全 文 ：由HIV感染引发的艾滋病（AIDS）导致每年数百
万人死亡。高效抗逆转录病毒疗法（HAART）应用于
早期感染的患者，可有效抑制HIV感染，控制病毒血
症，通过持续服药可有效延长感染者寿命［1］。然而患
者一旦停止服药，HIV便再次活化并产生甚至更为严
重的病毒血症［2］。研究发现 HIV的潜伏感染是
HAART根治HIV最大的障碍［3］。潜藏于机体静息期
免疫细胞（如记忆性T细胞，纯真CD4+ T细胞，神经胶
质细胞，星形胶质细胞等）中的HIV因无法被机体免疫
细胞识别并清除，成为HIV难以治愈的根本原因［4］。
“激活再杀灭（shock and kill）”策略提出的理念在于尝
试采用小分子化合物与HAART联合使用从而达到彻
底清除HIV的目的［5］。采用激活剂激活隐藏的HIV，
从而使得机体的免疫细胞可特异性识别活化的细胞并
狼毒大戟提取物通过NF-κB通路激活潜伏HIV
潘晓彦 1，张明娇 2，曾晓云 1，林 健 1，李 琳 1，李珉珉 2，赵 伟 1
1南方医科大学药学院，广东 广州 510515；2暨南大学附属第一医院临床医学检验中心，广东 广州 510630
Euphorbia fischeriana extract reactivates latent HIV through nuclear factor-κB pathway
PAN Xiaoyan1, ZHANG Mingjiao2, ZENG Xiaoyun1, LIN Jian1, LI Lin1, LI MinMin2, ZHAO Wei1
1School of Pharmaceutical Sciences, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China; 2Center for Clinical Laboratory, First Affiliated
Hospital of Jinan University, Guangzhou 510630, China
摘要：目的 研究狼毒大戟提取物对潜伏HIV激活的影响，探讨其激活潜伏HIV可能的机制以及清除HIV的作用。方法 取新鲜
狼毒大戟植物根部组织，液氮速冻并粉碎成末，冷冻干燥3 d后称取少量，采用丙酮一步法提取并浓缩。以甲醇-水为流动相，采
用HPLC反相C18柱分离，并通过MS鉴定后，得到狼毒大戟提取物（EFE）。以潜伏HIV细胞系J-Lat 10.6为激活模型，以TNF-α
（10 ng/mL）作为阳性对照，EFE（50 μg/mL）处理24 h后，采用FACS分析GFP阳性率以观测激活活性。采用不同浓度NF-κB抑
制剂（Bay 11-7082）抑制EFE活性，并用WB检测2 h内p65入核水平，以及24 h内HIV蛋白p24随时间点变化情况。结果 丙
酮一步法可简便快速从狼毒大戟植物中提取得到EFE，经鉴定含 prostratin及其类似物，分离后测得其中 prostratin浓度为
0.53 mmol/L。EFE（50 μg/mL）作用24 h可产生约50%激活潜伏HIV活性，同时HIV蛋白p24水平随时间显著增加。进一步研
究发现NF-κB通路抑制剂（Bay 11-7082）可对EFE活性产生浓度依赖抑制作用，且2 h内胞核p65水平在EFE作用下增加明
显。结论 狼毒大戟提取物EFE含有效成分prostratin及其类似物，可产生较强激活潜伏HIV活性，其机制为通过激活NF-κB
通路促进p65入核从而发挥作用。
关键词：NF-κB；prostratin；潜伏HIV；狼毒大戟
Abstract: Objective To investigate the effect of Euphorbia fischeriana extract on latent HIV reactivation and the pathway involved
in this process and discuss the value of Euphorbia fischeriana extract in eliminating HIV. Methods Fresh tissues of Euphorbia
fischeriana root were crushed into powder after quick freezing with liquid nitrogen and extracted with acetone followed by a
three-day vacuum freeze-drying for dehydration of the extract. The extract (EFE) was separated using RP-C18 column with
high-performance liquid chromatography (HPLC) and identified with mass spectrometry (MS). The activity of reactivated latent
HIV was analyzed by fluorescence-activated cell sorting in a J-Lat 10.6 cell model treated with EFE (50 μg/mL) for 24 h, using
TNF-α (10 ng/mL) as the positive control. The effect of a NF-κB pathway inhibitor (Bay 11-7082) on EFE activity was tested. The
changes in P65 expression in the cell nuclei within 2 h and HIV protein p24 expression within 24 h were analyzed by Western
blotting in cells treated with EFE. Results EFE was obtained by one-step acetone extraction, and the concentration of prostratin
in the extract was around 0.53 mmol/L. About 50% of the cells showed HIV reactivation after treatment with 50 μg/mL EFE for
24 h accompanied by a significantly increased p24 expression. The activity of EFE in reactivating latent HIV was inhibited by
Bay 11-7082 in a concentration-dependent manner, and p65 accumulation was detected in the cell nuclei within 2 h. Conclusion
EFE we obtained contains the active compounds of prostratin and its analogues and shows a strong capacity to reactivate latent
HIV through classical NF-κB pathway.
