全 文 ：·综述与专论· 2014年第2期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）为
复制缺陷型病毒，是细小病毒家族的一个成员，具
有一系列特征，能将基因组定点整合到人类基因组
19 号染色体特定区域（19q13.42-qter）：AAVS1［1-3］，
并且没有发现与人类疾病有关，是基因治疗的理想
载体［4］。AAV 的有效感染通常需要辅助病毒的存在，
如腺病毒（Ad）、疱疹病毒（herpes virus）和人乳头
瘤病毒（HPV）等［5］。AAV 基因组为 4.7 kb 的单链
DNA（ss-DNA），两个末端是倒转重复序列（ITR），
收稿日期 ：2013-09-14
基金项目 ：国家自然科学青年科学基金项目 （81201183），中央高校基本科研业务费资助项目 （JB-ZR1142）
作者简介 ：占申标，男，硕士研究生，研究方向 ：基因工程 ；E-mail ：1200416004@hqu.edu.cn
通讯作者 ：李招发，男，博士，副研究员，研究方向 ：基因工程，生物医学工程 ；E-mail ：lizhaofa@hqu.edu.cn
腺相关病毒 Rep78/68 蛋白功能的研究进展
占申标1  吕颖慧1，2  李招发1，2
（1. 华侨大学分子药物研究院，泉州 362021 ；2. 分子药物教育部工程研究中心，泉州 362021）
摘 要 ： Rep78/68 是腺相关病毒（AAV）基因组编码的具有多种调控功能的非结构蛋白。主要参与了 AAV DNA 定点整合
到人类 19 号染色体，抑制病毒的生物活性，如腺病毒、类猿病毒 SV40 等，调节 AAV DNA 的复制和转录等。重点阐述了定点整
合的作用机制，Rep78/AAV ITR /ICP8 复合物的形成机制以及 Rep68 蛋白的寡聚化特性，Rep78 蛋白对 p53 核输出的限制，AAV
Rep78 蛋白与人乳头瘤病毒（HPV）E1 蛋白相互作用从而促使 Rep78 和 ITR DNA 的结合，Rep78 对乙型肝炎病毒（HBV）的抑制。
这些作用的详细机制仍需完善和充实，对 Rep78/68 蛋白的相关作用机制的深入研究有助于 rAAV 基因药物的研发。
关键词 ： AAV Rep78 Rep68 p53 机制
Progress in the Research Regarding to the Function of
Protein Rep78/68
Zhan Shenbiao1 Lü Yinghui1，2 Li Zhaofa1，2
（1.Institute of Molecular Medicine，Huaqiao University，Quanzhou 362021 ；2.Molecular Medicine Engineering Research Center，Ministry of
Education，Quanzhou 362021）
Abstract:  Rep78/68, a type of nonstructural proteins encoded by adeno-associated virus（AAV）genome, have a variety of control
functions. Rep78/68 promote the integration of AAV DNA site-specific into human chromosome 19, suppress the virus biological activity, such as
adenovirus, simian virus 40, adjust the AAV DNA replication and transcription, etc. This paper mainly discusses the mechanism of site-specific
integration, the mechanism of Rep78 / AAV ITR/ICP8 complex formation and the characteristics of the oligomerization of Rep68 protein, the
limit of the nuclear output of p53 by Rep78 protein, the interaction between AAV Rep78 and human papilloma virus（HPV）E1 protein prompt
the combination of Rep78 and ITR DNA, inhibition of the hepatitis B virus（HBV）by Rep78. While the detailed mechanism still remaines to
be improved and enriched, further elucidatation of Rep78/68 protein related mechanism may improve the production technology of rAAV and
develop gene drug based on rAAV, which has a great significance.
