全 文 ：·综述与专论· 2011年第12期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
AAV 衣壳蛋白基因工程的修饰研究进展
连文昌1,2 许佳佳1,2 李招发1,2
（1华侨大学分子药物学研究所，泉州 362021;2分子药物学教育部工程中心，泉州 362021）
摘 要 : 腺相关病毒（AAV）作为载体进行基因治疗已经越来越受人们的青睐，其安全性在帕金森病、囊性纤维病和视网膜
疾病等单基因突变疾病临床治疗中得到证明。利用 AAV 载体进行临床治疗的应用在逐渐增多，提高 AAV 靶向性和转染效率是人
们期盼解决的一道难题。而目前对 AAV 衣壳蛋白基因工程的修饰，可以明显提高其转导效率和靶向性，一定程度上扫除了其广泛
应用 AAV 的障碍。阐述重组 AAV（rAAV）衣壳蛋白在基因工程修饰方面的研究进展及其对基因治疗应用前景的综述。
关键词 : AAV 衣壳蛋白 基因工程 修饰
Modify AAV Capsid Protein Via Genetic Engineering
Lian Wenchang1,2 Xu Jiajia1,2 Li Zhaofa1,2
（1Institute of Molecular Medicine, Huaqiao University ,Quanzhou 362021;2Molecular Medicine Engineering Research Center
of the Ministry of Education, Huaqiao University , Quanzhou 362021）
Abstract: Adeno-associated virus becomes more and more prevalent as gene therapy vector. The safety was proved in clinical care of
Parkinsons disease, cystic fibrosis, diseases of retina and so on single-gene diseases. Utilizing AAV vector to clinical care being increasingly.
It is a challenge that increases AAVs target and transduction. And nowadays modified the AAV capsid protein by genetic engineering can
significantly improve the transduction efficiency and targeting. In a certain way to solve the widespread of AAV vector. This review presents the
progress of modifying the AAV capsid protein by genetic engineering and this technique is put into use for gene therapy.
Key words: AAV Capsid protein Genetic engineering Modified
收稿日期 ：2011-06-30
基金项目 ：福建省自然科学金项目（2010J01207），福建省发改委课题资助项目（2008 第 3 批 26 号）
作者简介 ：连文昌，男，硕士研究生，研究方向 ：基因治疗；E-mail：lwc053811527@hqu.edu.cn
通讯作者 ：李招发，男 , 博士，副研究员，研究方向：基因工程 , 生物医学工程；E-mail: lizhaofa@hqu.edu.cn
腺 相 关 病 毒（adeno-associated virus, AAV） 是
一种属于细小病毒家族，无包膜，单链的 DNA 病
毒。整个基因组长约 4.7 kb。依据 AAV 反向末端重
复序列（ITR），AAV 能进行病毒基因组的复制及
其定点整合。ITR 是病毒基因组中唯一的顺式作用
元件。在病毒基因组的上下游中分别有一个开放性
阅读框（ORF）。这两个 ORF 分别编码不同的蛋白，
左边的 ORF 编码 AAV 复制和包装过程中所需要的
非 结 构 蛋 白 质， 分 别 为 Rep78、Rep68、Rep52 和
Rep40 ；右侧的 ORF 主要作用于编码结构蛋白 VP1、
VP2 和 VP3（图 1）。目前，AAV 是进行基因治疗
比较普遍的载体 , 其具有自然缺陷和无致病性特点。
在有辅助病毒诸如腺病毒、疱疹病毒、牛痘病毒或
者基因毒条件下，AAV 能复制产生子代病毒颗粒；
在缺少辅助病毒的情况下，AAV 能整合其基因组到
人 19 号染色体的一个特别位点，并保持整合态直
到随后的辅助病毒将其从潜伏状态拯救出来［1］。最
近，Mengxin 等［2］利用在 AAV2 衣壳蛋白进行点突
变纤维母细胞和间叶细胞的干细胞转导，有很高的
效率。之前也有许多人对衣壳蛋白衣壳进行改造来
优化 AAV。近年对于衣壳基因工程修饰的手段的研
究也越来越多。
AAV 衣壳由 P40 启动子启动右侧的 ORF 阅读
框，编码 AAV 3 种结构蛋白。由于编码 3 种结构蛋