Key words: nuclear factor-κB; prostratin; latent HIV; Euphorbia fischeriana
基础研究
收稿日期：2015-05-01
基金项目：中国第54批博士后基金面上项目（1091013）；暨南大学附属第
一医院科研培育专项基金
作者简介：潘晓彦，在读博士研究生，电话：020-61648538，E-mail:
xiaoyanpan1201@163.com；张 明 娇 ，在 读 硕 士 研 究 生 ，电 话 ：
020-38688431，E-mail: melody493587243@qq.com；潘晓彦、张明娇共同
为第一作者
通信作者：李珉珉，主任技师，E-mail: limm269@126.com；赵 伟，副教授，
E-mail: wei.zhao.csu@gmail.com
doi 10.3969/j.issn.1673-4254.2015.11.19 J South Med Univ, 2015, 35(11): 1614-1618·· 1614
清除，同时采用HAART治疗，可杀灭释放出来的HIV
颗粒防止其再次感染和复制。
目前，多种“激活再杀灭”联合用药模式正在临床试
验当中［6］。寻找高效激活潜伏HIV小分子化合物成为
当前亟待解决的问题，近年来研究发现植物来源的萜类
化合物prostratin具有较强激活潜伏HIV作用［7］。中药
材狼毒大戟具有治疗淋巴结结核，骨结核，皮肤结核，牛
皮癣，神经性皮炎，慢性支气管炎，阴道滴虫等多种功
效，在我国黑龙江、辽宁、内蒙古、河北等地均可生长，分
布广泛，其提取物中的萜类化合物在抗肿瘤领域和潜伏
HIV激活领域获得广泛关注［8-9］。本文通过改进的丙酮
一步法高效提取了狼毒大戟萜类化合物，通过MS、
HPLC分析鉴定该类化合物为prostratin及其类似物或
衍生物，通过激活潜伏HIV细胞（J-Lat 10.6）实验，证明
了该类化合物具有显著的潜伏HIV激活活性，并揭示其
激活的分子机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物，细胞与试剂 狼毒大戟植物购自辽宁葫芦
岛，潜伏HIV细胞系J-Lat 10.6由复旦大学病原微生物
研究所馈赠。澳洲胎牛血清及RMPI 1640培养基均购
自美国Gibco，核蛋白抽提试剂盒购自美国 Thermo
Fisher Pierce，蛋白酶抑制剂混合物及磷酸酶抑制剂混
合物购于美国Merk calbiochem。ECL发光液，p65兔
mAb，p24，Lamin A/C鼠mAb以及羊抗兔和羊抗鼠二
抗均购自美国 CST，prostratin 标准品购自美国
SIGMA-Aldrich。提取用丙酮为分析纯，高效液相色谱
仪流动相用甲醇为色谱纯。
1.1.2 仪器 药材粉碎机，超声仪，冷冻干燥机（Thermo
SNL216V），高效液相色谱仪（岛津LC-10AT），质谱仪
（WATERS 2695），台式低温离心机（Eppendorf 5810R）
细胞培养箱（Thermo Forma Series II），荧光显微镜
（Nikon Elipse Ti），流式细胞仪（BD FACS Canto II），电
泳仪（Bio-Rad）。
1.2 方法
1.2.1 狼毒大戟前处理及活性成分提取 采购的新鲜狼
毒大戟根部，用刀切成块状，浇液氮迅速冷冻，并立刻置
于药材粉碎机粉碎成末状。将狼毒大戟粉末置于冷冻
干燥机，使之充分去除水分，3 d后取出，称重。将预干
燥狼毒大戟干粉1 g溶于25 mL丙酮，混匀，100 HZ超
声10 min，55 ℃水浴1 h。真空过滤，除去滤渣，获得丙
酮溶解部分。真空旋转蒸发1.5 h左右，使丙酮挥发，浓
缩至底部为黄褐色油状物为止，加入200 μL DMSO溶
