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西藏药用植物螃蟹甲可培养内生真菌的分离、鉴定及
抗 HIV-1 整合酶链转移活性研究
张大为, 赵明明, 陈 娟, 李 超, 郭顺星*
(中国医学科学院、北京协和医学院药用植物研究所, 北京 100193)
摘要: 从西藏药用植物螃蟹甲 (Phlomis younghusbandii Mukerjee) 的叶和茎中分离得到 52 株内生真菌。经
分子鉴定 (基于 ITS 序列和 28S 序列), 内生真菌分属于 Phoma、Chaetosphaeronema、Fusarium、Leptosphaeria
等 12 属, 其中拟茎点霉属 (Phoma) 为其优势菌群。使用原核表达的可溶型一型人类免疫缺陷病毒 (human
immunodeficiency virus type 1, HIV-1) 的整合酶 (integrase, IN), 对 52 株内生真菌的发酵产物进行体外抗 HIV-1
整合酶链转移反应活性试验, 结果发现, 来自 Chaetosphaeronema 属真菌的 7 个样品对整合酶链转移反应表现出
强烈的抑制作用, 其对应的 IC50 值分别为 6.60、5.20、2.86、7.86、4.47、4.56 和 3.23 µg·mL−1。该研究表明, 螃
蟹甲内生真菌在发现抗 HIV-1 整合酶活性物质方面有进一步的开发价值。
关键词: 螃蟹甲; 内生真菌; HIV-1; 整合酶; 抑制剂筛选
中图分类号: R931 文献标识码: A 文章编号: 0513-4870 (2013) 05-0780-10
Isolation, idetification and anti-HIV-1 integrase activity of
culturable endophytic fungi from
Tibetan medicinal plant Phlomis younghusbandii Mukerjee
ZHANG Da-wei, ZHAO Ming-ming, CHEN Juan, LI Chao, GUO Shun-xing*
(Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences &
Peking Union Medical College, Beijing 100193, China)

Abstract: A total of 52 endophytic fungi were isolated from roots and stems of Tibetan medicinal plant
Phlomis younghusbandii Mukerjee. These fungal isolates were molecularly identified based on ITS sequnces
and 28S sequences distributed to 12 genera, including Phoma, Chaetosphaeronema, Fusarium and Leptosphaeria,
etc. Among them, the dominant genus was Phoma. Extracts of all strains were evaluated for anti-HIV-1
integrase activity by using soluable integrase expressed in E. coli BL21 (DE3). The results showed that seven
samples from five fungal endophytes PHY-24, PHY-38, PHY-40, PHY-51, PHY-53, which belonged to genus
Chaetosphaeronema, inhibited strand transfer reaction catalyzed by HIV-1 integrase with IC50 values of 6.60,
5.20, 2.86, 7.86, 4.47, 4.56 and 3.23 µg·mL−1 respectively. In conclusion, the endophytic fungi of Phlomis
younghusbandii Mukerjee are valuable for further screening anti-HIV-1 integrase agents.
Key words: Phlomis younghusbandii Mukerjee; endophytic fungi; HIV-1; integrase; inhibitor screening

内生菌 (endophyte) 是指存在于健康植物组织、
器官内并不引起明显病害症状的一类真菌[1]。内生菌

收稿日期: 2012-11-07; 修回日期: 2012-12-05.
基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (31170016, 81202438).
*通讯作者 Tel / Fax: 86-10-62829619, E-mail: sxguo2006@yahoo.com.cn
一词由 de Bary 于 1886 年首次提出[2], Freeman 于
1904 年从牧草中首次分离并报道了内生真菌[3]。直到
1993 年, Stierle 等[4]从太平洋红豆杉中分离到一株能
够产生抗癌代谢产物紫杉醇的内生真菌 Taxomyces
andreanae 后, 内生真菌的研究才成为热点。此后诸
DOI:10.16438/j.0513-4870.2013.05.004
张大为等: 西藏药用植物螃蟹甲可培养内生真菌的分离、鉴定及抗 HIV-1 整合酶链转移活性研究 · 781 ·