Key words:  AAV Rep78 Rep68 p53 Mechanism
它是 AAV 基因组复制和包装所必须的唯一顺式作
用元件［6，7］。ITR 序列之间包含两个开放阅读框架，
称为 Rep 和 Cap，分别编码 4 个非结构蛋白（Rep78、
Rep68、Rep52 和 Rep40）和 3 个结构性蛋白（VP1、
VP2 和 VP3）［8］。另外，Cap 基因的开放阅读框 2 还
编码装配激活蛋白（AAP）［9-11］。Rep78 和 Rep68 蛋
白在 AAV 的生命周期中扮演着相当重要的角色，这
两个蛋白的深入研究，对重组腺相关病毒（rAAV）
介导的基因治疗意义深远。基于此，本文主要阐述
2014年第2期 25占申标等 ：腺相关病毒 Rep78/68 蛋白功能的研究进展
了 Rep78 和 Rep68 蛋白一些相关作用的机制研究。
1 Rep78/68 的结构
4 个非结构的 Rep 蛋白分别由 p5 和 p19 启动子
起始的 mRNA 通过选择性剪接后翻译而得。Rep78
和它的剪接异构体 Rep68 由 p5 启动子起始的 2 种
mRNA 翻译，Rep52 和它的剪接异构体 Rep40 由 p19
启 动 子 起 始 的 2 种 mRNA 翻 译［12］（ 图 1）。Rep52
和 Rep40 蛋白 C 末端的氨基酸序列分别与 Rep78 和
Rep68 相同。Rep78/Rep68 具有 ATP 酶和螺旋酶的
活性结构域。在辅助病毒存在时，两个大的 Rep 蛋
白序列和功能很是相似，Rep78/68 蛋白可以和 ITR
中的特定序列结合。类似的序列在 AAV 的 3 个启动
子上游也都存在。这两种蛋白对于 AAV 生活周期的
每一时期都是必需的。能够完成一系列复杂的功能，
Rep 蛋白肯定能与细胞内的一些蛋白，以及辅助病
毒的蛋白产生相互作用，迄今为止，对这些相互作
用的研究还不是很透彻［13］。
和能被 Rep 蛋白的剪切活性识别的末端决定位点
（TRS）［15］，RBS 由串联重复序列的四聚物 GAGC 组
成［14］，Rep78/68 可特异识别（GAGC）4 DNA 序列，
这一序列被称为 Rep 识别序列（RRS），人类的 19
号染色体 AAVS1 就存在于 RRS 序列中。体外的结
合试验表明 ：Rep78/68 与 AAV DNA 结合以及剪切
功能在 AAV 定点整合过程中发挥着很重要的作用，
Rep78/68 能够调节 AAV ITR 和 AAVS1 上包含 RBS
和 TRS 的一段 109 bp 的序列之间复合物的形成［16］。
如果将 RRS 或 TRS 序列突变，定点整合就无法进
行［17］。其中，可以肯定有许多未知的胞内蛋白也都
参与了整合过程，但是至今还没有研究清楚［17-19］。
AAV genome
P5 P19 P40
Rep
Cap
Rep78
3˃ ITR 5 I˃TR
Rep68
Rep52
Rep40
图 1 AAV 基因组结构
2 Rep78/68 协助 AAV 基因组定点整合
腺相关病毒能将基因组定点整合到人类 19 号染
色体上的特定位点 AAVS1（图 2）。Surosky 等［14］利
用 PCR 技术鉴定得知，在一些特定的细胞中，AAV
基因组能整合到 AAVS1。通过这个试验发现，无
论是顺式或者反式的 AAV Rep 蛋白，对于定点整
合都起着决定性的作用。而且只有两个大的 Rep 蛋
白（Rep78 和 Rep68）参与了定点整合这一过程。
另外，顺式的 AAV 末端倒转重复序列（ITR）对于
定点整合到 AAVS1 并非必不可少，但可以提高整
合的效率。ITR 包含一个 Rep 蛋白结合位点（RBS）
AAVS1
chr. 19
图 2 AAV-2 与人类 19 号染色体的结合位点
通过一系列的体外或者体内的试验都可以得到
如下的结论 ：首先，AAV ITR 和 AAVS1 中的 RBS
在 Rep78/68 的作用下得以靠近［16，20］；其次，形成
Rep 介导复合物，并且推测 Rep78/68 特异剪切 ITR
和 AAVS1 的特定位点 ；最后，以非同源重组的方式