解，保存于-20 ℃待检测。
1.2.2 狼毒大戟提取物检测与分离 提取物经0.22 μm
滤膜过滤后，上质谱分析，同时 prostratin 标准品用
DMSO溶解作为对照。质谱鉴定提取物中的目标化合
物后，采用HPLC分析，过C18柱，以甲醇/水为流动相，
按照25%甲醇2 min，35%甲醇6 min，80%甲醇10 min
的程序梯度洗脱，记录保留时间和峰高并收集目标单
峰，同时以prostratin标准品作对照制作标准曲线，计算
提取物中的活性化合物浓度。
1.2.3 潜伏HIV激活活性检测 J-Lat 10.6细胞用添加
10%胎牛血清和1%双抗的RPMI 1640培养基来进行
培养，置于5% CO2培养箱中，每隔3 d传代1次。取对
数生长期 J-Lat 10.6细胞，800 r/min离心5 min收集细
胞，调整浓度为5×105个细胞/mL，0.5 mL培养液/孔均匀
接种于48孔板中，以50 μg/mL EFE刺激细胞，未加药
物组作为阴性对照，以10 ng/mL TNF-α做阳性对照。
24 h后，置于荧光显微镜（放大倍数10×10）下，蓝光激
发，并拍摄图片。随后，转移细胞培养液于流式管中，
800 r/min离心5 min收集细胞，去除上清后，用500 μL
PBS洗1次，将细胞重悬于300 μL PBS中，上流式细胞
仪检测，计算GFP阳性比例。抑制实验分别以50 μg/mL
EFE合用2.5、5、10 μmol/L的BAY 11-7082，同法操作。
1.2.4 激活NF-κB通路验证 J-Lat 10.6调整细胞浓度
为2×106个细胞/mL，2 mL/孔接种于6孔板中，分别加
50 μg/mL EFE刺激 0.5、1、2 h或添加相应浓度BAY
11-7082并以未加药组作为阴性对照。4 ℃，500 g离心
5 min收集细胞于EP管中，在试剂盒细胞裂解液CER
及NER中分别添加蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制
剂混合物，按照试剂盒操作步骤依次去除胞质并抽提核
蛋白。或种板后分别在3、6、12、24 h加50 μg/mL EFE
与添加相应浓度BAY 11-7082后提取总蛋白。蛋白定
量后，加入上样缓冲液，将样品置于100 ℃加热5 min使
蛋白变性。随后每孔上样20 μL（1 μg/μL）蛋白，经10%
聚丙烯酰胺凝胶电泳100 min分离，再将蛋白转印于
PVDF膜上。5%脱脂奶粉室温封闭膜 1 h后，p65，
β-actin兔抗人单克隆抗体及p24、Lamin A/C鼠抗人单
克隆抗体1∶1000稀释于5%脱脂奶粉中，置于4 ℃摇床
孵育过夜。第2天将膜取出，用PBS-T（含0.1% Tween
20）清洗3遍后与羊抗兔及羊抗鼠二抗室温共孵1 h，清
洗5遍后用ECL发光液发光并显影。
1.2.5 数据分析 流式数据分析均采用FlowJo 7.6分析
软件来进行处理，GFP百分率采用prism 5作图软件作
图，误差线均用均数±标准差来表示。荧光图片及WB
图片运用adobe photoshop CS5处理。WB条带灰度值
采用ImageJ2X软件来分析。
2 结果
2.1 狼毒大戟提取物中活性组分质谱鉴定和高效液相
色谱分析
根据化合物prostratin结构（图1）分析，采用丙酮一
http://www.j-smu.com J South Med Univ, 2015, 35(11): 1614-1618 ·· 1615
步法从狼毒大戟粉末中提取得到的样品浓缩后溶于
DMSO，通过质谱检测，以标准品prostratin作为对照，
鉴定出粗提物中含有prostratin及prostratin类似物。采
用ESI（+）-MS，检测到M+23（Na）离子峰，质谱结果（图
2）如下。