多研究发现, 内生真菌一方面能够产生与宿主植物
相同或相似的具有生理活性的次生代谢产物, 如紫
杉醇、长春新碱、鬼臼毒素和喜树碱等[4−8]; 另一方
面还能产生一些结构与植物化学成分完全不同的活
性产物, 包括抗生素, 抗肿瘤、抗寄生虫、抗氧化活
性物质及其他特殊活性物质[9−13]。因此, 内生真菌代
谢产物成为活性天然产物以及新药开发的重要来源。
螃蟹甲 (Phlomis younghusbandii Mukerjee) 为
唇形科糙苏属多年生草本植物, 主要分布于西藏、青
海海拔 2 700～4 800 m 的地区。其干燥块根 (藏语称
“露木尔”) 为藏医习用药材, 具有祛风活络、清热消
肿、止咳祛痰等功效, 广泛用于治疗感冒、咳嗽、肺
炎、支气管炎等疾病[14]。目前, 国内外对螃蟹甲的研
究主要集中于其化学成分[15−17]和药理活性方面[18−20],
而对螃蟹甲内生真菌的研究尚未见报道。本文对螃蟹
甲的内生真菌进行了分离鉴定, 并对其代谢产物的
抗HIV-1整合酶活性进行初步研究, 旨在筛选出能够
产生抑制HIV-1整合酶活性物质的内生真菌, 为螃蟹
甲内生真菌的利用及整合酶抑制剂的开发奠定基础。

材料与方法
植物材料 螃蟹甲 (Phlomis younghusbandii
Mukerjee) 样品于 2010 年 6 月采自西藏自治区米林
县。随机选取该植物健康植株, 剪下带有叶片的茎
段, 取样后立即放入塑料袋中, 贴上标签带回实验室,
4 ℃冰箱保藏并在 2 天内处理完毕。
内生真菌的分离 将新鲜植物材料用自来水冲
洗干净, 按下列程序进行表面消毒: 75% (v/v) 乙醇
漂洗 1 min、无菌水冲洗 3 次; 3% 的 NaClO 溶液漂洗
2 min、无菌水冲洗 3 次, 置于无菌滤纸上吸干水分。
将表面消毒后的样品剪成 0.5 cm × 0.5 cm 的片段, 贴
到马铃薯葡萄糖琼脂培养基 (Potato Dextrose Agar,
PDA) 平板上, 置于 25 ℃恒温培养箱中黑暗培养,
隔天观察, 待菌丝从植物组织长出后, 从边缘挑取菌
丝移至另一 PDA 平板上进行纯化。
内生真菌的发酵、活性成分提取及样品制备 挑
取菌丝块接种于装有 200 mL PDA 液体培养基的三
角瓶中, 25 ℃、120 r·min−1 摇床培养 10 天。使用尼
龙布过滤, 得到真菌发酵液和菌丝体。发酵液和菌丝
体分别以 95% 乙醇提取, 将提取物浓缩为浸膏并真
空冷冻干燥后, 使用二甲基亚砜 (dimethyl sulfoxide,
DMSO) 配制成浓度为 1 mg·mL−1 样品。
HIV-1 整合酶基因的合成及整合酶重组质粒
pET28a(−)-IN 的构建 将 F185K 和 C280S 可溶性突
变引入 HIV HXB2CG IN 的 cDNA 序列。为了方便
后续做克隆, 在该序列 5 和 3 端分别加上 Nde I 和
BamH I 酶切位点。根据重新设计的 DNA 序列合成
引物 (表 1)。应用重叠 PCR 的原理, 通过逐步拼接法
人工合成 HIV-1 IN 的 cDNA 序列。合成策略见图 1A。
将逐步拼接法获得的 HIV-1 IN 的 cDNA 全长序列克
隆至 pUCm-T 载体转化大肠杆菌 JM109 感受态细胞。
挑取克隆进行 DNA 序列测定 (上海生工生物), 测序
正确的重组质粒命名为 pUCm-IN。


Figure 1 Scheme of PCR-based gene synthesis for HIV-1
integrase (A); the result of DNA assembly for the synthesis of
integrase gene (B)

