠体内，结果有效的
抑制了内源性病毒的复制并且重新恢复了 CD4+ T 细
胞数量。HIV-1 gp120 糖蛋白位于病毒外壳表面以及
被感染的细胞表面，因而可以用作区分 HIV-1 感染
的细胞和正常细胞的标志，非常适于作为抗 HIV-1
靶向治疗的靶点。Song 等［19］将 gp120 抗体重链与
天然穿透肽——鱼精蛋白偶联成为内化抗体。将该
内化抗体与针对宿主基因的 siRNA 连接后静脉注射
小鼠，检测各种细胞中 siRNA 目的基因的表达水平，
结果显示，仅 gp120 表达细胞中目的基因的表达被
抑制，而其它细胞未受影响。将 gp120 内化抗体与
针对 HIV-1 gag 基因的 siRNA 偶联后，可以抑制难
以转染的 HIV-1 感染 T 细胞中病毒的复制。
免疫脂质体是将单克隆抗体或基因工程抗体共
价结合在脂质体表面，由抗体携带脂质体到靶细胞
表面，脂质体通过细胞吞噬、融合等方式进入靶细
胞并释放内容物。该种方法的优点在于实现靶向内
化的同时借助脂质体保护了内容物不被降解，后一
优点对于脆弱的 siRNA 尤为关键。淋巴细胞功能抗
原 -1（LFA-1）为整合素家族蛋白，该蛋白特异性
的高表达在所有白细胞表面，包括 T 细胞、巨噬细
胞和树突细胞，这些细胞在 HIV 感染和致病过程中
发挥着重要的作用。这一特点使 LFA-1 抗体成为传
递 siRNA 到血液系统靶细胞的理想载体。Kim 等［20］
将 LFA-1 靶向的免疫脂质体包裹 CCR5 siRNA 成为
纳米颗粒，注射病毒血症的人源化小鼠能够有效地
抑制病毒的扩增以及感染造成的 CD4+ T 细胞减少。
2.1.2 适体（aptamer）介导的 siRNA 靶向治疗 适
体是具有独特的二级和三级结构，能与有机化合物
或蛋白质等配体专一和高效结合的 RNA 或 DNA 片
段。利用适体的这种特性，可以介导 siRNA 的细胞
特异性传递。适体和 siRNA 的共价嵌合体可以通过
体外转录的方式非常方便的大规模生产。Neff 等［21］
将能够与 HIV 包膜蛋白 gp120 特异结合的适体 RNA
和抗 HIV-1 siRNA 结合。对这种适体 RNA 进行 2’
氟化修饰后能够与 HIV-1 gp120 蛋白发生特异性结
合并引起内化。Zhou 等［22］将针对 gp120 的适体蛋
白进行了优化，使其成为一种双功能适体 RNA，一
方面可以作为载体运输 siRNA 到靶细胞 ；另一方面
适体本身与 HIV-1 表面 gp120 结合后阻断 HIV-1 的
感染作用。将 gp120 适体 -siRNA 嵌合体每周一次、
连续几周注射 HIV-1 病毒血症的小鼠，HIV-1 病毒
载量明显下降。
CD4 是 HIV 进入宿主 T 细胞的最重要的受体途
径。CD4 适体可以阻断 HIV-1 与 CD4 分子的作用。
CD4 适 体 -siRNA 嵌 合 体 RNA 被 特 异 性 地 用 来 向
CD4+ 细胞运输 siRNA，可以在体外以及宫颈组织移
植物中抑制目的基因的表达。该适体 -siRNA 嵌合体
被血管内注射用于人源化小鼠模型时，其携带的针
对 HIV gag 和 vif 或宿主 CCR5 的 siRNA 能够有效地
防止病毒传播到宫颈移植物［23］。
截止目前，至少在人源化小鼠中，细胞特异性
siRNA 运输用于治疗 HIV-1 感染取得了很好的效果。
下一步非人灵长动物的实验将进一步验证其安全性
2013年第5期 31杨文思等 ：RNA 干扰介导的抗 HIV 治疗研究进展
和效率。
2.2 shRNA介导的基因治疗
一名伴有 AIDS 的白血病患者在接受了一次造
血干细胞移植后，却意外的治愈了 AIDS，HIV-1 感
染被完全清除，原因在于这名供者的造血干细胞是
细胞因子受体 CCR5 缺失的纯合子，移植进患者的
干细胞由于缺乏 HIV-1 感染所需的共受体 CCR5 而
不能被 HIV-1 感染［24］。这个病例虽然仅是一个个例，
却为 AIDS 的治疗提供了新的思路，即通过重建造血
系统抵抗 HIV-1 的感染。但是 CCR5-/-且配型合适的
供者并不容易获得，从而严重限制了这一治疗方法
的应用。因此，有必要研究一种机制类似的、可操
作性更强的抗 HIV 疗法。采用自体干细胞在体外基
因修饰后重新输回体内重建造血不失为一种很有前
途的治疗 AIDS 的替代方法。shRNA 具有可以整合
到宿主细胞基因组、稳定表达、作用时间持久的优
点，被看作此种治疗最有效的手段，而慢病毒载体
则被视为介导 shRNA 整合入宿主细胞基因组的最佳
媒介。慢病毒载体最大的优点是可以感染非分裂期
的造血干细胞，并且高效的整合到细胞的基因组中，
稳定传递到子细胞中并长期表达，产生持久的治疗
效果。慢病毒载体介导 shRNA 治疗的另一个优点是
可以将多个针对不同靶点的 shRNA 或者抑制 HIV 复
制的其它元件构建在一株慢病毒载体中，通过一次