丙酮提取物过C18反相柱高效液相色谱仪，用甲
醇作流动相来进行梯度洗脱，以 prostratin标准品作
对照，记录保留时间及峰面积。以 0、0.025、0.5、0.1、
0.2 mmol/L prostratin标准品做标准曲线（R2=0.99）。通
过标准曲线计算，得到丙酮提取物中活性组分prostratin
浓度约为0.53 mmol/L。
2.2 狼毒大戟提取物对潜伏HIV的有效激活
J-Lat 10.6是一株HIV潜伏细胞系，多用于激活化
合物的筛选，插入HIV基因组中的GFP基因随HIV基
因组整合于细胞中并处于潜伏状态，药物作用后GFP的
表达水平即代表HIV的激活水平。用50 μg/mL EFE刺
激24 h后，在荧光显微镜下观察并拍照，结果如图（图3）
所示。对应流式检测结果如图4。结果显示在药物作用
下，GFP水平明显上调，说明EFE能显著激活潜伏HIV。
2.3 狼毒大戟提取物通过提高激活NF-κB通路激活潜
伏HIV
EFE刺激潜伏细胞的同时，采用2.5、5、10 μmol/L
BAY 11-7082处理细胞24 h后，检测GFP阳性率，抑制
结果如图5所示。结果显示BAY 11-7082呈浓度依赖
方式抑制EFE激活潜伏HIV的作用，间接证明EFE激
活潜伏HIV受到NF-κB通路调控。药物处理不同时间
点提取核蛋白或总蛋白，用WB检测，蛋白印迹图片（图
6）显示随着时间变化，p65核内水平显著上调，且HIV
蛋白p24随着药物作用时间明显增加。为进一步确定
EFE通过NF-κB通路激活潜伏HIV，采用NF-κB通路
特异性抑制剂BAY 11-7082与EFE共同作用后（图7），
发现其能够抑制EFE诱导的p65入核，同时抑制了p24
的生成。
3 讨论
研究结果表明，药用植物狼毒大戟根部含有大量
prostratin，采用丙酮一步法可高效提取，研究中采用MS
鉴定并通过HPLC测得含量。实验结果证明prostratin
能有效激活潜伏HIV，进一步探讨其激活潜伏HIV机
制，发现其可通过激活NF-κB，诱导p65入核与DNA结
合从而发挥转录激活作用。
狼毒大戟作为传统中药材，其适应病症与功效早有
记载，因其毒性多作外用。在深入研究其活性组分的进程
中［9］，通过分离提取得到了多种萜类化合物：prostratin，
phorbol，PMA（Phorbol 12-myristate 13-acetate），Phorbol
12,13,20-triacetate等。其中prostratin作为酪氨酸激酶
抑制剂在抗肿瘤方面发挥重要疗效，近年来，又发现其
有强烈的激活潜伏HIV的作用，具有良好的清除潜伏
HIV实现HIV功能性治愈的前景［10］。随着各研究领域
对prostratin的关注增多，研究人员也不再局限于从植
物中提取，以phorbol为原料的半合成方法以及生物合
成方法取得了突破性进展［11-12］。然而，因其合成产率低
以及合成难度大，依然不能改变prostratin价格昂贵的现
状。本文中采用改进的丙酮一步法，可获得约40 μg/1 g
干重的高产率，在提取方法上与传统方法按化合物极性
分步提取的方法相比较，具有快速，简便的优势，避免了
多次分步提取导致的活性组分损失，同时也节约了大量
OH
H
H3C
O
O
O
H
H
OH
HO
图1 Prostratin的化学结构（相对分子质
量390.47）
Fig.1 Cchemical structure of prostratin,
C22H30O6 , M.W. 390.47.
图2 Prostratin标准品及丙酮提取物的质谱图
Fig.2 Mass spectrogram of prostratin standard control (A) and
acetone extract of Euphorbia fischeriana (B).