用 Nde I 和 BamH I 双酶切重组质粒 pUCm-IN 获
取 IN 基因, 连接到同样双酶切的 pET28a(−) 表达载
体, 转化 JM109, 筛选阳性克隆并提取质粒测序鉴定,
正确构建的含 HIV-1IN 基因的重组表达质粒命名为
pET28a(−)-IN。
HIV-1 整合酶的表达纯化[21] 转化 pET28a(−)-IN
至 E.coli BL21 (DE3) 中, 挑取单个菌落接种于含有
50 µg·mL−1 卡那霉素的 LB 培养基中, 37 ℃振荡培养
过夜。将过夜培养的菌液按照 1∶100 的比例, 接种
于 500 mL 含有 50 µg·mL−1 卡那霉素的 LB 培养基
中, 37 ℃振荡培养 (180 r·min−1) 至 A600值达到 0.6～
0.8, 加入过滤灭菌的 0.4 mol·L−1 IPTG 至终浓度为
0.4 mmol·L−1, 37 ℃振荡 (250 r·min−1) 诱导表达 4 h。
离心收集菌体。以含有 0.3 mg·mL−1 溶菌酶的缓冲液
A (20 mmol·L−1 HEPES, pH 8.0, 1 mol·L−1 NaCl,
2 mmol·L−1 β-mercaptoethanol, 5 mmol·L−1 imidazole)
重悬菌体, 4 ℃放置 30 min。冻融 3 次。超声破碎菌
体, 离心收集上清。上样于溶液 A 平衡的 Ni-NTA 凝
胶柱。以不同浓度咪唑的溶液 A 进行梯度洗脱, 收集
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Table 1 Primers for synthesis of integrase gene. aCodons of complementarity are in lowercase; bThe codon for introducing the F185K
site mutation is underlined; cThe codon for introducing the C280S site mutation is underlined; dThe Nde I restriction site and the AUG
initiation codon are underlined; eThe BamH I restriction site and the reverse sequence of the termination codons are underlined
Primer Primer sequence (5→3)a
P1 gccgcctgttggtgggcgggAATCAAGCAGGAATTTggaattccctacaatccccaaag
P2 tttaattctttattcatagattcTACTACTCCTTGActttggggattgtagggaattcc
P3 actgacaatggcagcaatttcaccggTGCTACGGTTAGGgccgcctgttggtgggcggg
P4 tgttcagcctgatctcttaccTGTCCTATAATTTTCtttaattctttattcatagattc
P5 ttagcaggaagatggccagTAAAAACAATACATactgacaatggcagcaatttcaccgg
P6 tgtggatgaatactgccatttgTACTGCTGTCTTAAGAtgttcagcctgatctcttacc
P7 agcagaaacagggcaggaaacagcATATTTTCTTTTAAAAttagcaggaagatggccag
P8b gcactgtaccccccaatcccccCTTTTCTTTTTTTATtgtggatgaatactgccatttg
P9 gtagccagtggatatatagaagcAGAAGTTATTCCagcagaaacagggcaggaaacagc
P10 tatgtctgttgctattatgtctacTATTCTTTCCCCTgcactgtaccccccaatccccc
P11 catttagaaggaaaagttatcCTGGTAGCAGTTCATgtagccagtggatatatagaagc
P12 atttttgtaatttgtttttgTAATTCTTTAGTTTGtatgtctgttgctattatgtctac
P13 tagactgtagtccaggaatatgGCAACTAGATTGTACAcatttagaaggaaaagttatc
P14 atttctgctgtccctgtaataaacCCGAAAATTTTGAatttttgtaatttgtttttg
P15 aaatgtcagctaaaaggagAAGCCATGCATGGACAAGtagactgtagtccaggaatatg
P16 ttccagaggagctttgctggTCCTTTCCAAAGTGGatttctgctgtccctgtaataaac
P17 gccacctgtagtagcaaaagaaatagTAGCCAGCTGTGATaaatgtcagctaaaaggag
P18 atgtcactattatcttgtattacTACTGCCCCTTCACCTttccagaggagctttgctgg
P19 taattggagagcaatggctagTGATTTTAACCTgccacctgtagtagcaaaagaaatag
P20 ctaatgatctttgcttttcTTCTTGGCACTACTTTTatgtcactattatcttgtattac
P21 atagataaggcccaagatgaacatgagAAATATCACAGtaattggagagcaatggctag
P22c tgccacagaatcatcacctgccatcTGTTTTCCATAATCCctaatgatctttgcttttc
P23d GGGAATTCCATATGTTTTTAGATGGAatagataaggcccaagatgaacatgag
P24e CGCGGATCCTTACTAATCCTCATCCTGTCTACTtgccacagaatcatcacctcgccatc