稳定感染，达到多重抑制的效果，从而有效、方便
的避免了治疗逃逸现象的发生。
Li 等［25］ 将 包 括 tat/rev shRNA、 针 对 CCR5 的
锤头状核酶以及核仁内反式激活反应元件类似物
（nucleolar-localizing TAR decoy ：抑 制 TAR 元 件 与
DNA 的结合）在内的 3 种抗 HIV-1 元件串联排列构
建入慢病毒载体，重组慢病毒体外感染造血干细胞
后自体回输入 4 名感染 HIV-1 的血液病患者体内。
结果显示，整合了 3 种抗 HIV-1 元件的造血干细胞
可以分化成各种系列的血细胞，移植后 24 个月仍
可在外周血各系血细胞中检测到 siRNA 和核酶的表
达。Walker［26］ 构 建 了 一 株 包 含 CCR5 shRNA、 人
类 / 猕猴 TRIM5α 基因和核仁内反式激活反应元件类
似物的慢病毒载体，感染了该重组慢病毒的 CD34+
造血干细胞在人源化免疫缺陷小鼠体内可以分化为
HIV-1 抗性的 CD4+ T 细胞。髓系来源的 HIV-1 靶细
胞，包括巨噬细胞和树突细胞，常常作为 HIV-1 的
细胞储存库，但这两种细胞对重组慢病毒感染具有
极强的抗性，对慢病毒介导的 shRNA 治疗不敏感。
Bobadilla 等［27］将一段猴免疾缺陷病毒（SIV）/HIV-2
来源的 Vpx 蛋白编码序列引入慢病毒载体，该蛋白
能够增强病毒 cDNA 向细胞核的转位和基因组整合，
显著提高了慢病毒载体对巨噬细胞和树突细胞的感
染能力。这些实验的成功充分证实了以 shRNA 为基
础的细胞疗法治疗 AIDS 的可行性和有效性。
MicroRNA （miRNA） 是一类由内源基因编码的
长度约为 22 个核苷酸的非编码单链 RNA 分子，在
分子特征、生物合成和作用机理上与 siRNA 非常
相近，可以看作是内源 siRNA。多种功能相关的
miRNA 编码基因常在基因组上成簇排列，受 RNA
聚合酶Ⅱ型启动子调控而表达。受此启发，一些研
究者将 shRNA、核酶等 HIV-1 抑制元件的编码序列
取代某一 miRNA 基因簇上 miRNA 编码基因，或者
直接模仿 miRNA 基因簇构建包含上述 RNA 元件编
码序列的人工多顺反子，然后通过慢病毒介导整合
靶细胞，使靶细胞可以长时间有效抵抗 HIV-1 感染
而不影响靶细胞的生物学性状［28，29］。由于采用了更
加高效且种类繁多的 RNA 聚合酶Ⅱ型启动子，因而
通过选择合适的启动子可以实现 siRNA 的可控和组
织特异性表达。
除慢病毒载体外，泡沫病毒也被用于实验性抗
HIV shRNA 治疗。Kiem 等［30］将 tat/rev shRNA 与膜
结合 HIV-1 融合抑制肽 C46 编码序列串联构建入泡
沫病毒载体，感染了该重组泡沫病毒的人类 CD34+
细胞在免疫缺陷小鼠体内得到了充分的扩增，为泡
沫病毒介导 HIV-1 shRNA 治疗的可行性提供了依据。
3 其他
除了 siRNA 导入靶细胞手段的研究外，一些研
究团队旨在通过生物信息学方法对抗 HIV siRNA 以
及 shRNA 的设计进行优化，以期提高抑制效率，减
少细胞毒性。Low 等［31］通过高分辨率引物延伸选
择性 2’羟基酰化分析法（selective 2’-hydroxyl acyla-
tion analyzed by primer extension，SHAPE），对已知的
HIV-1 RNA 的分子内结构进行分析发现，RNAi 抑制
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第5期32
效率与靶 RNA 热力学特点的关系。依照该关系设计
的 shRNA 比普通设计的 shRNA 抑制效率更高且几
乎没有细胞毒性。
Tyagi 等［32］总结了所有抗 HIV RNAi 研究的结
果，构建了一个名为 HIVsirDB 的免费数据库，该数
据库收录了目前实验验证可以沉默 HIV 基因的所有
siRNA，详细介绍了每个 siRNA 的序列、靶 RNA 位点、
针对 HIV 病毒株、抑制效率以及序列保守性等信息，
这一数据库的开发为今后 HIV 的 RNAi 治疗提供了
重要的借鉴。
4 小结
RNAi 介导抗 HIV 治疗在体外和体内实验中取
得了一定成果，并显示出了良好的前景，但距离真
正应用于临床可能还需要很长一段时间。一些重要
的技术问题仍然亟待解决，如最佳 RNAi 靶点的确
立，如何将 siRNA 有效、特异的导入 HIV 感染细胞、
如何进一步延长 shRNA 在血细胞中表达时间及病毒
载体导入安全性等。但随着 RNAi 相关技术手段的
不断进步，对 HIV 致病生存机制更深刻理解，RNAi
介导的抗 HIV 治疗将会成为 AIDS 治疗中的一个极
为重要的手段。
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（责任编辑 狄艳红）