A
B
J South Med Univ, 2015, 35(11): 1614-1618 http://www.j-smu.com·· 1616
时间和精力，充分体现了丙酮一步法的优势，不失为
prostratin提取分离的优良方法［13］。
目前，关于HIV潜伏的机制并不十分明晰，总结已
发现激活剂的激活途径，可主要分为以下四类：以
prostratin为代表的PKC通路激活剂；以vorinostat为代
表的HDAC抑制剂；以JQ1为代表的P-TEFb激活剂；以
及以 IL-7为代表的免疫功能调节剂［14］。而后续深入研
究发现PKC通路下游入核转录效应因子NF-κB在四类
图3 EFE处理后对J-Lat 10.6细胞GFP的影响左为阴性对照，右为药物处理组
Fig.3 Fluorescent images of GFP cells. The left is negative control; the right is J-Lat 10.6
cells treated with EFE.
G
F
P
-p
os
it
iv
e
ce
ll
s
(%
)
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Ctrl EFE TNF-α
图4 EFE对潜伏HIV的激活效果
Fig.4 Activity of EFE in reactivating latent HIV. A, B: Flow cytometry analysis of GFP subset; C: Statistics of GFP %. ***P<
0.01 vs control Group.
FITC-A subset
3.51%
300
200
100
0
C
ou
nt
100 101 102 103 104
FITC-A
FITC-A subset
48.6%
100 101 102 103 104
FITC-A
120
90
60
30
0
C
ou
nt
A B
C
图6 EFE对HIV蛋白和NF-κB通路的影响
Fig.6 Effect of EFE on p24 and NF-κB pathway. A: Nucleus
protein level of p65 increased over time; B: HIV protein p24
increased apparently in 24 h.
0 0.5 1 2 (h)
Nucleus
p65
Lamin A/C
0 3 6 12 24 (h)
Cytoplasm
p24
β-actin
A
B
图7 BAY 11-7082对EFE激活的抑制作用
Fig.7 Effect of BAY 11-7082 on HIV reactivation capacity
of EFE. A: Nuclear accumulation of p65 was inhibited by
BAY 11-7082; B: The expression of p24 mediated by EFE
was inhibited by BAY 11-7082.
EFE - + + + +
BAY 11-7082 (μmol/L) - - 2.5 5 10
Nucleus
p65
Lamin A/C
Cytoplasm
p24
β-actin
A
B
EFE - + + + +
BAY 11-7082 (μmol/L) - - 2.5 5 10
图5 BAY 11-7082对EFE激活潜伏HIV在24 h产生
的抑制作用
Fig.5 Inhibitory effect of BAY 11-7082 on EFE shown
by GFP% reduction. ***P<0.01 vs control Group.
G
F
P
-p
os
it
iv
e
ce
ll
s
(%
)
70
60
50
40
30
20
10
0
0 2.5 5 10
BAY 11-7082
Ctrl
EFE-50 μg/mL
***
***
***
***
http://www.j-smu.com J South Med Univ, 2015, 35(11): 1614-1618 ·· 1617
激活剂的激活效应中均发挥作用，成为HIV基因转录的
关键因子［15］。经典NF-κB通路在介导炎症，免疫反应，
肿瘤生长和抑制方面得到了深入研究，其在药物诱导作
用下通过多种通路活化并入核与DNA相结合，发挥启
动转录特异基因的作用［16］。文中采用提取的EFE作用
于潜伏HIV细胞系J-Lat 10.6，发现其激活机制为促进
p65入核从而发挥转录激活效应，充分论证了NF-κB通
路在潜伏HIV激活过程中的关键作用。而在最新的研
究中发现，非经典NF-κB通路在HIV的转录激活过程
中同样发挥了非常关键的作用［17-18］。
总之，传统中药材狼毒大戟根部提取组分具有良好
的激活潜伏HIV活性，其药用价值和提取分离方法值得
进行深入探究。NF-κB通路在炎症肿瘤等多种疾病的
发生和发展中发挥了至关重要的作用，在潜伏HIV转录
激活的过程中的作用仍然值得进一步探索。本文研究
为解决prostratin的来源问题提供一定的可行性，并为
激活潜伏HIV机制以及HIV的清除提供了理论基础。
参考文献：
［1］ Shan L, Siliciano RF. From reactivation of latent HIV-1 to
elimination of the latent reservoir: the presence of multiple barriers
to viral eradication［J］. Bioessays, 2013, 35（6）: 544-52.