洗脱峰对应的蛋白。在溶液 B (20 mmol·L−1 HEPES,
1 mol·L−1 NaCl, 0.1 mmol·L−1 EDTA, 1 mmol·L−1 DTT,
10% [v/v] 甘油) 中 4 ℃过夜透析后, 分装冻存于
−80 ℃。
HIV-1 整合酶链转移活性测定[21] 寡核苷酸链
D1、D2、T1、T2 (表 2) 等摩尔量混匀, 95 ℃变性
3 min, 缓慢冷却退火至室温即为整合酶 DNA 底物。在
96 孔板中进行反应, 反应总体积为 50 µL。缓冲体系:
25 mmol·L−1 PIPES, 10 mmol·L−1 β-mercaptoethanol,
0.1 g·L−1 BSA, 5% 无菌甘油。加入 5 µL 用 DSMO 配制
的待测样品和 300 nmol·L−1 IN 至微孔板中, 37 ℃温
育20 min。加入1.5 pmol·L−1 供体DNA和15 pmol·L−1
靶 DNA 底物, 37 ℃反应 1 h。加入 1.5 μL 链霉亲和
素磁珠和 51.5 μL 结合缓冲液 [10 mmol·L−1 Tris-HCl,
pH 7.6, 2 mol·L−1 NaCl, 20 mmol·L−1 EDTA, 0.1%
Tween 20 (w/v)], 25 ℃孵育 15 min, 将微孔板置于磁
珠收集器上 90 s, 弃上清液。用 100 μL PBST 洗磁珠
3 次, 洗磁珠程序为: 加入 100 μL PBST, 彻底振荡
混匀, 置于板式磁珠收集器静置 90 s, 弃上清。PBST
洗磁珠 3 次, 加入 100 μL PBS 稀释的 (1∶5 000) 碱
性磷酸酶标记的地高辛抗体, 37 ℃温育 30 min。PBST
洗磁珠 3 次, 加入 100 μL 显色底物 (6.7 mmol·L−1
PNPP, 0.1 mol·L−1 Na2CO3, pH 9.5, 2 mmol·L−1 MgCl2),
避光显色 30 min, 加入 2 mol·L−1 NaOH溶液 20 µL终
止显色, 用酶标仪测定 405 nm 处的吸光值 (A405)。
整合酶抑制剂对 IN 活性的抑制测定 将整合酶
抑制剂 baicalein 以 DMSO 溶解。向反应体系中加
入不同浓度的 baicalein, 使 DMSO 的终浓度为 10%

Table 2 The sequences and modifications of oligonucleotides used in the experiments
Oligonucleotide Sequence (5→3) Modification
D1 ACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCA 5 biotin
D2 ACTGCTAGATTTTCCACACTGACTAAAAG None
T1 TGACCAAGGGCTAATTCACT 3digoxin
T2 AGTGAATTAGCCCTTGGTCA None
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(v/v)。IN 重组蛋白与 baicalein 在缓冲体系中 37 ℃温
育 20 min, 再加入 DNA 底物于 37 ℃反应 1 h, 随后
的操作步骤同整合酶活性测定部分。设置不加入 IN
蛋白的背景对照和无抑制剂的 DMSO 阳性对照, 抑
制率计算如下:
%100%/ 