进行位点整合［17，21］。
Surosky 和 Urabe 等［14］验证了利用两个质粒来
实现定点整合 ：分别是包含 AAV ITR 的质粒和 AAV
Rep 蛋白的质粒。这个系统的优点是没有病毒被包
装，也就没有整合序列大小的限制，对于基因治疗
的发展颇有意义。
虽然 Rep78/68 对于 AAV 的定点整合和长期有
效表达是必须的，但还无法确定 Rep78/68 是否仅仅
只促进了定点整合这一过程，也许 Rep78/68 也作用
于其他的一些随机整合。由于 Rep78/68 能够高效的
与 RBS 结合，推测 Rep78/68 可能促进随机整合或者
定点整合于与野生型 RBS 有一点相似的位点［22］。
Philpott 等［23］通过研究发现，AAV ITR 不是介
导定点整合的必要条件。在 Rep78/68 存在时，由于
138 bp 的顺式 P5 整合效率元件（P5IEE）作用，定
点整合依然会发生。为此，又提出最新的定点整合
机制 ：Rep 蛋白与 AAVS1 位点特异结合，发生剪切，
出现 AAVS1 位点的扩增和重排，而且 Rep 蛋白与
AAV P5IEE 结合，这样两个模板就相互靠近，在复
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第2期26
制时发生置换或重组，定点整合也便得以进行了［24］。
3 Rep78/Rep68 调节 AAV DNA 的复制和转
录
3.1 Rep78引导的Rep78/AAV ITR/ICP8三元复合物
的形成
单纯疱疹病毒（HSV）的 ICP8 蛋白以及 UL5/
UL18/UL52 的解旋酶-引物酶复合体构成的异源三聚
体所形成的 4 个蛋白复合物参与了 AAV DNA 的复
制［25］。其中，解旋酶 UL5 和引物酶 UL52 能够吸引
Rep 蛋白和 AAV 基因组，从而起始 AAV DNA 的复
制［26，27］。
Alex 等［28-30］通过试验发现 ：在体外，Rep78 的
C 末端缺失的突变型仍有与 ICP8 和 AAV ss-DNA 相
互作用的能力，而 N 末端缺失的突变型在体内没有
显示出促使 AAV DNA 复制的趋势。Rep78 的 C 末
端主要包含了核定位信号序列，N 末端则有与 AAV
ITR 上 RBS 定点结合的结构域和内切酶活性。另外，
研究表明 ：Rep78 与 AAV ITR 的直接接触为三元复
合物的形成所必需。Rep 和 ICP8 在核复制区域的共
区域化依赖于 Rep 与 AAV ITR 的结合和解开 ITR 双
链 能 力。Rep78/68 与 AAV ITR 的 RBS 结 合， 解 开
AAV ITR 的双链，牵引 ICP8、解旋酶与引物酶复合
物以及其他的复制相关因子，然后 ICP8 迅速与 ss-
DNA 区域结合。这两个进程是否有相互作用至今还
无法确定。接下来由于蛋白与蛋白的相互作用，三
元复合物得以形成。
3.2 AAV-2 Rep68蛋白的区域连接是寡聚化进程
的重要组成部分
AAV 的 4 个 Rep 蛋白相互协调，共同作用于
腺相关病毒生命周期的各个方面 ：包括转录调节、
DNA 复制、病毒包装及定点整合。所有的 Rep 蛋白
都有一个 SF3 超家族解旋酶结构域，在其他的 SF3
家族中，这一结构域能有效地诱使寡聚化，然而依
据 AAV Rep 蛋白单体的特性，发现 AAV Rep 蛋白
中的解旋酶结构域无法调节稳定的寡聚化［31］。
Zarate-Perez 等［31］推测存在一个未知的决定性
结构来调节 Rep 蛋白的寡聚化。通过比较 AAV-2
Rep 蛋白的解旋酶结构域和其他的 SF3 家族的解旋
酶结构域发现，Rep 蛋白解旋酶结构域的小寡聚亚
结构存在一个主要结构，与其他的 SF3 解旋酶结构
域有明显的差异。此外，Rep 蛋白的解旋酶结构域
和自身的起始结合区域（OBD）结合的二级结构预
测模型表明有形成 α-螺旋的潜力。其中，Rep 蛋白
的芳香族连接基团（Y224）对寡聚化至关重要，它
是 SF3 解旋酶的保守序列。这个基团的突变明显影