［2］ Le T, Farrar J, Shikuma C. Rebound of plasma viremia following
cessation of antiretroviral therapy despite profoundly low levels of
HIV reservoir: implications for eradication［J］. AIDS, 2011, 25（6）:
871-2; author reply 872-3.
［3］Tyagi M, Bukrinsky M. Human immunodeficiency virus（HIV）
latency: the major hurdle in HIV eradication［J］. Mol Med, 2012, 18
（1）: 1096-108.
［4］Katlama C, Deeks SG, Autran B, et al. Barriers to a cure for HIV:
new ways to target and eradicate HIV-1 reservoirs［J］. Lancet
（London, England）, 2013, 381（9883）: 2109-17.
［5］Archin NM, Margolis DM. Emerging strategies to deplete the HIV
reservoir［J］. Curr Opin Infect Dis, 2014, 27（1）: 29-35.
［6］Rasmussen TA, Tolstrup M, Winckelmann A, et al. Eliminating the
latent HIV reservoir by reactivation strategies: advancing to clinical
trials［J］. Hum Vaccin Immunother, 2013, 9（4）: 790-9.
［7］Williams SA, Chen LF, Kwon H, et al. Prostratin antagonizes HIV
latency by activating NF-kappaB［J］. J Biol Chem, 2004, 279（40）:
42008-17.
［8］ Tang Y, Jiang W, Wu Q, et al. Comparative characteristic of the
inflammatory diterpenes in the Roots of Euphorbia fischeriana with
different preparation method using HPLC-ELSD［J］. Fitoterapia,
2012, 83（3）: 427-33.
［9］ 王金兰,王玉起,李 涛,等.新鲜狼毒大戟根化学成分研究［J］.中药
材, 2010, 33（9）: 1406-9.
［10］Cox PA, Johnson HE, Tavana G. Giving samoan healers credit for
prostratin［J］. Science, 2008, 320（5883）: 1589.
［11］Barrero RA, Chapman B, Yang Y, et al. De novo assembly of
Euphorbia fischeriana root transcriptome identifies prostratin
pathway related genes［J］. BMC Genomics, 2011, 12（5）: 600.
［12］Dechristopher BA, Loy BA, Marsden MD, et al. Designed,
synthetically accessible bryostatin analogues potently induce
activation of latent HIV reservoirs in vitro［J］. Nat Chem, 2012, 4
（9）: 705-10.
［13］Tang Q, Su ZH, Han ZT, et al. LC-MS method for detecting
prostratin in plant extracts and identification of a high-yielding
population of Euphorbia fischeriana［J］. Phytochem Lett, 2012, 5
（1）: 214-8.
［14］Van Der Sluis RM. Jeeninga R E,berkhout B.establishment and
molecular mechanisms of HIV-1 latency in T cells［J］. Curr Opin
Virol, 2013, 3（6）: 700-6.
［15］Chan JK, Greene WC. NF-κB/Rel: agonist and antagonist roles in
HIV-1 latency［J］. Curr Opin HIV AIDS, 2011, 6（1）: 12-8.
［16］Setia S, Sanyal SN. Nuclear factor kappa B: a pro-inflammatory,
transcription factor-mediated signalling pathway in lung
carcinogenesis and its inhibition by nonsteroidal anti-inflammatory
drugs［J］. J Environ Pathol Toxicol Oncol, 2012, 31（1）: 27-37.
［17］Liu R, Tan J, Lin Y, et al. HIV-1 Vpr activates both canonical and
noncanonical NF-κB pathway by enhancing the phosphorylation of
IKKα/β［J］. Virology, 2013, 439（1）: 47-56.
［18］Manches O, Fernandez MV, Plumas J, et al. Activation of the
noncanonical NF-κB pathway by HIV controls a dendritic cell
immunoregulatory phenotype［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2012,
109（35）: 14122-7.
（编辑：孙昌朋）
J South Med Univ, 2015, 35(11): 1614-1618 http://www.j-smu.com·· 1618