阳性对照阴性对照
待测样品阴性对照
检测信号检测信号
检测信号检测信号抑制率
HIV-1 整合酶链转移反应活性菌株筛选 将真
菌代谢产物以 DMSO 溶解, 配成浓度为 1 mg·mL−1
的供试样品, 加入到反应体系中使待测样品在反应
体系中的终浓度为 0.1 mg·mL−1, IN 重组蛋白与待
测样品在缓冲体系中 37 ℃温育 20 min, 再加入 DNA
底物于 37 ℃反应 60 min, 随后的操作步骤同整合酶
的活性测定部分。设置终浓度 25 µmol·L−1 的抑制剂
baicalein 为阳性对照, 以不加入任何样品而使用终浓
度为 10% 的 DMSO 为阴性对照, 抑制率计算同整合
酶抑制剂对 IN 活性的抑制测定部分。
真菌 DNA 提取, PCR 扩增及系统发育分析 基
因组 DNA 的提取采用真菌 DNA 提取试剂盒 (E.Z.N.
ATM Fungal DNA Kit, Omega Bio-Tek, Doraville,
Georgia, USA)。应用真菌通用引物 ITS1 (5-TCCGTA
GGTGAACCTGCGG-3) 和 ITS4 (5-TCCTCCGCTT
ATTGATATGC-3) 扩增所有分离菌株的核糖体内转
录间隔区 (ITS-rDNA)[22]。应用通用引物为 LROR (5-
ACCCGCTGAACTTAAGC-3) 和 LR7 (5-TACTACC
ACCAAGATCT-3) 扩增 ITS 序列未能鉴定到属的菌
株的大亚基 (LSU)。50 µL PCR 反应体系: 25 µL 2×
EasyTaq PCR SuperMix, 引物 (5 µmol·L−1) 各 4 µL,
基因组 DNA 2 µL, 加双蒸水 19 µL。ITS 扩增条件:
95 ℃, 10 min; 95 ℃ 15 s, 52 ℃ 30 s, 72 ℃ 2 s, 35
个循环; 72 ℃ 10 min。LSU 扩增条件: 95 ℃, 10 min;
95 ℃ 15 s, 48 ℃ 30 s, 72 ℃ 2 s, 35 个循环; 72 ℃
10 min。电泳检测 PCR 产物, 送交北京金维智生物工
程公司进行双向测序。序列上传至 GenBank 数据库。
登陆 GenBank 对所有测序的内生真菌的 ITS 序
列用 BLAST 找到同源性最高的序列。如果目标序列
和参考序列有 95% 以上的同源性, 就暂定到参考序列
所在的属, 如果有 99% 的相似性就暂定到种水平。用
MEGA 4.0 中 Clustal W 1.6 功能对序列进行比对及对
齐操作。使用 MEGA 4.0软件通过 Kimura 2-Parameter
(K2P) 模型计算距离矩阵。使用 MEGA 4.0 软件, 采
用邻接法 (Neighbour-Joining) 构建系统发育树, 并
进行 1 000 次重复的自展检验[23]。
结果
1 内生真菌的分离、鉴定及系统进化分析
分离鉴定结果见表 3。本实验从西藏药用植物
螃蟹甲中共分离得到 52 株真菌, 其中 12 株来自叶,
40 株来自茎, 分属于 Phoma、Chaetosphaeronema、
Fusarium、Leptosphaeria 等 12 个分类单元, 其中优
势内生真菌是 Phoma 属, 占到分离菌株的 40.4%。

Table 3 Genera and their number of the endophytic fungi in
P. younghusbandii Mukerjee
Taxa Leaf Stem
Phoma sp. 19 2
Alternaria sp. 2 0
Paraphoma sp. 3 0
Paraphaeosphaeria sp. 1 0
Fusarium sp. 5 1
Sarocladium sp. 0 1
Diaporthe sp. 0 1
Chaetosphaeronema sp. 4 4
Phaeosphaeriopsis sp. 1 1
Leptosphaeria sp. 3 1
Ascochyta sp. 1 1
Coniochaeta sp. sp. 1 0
Total 40 12

ITS 序列能鉴定到属的有 36 株菌, 其中 27 株属
于子囊菌门座囊菌纲 (Dothideomycetes), 9 株属于子
囊菌门粪壳菌纲 (Sordariomycetes)。基于 ITS 序列的
系统发育分析分别见图 2A 和图 2B。
ITS 序列未鉴定到属的 16 株内生真菌使用
LSU 鉴定到属, 其中 15 株属于子囊菌门座囊菌纲
(Dothideomycetes), 1 株真菌属于子囊菌门粪壳菌纲
(Sordariomycetes)。基于 LSU 的系统发育分析见图 2C。
2 整合酶基因的合成及整合酶重组质粒 pET28a(−)-
IN 的构建
经过 12 次 PCR 和 12 次胶回收, 最终得到 HIV
HXB2CG IN 全基因序列, 基因合成过程中各步 PCR
产物电泳见图 1B。将 IN 全基因序列通过 T-A 克隆
连接到 pUCm-T 载体, 重组载体进行 DNA 测序, 结
果表明合成序列与预期一致。将测序正确的合成序
列双酶切连接到同样双酶切的 pET28a(−) 表达载体,
构建重组质粒 pET28a(−)-IN 并转化 JM109。挑取克
隆进行双酶切分析 (图 3) 和 DNA 序列测定。结果
表明序列与预期一致, 开放读码框正确, 无非期待突
变。
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Figure 2 Neighbour-joining (NJ) phylogenetic tree of endophytic fungi associated with P. younghusbandii Mukerjee. A: The
Dothideomycetes phylogenetic tree of strains from P. younghusbandii Mukerjee. Chalciporus piperatus was used as the outgroup. B:
The Sordariomycetes phylogenetic tree of the strains isolated from P. younghusbandii Mukerjee. Coprinus comatus was used as the
outgroup. C: The phylogenetic tree of the strains based on LSU sequences, which were not identified by ITS sequences. Cryptococcus
terricola was used as the outgroup