响寡聚化作用，并且使产生感染性病毒的能力完全
丧失。总之，可以假设一个寡聚化机制模型 ：在解
旋酶结构域折叠形成 α-螺旋之前，Y224 能够成为解
旋酶结构域整体的一部分，对寡聚化至关重要，同
时通过与 OBD 和解旋酶结构域相互合作来对 Rep68
蛋白的功能发挥重要影响［31］。
AAV-2 Rep68 蛋白的区域连接是它的寡聚化进
程的一部分，在寡聚化过程中发挥重要的作用［31］。
4 Rep78/Rep68 抑制病毒的生物活性以及对
辅助病毒的依赖性
4.1 AAV Rep78限制腺病毒E1B55K调节的p53核
输出
p53 是重要的细胞转录因子，可以抑制癌症的
发生［32］，参与细胞周期的循环，当有严重的 DNA
损伤时能够诱发细胞凋亡［33］。E1B55K 蛋白是腺病
毒的早期基因产物，能与 p53 的氨基末端转录调节
区结合［34］，形成复合物，从而可以诱使 p53 从核
内转移到细胞质，这样就达到了抑制 p53 的调节转
录效应［35］。其中，E1B55K-p53 的相互作用的发生
依赖于 E1B55K 的寡聚化和 p53 的四聚体化［36］。而
AAV 能够使 p53 不被腺病毒影响，这对癌症的治疗
起着特殊的意义。研究表明 ：在腺病毒和 AAV 共转
染的细胞中，Rep78 和 p53 会形成复合物［37］，但是
AAV 如何影响 E1B55K 抑制 p53 相关活性的准确机
制还没有弄清楚。Wang 等［38］发现 AAV-2 的 Rep78
蛋白能抑制腺病毒 5 型 E1B55K 调节的 p53 核输出
这一进程，但不能直接影响 p53 的稳定性，也不能
缓解对 p53 的转录调节活性的抑制作用。
Wang 等［38］通过共聚荧光分析发现，当 Rep78、
E1B55K 和 p53 在 H1299 细胞中共表达时，Rep78 会
抑制 E1B55K 与 p53 的相互靠近，也能促使 E1B55K
重 新 定 位。E1B55K 具 有 E3 SUMO1-p53 连 接 酶 的
功能，可以诱使 p53 与 E1B55K 在白血病基因核体
2014年第2期 27占申标等 ：腺相关病毒 Rep78/68 蛋白功能的研究进展
（PML-NBs）处共区域化，从而使得 p53 的核输出得
以实现［39］。Rep78 也许能够抑制 p53 共区域化后的
核输出，具体的机制还未弄清。
Rep78 蛋 白 并 没 有 被 发 现 直 接 影 响 p53 的 降
解和 E1B55K 的抑制作用。虽然 Rep78 也能与 p53
相 结 合， 但 是 不 能 从 p53-E1B55K 复 合 物 中 取 代
E1B55K。Rep78 能够引导 p53 重新定位于核内，但
E1B55K 依 然 与 p53 共 区 域 化。 因 此，E1B55K 仍
然和 p53 的氨基末端转录调节区域结合，这也就解
释了虽然 p53 在核内大量积累，但 p53 的稳定性以
及转录调节活性没有增加。也许，p53、E1B55K 和
Rep78 共同表达时能形成三聚体复合物，E1B55K 也
可能与 Rep78 结合［13］。
虽然在 E1B55K 存在下，Rep78 不直接影响 p53
的稳定性或转录调节活性，但能使 p53 和 E1B55K
在核内重定位。目前还不清楚是否有其他的作用影
响这一过程。Rep78 通过限制 p53 的核输出来抑制
腺病毒 5 型的作用这一新的机制，对我们研究腺病
毒这一辅助病毒对 AAV 的调节有着重大意义［38］。
4.2 AAV Rep78和HPV E1相互作用，促使Rep78
和ITR DNA结合
AAV 的相关生命活动需要辅助病毒提供帮助，
才能正常进行［40］。如人乳头瘤病毒 16 型（HPV）
E1 蛋白对 AAV2 的生命周期就可提供帮助，可以提
高 AAV DNA、mRNA，以及一些相关蛋白的表达水
平。与 AAV Rep78 类似，E1 是 HPV 的 复 制 蛋 白，
但 E1 没有 Rep78 的内切酶和共价结合活性。E1 和
Rep78 在体外可以相互作用，利用从细菌中提纯
的 Rep78 和 E1 蛋白，研究在体外 E1 蛋白对 Rep78