Figure 3 The Nde I/BamH I restriction enzyme digestion analysis
of recombinant plasmid pET28a(−)-IN. 1: Digestion products.
M: DL2000 DNA marker

3 HIV-1 整合酶的表达纯化
将表达质粒 pET28a(−)-IN 转化E. coli BL21 (DE3),
经 IPTG 诱导后, 使用 15% SDS-PAGE 对重组蛋白的
表达纯化进行分析 (图 4), 结果显示与不含 pET28a
(−)-IN的BL21细菌 (Lane 1) 相比, pET28a(−)-IN/BL21
工程菌在 33 kD 处有明显的条带,与目的蛋白 IN 及其
N端 6-His标签构成的融合蛋白分子量相当 (Lane 2);
IN 能够以较高的溶解性存在于破碎后的上清中
(Lane 3); 使用 NTA-Ni柱, 通过咪唑梯度洗脱和透析
后, 目的蛋白条带清晰可见, 没有非特异性条带, 以
BSA做为标准品, 使用BCA法测得 IN蛋白的浓度约
为 0.5 mg·mL−1。
4 重组整合酶功能鉴定及其催化链转移反应的灵敏
度和特异性检测
参照 He 等[21]所建立的 ELISA 方法测定重组 IN
蛋白的链转移活性。实验中设置了加入不同浓度 IN
蛋白的反应组和无 IN 蛋白的阴性对照组。结果如图
5 所示, 无 IN 阴性对照组信号为 0.176, 加入 IN 的反
应组按浓度依次增大的顺序, 其信号分别为: 0.582、
1.286、1.772、1.850、1.425 和 0.706。各组数据用 SPSS
13.0 软件进行方差分析, Duncan 测验进行比较, 发现
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Figure 4 SDS-PAGE analysis of the expressed HIV-1 integrase
protein. Lane 1: Escherichia coli cell control with the empty
pET28a after IPTG induction; Lane 2: Crude cell extract with
pET28a-IN after induction; Lane 3: Cell suspension containing
pET28a-IN after induction; Lane 4: Fraction of IN from column;
Lane M: Molecular weight markers (kD)

加入 IN 的各反应组与阴性对照组差异显著 (P < 0.01),
说明重组的 HIV-1 IN 具有链转移活性。图 5 还显示,
反应组信号随着 IN 浓度的提高而明显升高, 当 IN 浓
度达到 16 mg·mL−1 时信号值达到最高值, 相应的阳
性/阴性比值大于 10, 表明 IN 具有较高的反应活性。
随着 IN 反应浓度的进一步提高, 反应信号组呈现小
幅下降的趋势, 这与文献报道的结果相似 [24], 可能
是由于 IN 蛋白过量后聚集形成多聚体而失去活性。
以上结果表明, 纯化的 IN 具有较好的链转移反应活
性, 可用于 IN 相关研究。
根据文献测定以下各组反应的信号值: 不加 IN
蛋白酶 (-IN); 不加供体 DNA (-Donor); 不加靶 DNA
(-Target); 不加 Mn2+ (-Mn2+)。结果 (图 6) 显示: 不
加 IN 蛋白酶 (-IN)、不加供体 DNA (-Donor)、不加


Figure 5 The activity characterization of the recombinant IN
protein

Figure 6 The evaluation for sensitivity and specificity of
strands transfer reaction catalyzed by HIV-1 IN

靶 DNA (-Target)、不加 Mn2+ (-Mn2+) 的各对照组的
A405 值均低于 0.06, 而加入上述所有成分的链转移反
应组 (+All) 的信号值高于 1.17。
5 整合酶抑制剂对 IN 链转移反应活性的抑制测
定
Baicalein 能抑制 IN 3 加工和链转移反应活性且
能在细胞水平抑制病毒复制, 将其作为一种药物, 验
证使用重组酶用于抑制剂筛选的有效性。实验结果显
示, 随着 baicalein 在反应体系中浓度不断增加, IN 链
转移活性逐渐被抑制。通过绘制剂量−抑制效应曲线,
使用非线性拟合计算得到 baicalein 对链转移反应抑
制的 IC50 值为 1.37 µmol·L−1 (图 7), 与文献[25]中使
用放射自显影方法和传统固相 ELISA 获得的 IC50 值
相似, 表明本研究所采用的方法能够有效应用于针
对 IN 链转移反应活性的抑制剂筛选。


Figure 7 Inhibition of the strand transfer reaction for HIV-1 IN
with integrase inhibitor baicalein

6 抗 HIV-1 整合酶链转移反应活性实验结果
以 52 株内生真菌的发酵产物为待测样品, 进行
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IN 链转移抑制剂的筛选, 每个真菌有菌丝体样品和
发酵液样品各一份, 共 104 个样品。结果显示, 大部
分菌株的代谢产物在质量浓度为 0.1 mg·mL−1 时, 对
HIV-1 整合酶链转移反应都表现出了一定的抑制活
性, 其中 Chaetosphaeronema 属的 5 株真菌 PHY-24、
PHY-38、PHY-40、PHY-51 和 PHY-55 的发酵产物对
该酶的抑制活性均达到 90%以上 (表 4)。
选取活性较好的 7 个样品, 以样品在反应体系
中的终浓度为 0.1 mg·mL−1 作为起始浓度进行倍比稀
释, 分别以 0.05、0.025、0.012 5、0.006 25 和 0.003 125
mg·mL−1 为抑制浓度, 测定样品在以上浓度时对 IN
链转移活性的抑制百分率, 通过非线性拟合得出 7个
样品对 IN 链转移抑制的 IC50 值 (图 8 A～G)。结果
显示, PHY-24 和 PHY-53 的菌丝体提取物对 IN 链转
移抑制的 IC50值分别为 5.2 和 3.23 µg·mL−1; PHY-24、
PHY-38、PHY-40、PHY-51 和 PHY-53 发酵产物的
IC50 值分别为 6.60、7.86、2.86、4.47 和 4.56 µg·mL−1。
讨论
植物内生真菌在与寄主长期的进化过程中存在
着基因的水平传递, 这为从真菌中寻找后者产生的
活性物质提供了可能[4]。使用药用植物内生真菌代谢
产物进行药物筛选时, 对内生真菌尤其是其宿主的
选择尤为重要, 本研究选择西藏药用植物螃蟹甲做
为内生真菌的来源, 原因有以下两点: ① 螃蟹甲属
唇形科药用植物, 有研究报道, 许多唇形科药用植物
都具有抗病毒的作用, 如黄芩[26]、夏枯草[27]等; ②
有研究发现, 螃蟹甲植物提取物具有抗菌作用[28]。本
研究结果显示从螃蟹甲中分离到了具有抗 HIV-1 活
性的内生真菌, 说明在选取内生真菌时, 考虑宿主植
物及其药理作用是非常合理和必要的, 这在一定程
度上可以减少工作的盲目性, 提高筛选出活性菌株
的成功率。
目前, 抗HIV-1活性化合物筛选仍然是天然产物
化学的研究重点之一。FDA 已批准上市的 HIV-1 整