与 AAV ITR DNA 相 互 作 用 的 影 响。E1 能 够 增 强
Rep78-ITR 的结合、ATP 酶活、Rep78-ITR 的共价连
接以及 Rep78-ITR 的内切酶活性，这种增强作用有
明显的剂量依赖关系。然而，E1 和 Rep78 相互作用
后的 Rep78 解旋酶活性明显要比 Rep78 单独时的解
旋酶活性低。研究表明，E1 之所以能对 AAV 的生
命周期进行广泛的调节，是由于 E1 可以增强 Rep78
与 ITR DNA 结合至关重要的区域的生化特性［5］。
解旋酶活性改变不是 E1 蛋白诱发 AAV 更有效
复制的直接机制，在 HPV E1 存在下，Rep-ITR 复合
物的相关功能增强，但是 E1 不能直接与 ITR 结合。
E1 蛋白能够增强 Rep78 在 AAV ITR 上的内切酶活
性和共价结合能力。因此，可能正是由于这个原因，
E1 蛋白才能促使 Rep78 和 ITR 的结合作用。E1 可
以增强 Rep78 在目标 DNA 上形成寡聚物的能力，多
样的 Rep78 寡聚物与 AAV ITR DNA 相结合，其中
ATP 会促进部分的寡聚物形成。而且，E1 蛋白也能
够增强 Rep78 蛋白的 ATP 酶活性。ATP 酶活性又会
影响解旋酶、内切酶活性以及共价结合。总之，通
过增强 Rep78 的关键位点的生化特性，E1 蛋白便可
以促进 Rep78 与 ITR DNA 的结合，进而对 AAV 生
命周期的相关进程产生重要作用［5］。
4.3 AAV Rep78蛋白抑制乙型肝炎病毒（HBV）
AAV 可以抑制人乳头瘤病毒（HPV）、腺病毒、
人类免疫缺陷病毒、单纯疱疹病毒和类猿病毒 SV40
等，1989 年首次报道将 AAV 抑制病毒的作用归结
于 Rep78 蛋白的作用。
刘天会等［41］利用 PCR 技术扩增 HBV-S、C 和
X 基因。通过凝胶电泳阻滞试验（EMSA），可以检
测 到 Rep78 蛋 白 在 体 外 能 够 与 HBV-S、C 和 X 的
DNA 相结合，并且与 HBV-C 的结合能力最强，还发
现随着 Rep78 剂量增多，结合能力更强，呈一定的
剂量依赖关系。刘天会等［41］研究表明 AAV Rep78
蛋白可与 HBC-C 启动子特异结合，从而下调其转
录［42］。因此，可以推测 AAV-Rep78 抑制 HBV DNA
复制的机制就是 Rep78 蛋白结合并抑制了 HBV-C 基
因，这为抗 HBV 提供了一些新思路，更重要的是可
以改善 rAAV 载体在基因治疗中的应用。
5 展望
Rep78/68 在腺相关病毒生命周期中有着很多重
要的作用 ：Rep78/68 蛋白的表达对 AAV 病毒从整
合状态的拯救、各种 AAV 基因的表达和 AAV DNA
的复制都是必需的。另外，Rep 的表达能够抑制腺
病毒（Ad）、猿猴病毒 40（SV40）、人乳头瘤病毒
（HPV）、艾滋病毒（HIV）和疱疹病毒的传播。 Rep 78
和 Rep68 蛋白与 AAV 基因表达的正负调控有关［4］。
总之，Rep78 和 Rep68 蛋白在 AAV 的生命周期中起
着至关重要的作用，虽然我们对其中的一些作用的
机理有了一定程度的认识，但许多与 Rep 蛋白相关
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第2期28
的作用的具体机制仍然还需探索。例如，Rep78/68
对 AAV DNA 定点整合到人类 19 号染色体作用的最
合理、最准确的机制还不是很清楚，Rep78 抑制的
p53-E1B55KHPV 共区域化后的 p53 核输出的具体机
制研究的也不是十分清楚，E1 上调的 AAV Rep78
蛋白调节复制能力的具体区域，以及具体的生化特
性，以及 Y224 影响 Rep 蛋白寡聚化详细机理。对
Rep 蛋白的深入研究有助于 AAV 的探究，可以促进
rAAV 介导的基因治疗的发展［43，44］，其意义深远。
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（责任编辑 狄艳红）