Table 4 HIV-1 integrase inhibitory activity of 52 endophytic fungi from P. younghusbandii Mukerjee. n = 5. FB: Fermentation broth;
M: Mycelium
Inhibition /% Inhibition /%
Strain
FB M
Strain
FB M
PHY-01 48.31 ± 13.52 20.05 ± 7.77 PHY-27 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00
PHY-02 40.04 ± 6.11 0.00 ± 0.00 PHY-28 12.54 ± 10.98 0.00 ± 0.00
PHY-03 6.21 ± 4.97 23.82 ± 3.84 PHY-29 0.00 ± 0.00 3.32 ± 35.59
PHY-04 17.05 ± 4.70 17.79 ± 1.60 PHY-30 0.00 ± 0.00 40.27 ± 5.03
PHY-05 25.17 ± 7.84 7.88 ± 9.91 PHY-31 20.14 ± 8.24 27.38 ± 16.34
PHY-06 39.54 ± 4.37 0.00 ± 0.00 PHY-32 6.86 ± 10.48 21.27 ± 14.36
PHY-07 42.01 ± 7.36 0.00 ± 0.00 PHY-34 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00
PHY-08 56.02 ± 8.09 19.30 ± 5.95 PHY-35 40.89 ± 2.52 59.08 ± 4.20
PHY-09 35.50 ± 2.55 15.53 ± 3.23 PHY-36 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00
PHY-10 1.48 ± 3.64 13.78 ± 7.25 PHY-37 0.00 ± 0.00 34.53 ± 2.63
PHY-11 9.42 ± 10.20 11.80 ± 2.95 PHY-38 102.48 ± 2.12 76.28 ± 1.75
PHY-12 5.22 ± 8.98 13.97 ± 3.71 PHY-39 2.58 ± 5.74 0.00 ± 0.00
PHY-13 26.82 ± 1.10 60.02 ± 3.00 PHY-40 90.33 ± 4.61 67.37 ± 0.14
PHY-14 14.19 ± 2.56 23.14 ± 5.92 PHY-41 4.12 ± 12.33 0.00 ± 0.00
PHY-15 31.70 ± 5.93 0.24 ± 10.79 PHY-42 0.00 ± 0.00 32.50 ± 18.51
PHY-16 41.15 ± 13.89 7.75 ± 9.12 PHY-43 0.00 ± 0.00 13.70 ± 3.74
PHY-17 54.89 ± 10.94 25.14 ± 4.73 PHY-44 13.78 ± 19.17 0.00 ± 0.00
PHY-18 48.20 ± 23.20 33.56 ± 12.34 PHY-46 5.31 ± 7.55 10.11 ± 1.80
PHY-19 28.21 ± 18.60 37.89 ± 4.69 PHY-47 50.79 ± 6.84 24.93 ± 0.51
PHY-20 41.28 ± 24.06 39.17 ± 11.75 PHY-48 25.62 ± 5.58 0.00 ± 0.00
PHY-21 30.11 ± 1.29 34.26 ± 9.01 PHY-50 0.00 ± 0.00 44.39 ± 1.99
PHY-22 36.30 ± 3.63 36.32 ± 14.10 PHY-51 97.90 ± 3.65 89.14 ± 4.15
PHY-23 43.97 ± 11.36 38.49 ± 13.39 PHY-52 4.47 ± 5.23 11.74 ± 8.17
PHY-24 102.05 ± 2.26 103.65 ± 0.81 PHY-53 65.97 ± 12.13 90.28 ± 1.71
PHY-25 51.03 ± 13.80 50.24 ± 6.01 PHY-54 8.15 ± 10.94 0.00 ± 0.00
PHY-26 10.17 ± 8.39 0.00 ± 0.00 PHY-55 95.24 ± 3.27 46.57 ± 0.65
张大为等: 西藏药用植物螃蟹甲可培养内生真菌的分离、鉴定及抗 HIV-1 整合酶链转移活性研究 · 787 ·



Figure 8 The inhibitory rates of the strand transfer reaction of IN with extracts from mycelium of fungi PHY-24, PHY-53, and extracts
from fermentation broth of the fungi PHY-24, PHY-38, PHY-40, PHY-51, PHY-53

合酶抑制剂二酮酸类化合物 Raltegravi 衍生于真菌来
源的化合物[29]。有许多研究都报道了从植物内生真
菌中分离得到了抗 HIV-1 整合酶活性物质, 如 Singh
等[30]从一株栎树内生真菌中分离得到抗 HIV-1 活性
物质的内生真菌; 相子春[31]和王雅俊[32]分别筛选得
到了能够产生抗HIV-1整合酶活性的内生真菌; 车永
胜等[33]从拟盘多毛孢属植物内生真菌中分离出许多
具有抗 HIV-1 的活性成分。
本研究首次对西藏药用植物螃蟹甲的内生真
菌进行了分离、鉴定和抗 HIV-1 整合酶活性测试。
得到了 5 株具有很强抗 HIV-1 整合酶活性的内生
真菌, 而且发现, 这些高活性菌株的种属具有一定
特异性, 均属于 Chaetosphaeronema sp.。曾有学者从
Chaetosphaeronema 属真菌一个种 Chaetosphaeronema
hispidulum的发酵液中分离得到一个磷脂酶C抑制剂
Hispidospermidin[34]。但未见关于 Chaetosphaeronema
属真菌具有抗HIV-1整合酶活性的报道, 本研究首次
报道该属的真菌产物具有抗HIV-1整合酶的活性, 其
· 788 · 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2013, 48 (5): 780−789

中的活性化合物有待进一步追踪。
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《解放军药学学报》2013 年专栏征稿通知

为提高《解放军药学学报》稿件的学术水平, 为广大药学工作者提供一个交流和展示热点关注学科研
究成果的平台, 同时满足为官兵、为人民健康服务的要求, 经《解放军药学学报》编委及编辑部会议通过,
本刊 2013 年将设专题研究栏目: 主题为高原药学。
主要内容包括: 高原药物研究、勤务研究、管理、临床用药、预防用药等。
投稿时请在首页注明“专栏”字样。征稿时间: 即日起到 2013 年 5 月 31 日。


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