白时是同一 mRNA，由不同起始密码子编码的，因
此，VP1、VP2 及 VP3 三种蛋白拥有相同的 C-末端，
却有不同的 N- 末端。AAV 的衣壳是包装其基因组
的元件，同时也是 AAV 侵入细胞之前与宿主表面
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结合的作用支撑点。另外，它也是宿主对侵入 AAV
进行免疫反应的作用部位。AAV 能否有效地进入
宿主细胞或组织很大程度依赖衣壳与宿主表面，宿
主内部免疫反应作用的大小决定。依据暴露在衣壳
表面不同的氨基酸残基和与各种受体的结合位点的
不同，适时地改变它们的结合程度或结合方式对于
提高 AAV 在基因治疗方法上有很好的作用。因此，
我们可以通过基因工程改变 AAV 衣壳蛋白，从而
对其感染性和转导效率进行一定的改变。
1 AAV 衣壳蛋白氨基酸的定点突变
依据 AAV 在感染过程中所需要的受体结合作
点的不同，对于 AAV 衣壳表面分布的不同的受体
结合位点，对其进行点突变可以了解对于涉及 AAV
感染过程中一系列与其相互关系的作用。例如，
AAV 与细胞表面结合过程，细胞内的运输，核定位
和脱壳等。在这些过程中涉及到衣壳蛋白与受体之
间的相互作用的位点就是我们重点研究的位点。
1.1 衣壳表面氨基酸突变
在早期的研究过程中，主要是研究 AAV 的空间
构象组成等［3］。但近几年的研究倾向于 AAV 在复
制过程中暴露在衣壳表面与受体结合的研究。在
Zhong 等［4］的研究中，对于 AAV 暴露在衣壳表面
并且有泛素化影响的 7 个 Tyr 残基进行突变，研究
显示受体结合位点的主要氨基酸是酪氨酸。酪氨酸
在与受体结合过程中还有泛素化的过程参与其中。
研究结果表明，突变体在体外的细胞如 Hela 细胞
相对于没有突变的 AAV，转导效率可提高近 10 倍。
他们通过对小鼠体内的肝细胞比较发现，用少剂量
突变体转导，转导效率比等量未突变 AAV 的转导
效率提高近 30 倍。Zhong［5］之前的研究表明，之所
以会出现这样的情况，是因为表皮生长因子受体酪
氨酸激酶（EGFR-PTK）信号通路的激活会使 AAV
衣壳的酪氨酸残基发生磷酸化。磷酸化后的衣壳结
构保持完整，而且进入细胞的效率和未磷酸化的比
较并没有什么变化，但在细胞内的转导效率明显比
没有磷酸化的病毒低。这说明，有酪氨酸存在的情
况下，细胞内的蛋白酶体对有磷酸化的衣壳进行泛
素化，导致转导效率的下降。因此，对 AAV 衣壳酪
氨酸突变，可以避免泛素化的过程，从而提高病毒
在细胞内的转导效率。
1.2 不同受体类型点突变
以上突变是对 AAV 在细胞内转运过程突变的
研究，Michael［6］等将 AAV 衣壳表面与肝素结合的
丙氨酸位点突变进行了 AAV 衣壳表面与受体结合的
研究。作者对 AAV 衣壳表面与抗体相连接的 64 个
丙氨酸位点进行了突变研究，包括对单个氨基酸突
变，多个氨基酸突变，以及插入型突变等 127 个突
变。从单个氨基酸突变的结果中可知，不同 AAV 类
型的衣壳蛋白的空间结构和基因序列不同。这使不
同的 AAV 类型与细胞表面的受体以及对细胞的感染
难易程度都有很大差别［7］。AAV2 和 AAV3 的受体
主要是硫酸肝素蛋白多糖（HSPG）; AAV1、AAV5
和 AAV6 的受体是唾液酸，是通过 N-连接键连接
的 ；AAV4 的受体也是唾液酸，但与前者不同的是
它通过 O- 连接键相互连接。AAV8 的受体是 LamR,
其是一种层粘连蛋白受体。对于 AAV7、9、10、11
和 12 的受体目前还未研究清楚。因此，可以利用点
突变进行受体位点的整合。AAV2 和 3 型与肝素结
合位点主要残基为 Tyr。AAV1、5 和 6 型唾液酸受
体是 Lyr 残基。AAV8 和 AAV4 是区域结合，结合
位点的具体氨基酸残基无相关报道，但可以知道其
相关的结合区域。AAV8 受体结合区域在于 VP1 上
491-547 残基和 593-623 残基。AAV4 是与 α2-3 O-
连接键结合。但在之前提高的 100 多个位点突变过
程中发现，并不是所有的突变都会改变其特性。因此，
可以利用这些不改变特性突变位点，加入或制造出
能特异性结合其他受体结合类型的区域。如 AAV2
和 3 型中，在不改变特性的突变位点中替换成 Lyr。
这样，既能通过肝素识别，又能通过唾液酸识别，
ITR ITR
Rep
Cap
VP3
VP2
VP1
P40
5 3
图 1 CAP 基因在 AAV 基因组中的结构
连文昌等 ：AAV 衣壳蛋白基因工程的修饰研究进展
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011年第12期24
改善 AAV 对受体识别的单一性。
1.3 突变转导效率的影响
目前对于 AAV 衣壳表面位点进行点突变的研
究集中于 AAV2 型［8-11］，并对 2 型点突变的后续研
究对象进行了多种不同的试验。例如，Markusic 和
Petrs-Silva 等［9 , 10］对 AAV2 型酪氨酸的点突变进行
老鼠视网膜转导 , 发现突变之后，相比较于野生型
的 AAV2，其更有转导的优势。但同时 Jarrod 等［11］
的研究却得到相反的结果。研究者对 AAV2 衣壳蛋
白的 VP3 开始之前的一段碱基 BR3 中进行丙氨酸突
变，替换成赖氨酸（图 2）。对突变体 BR3+K 转导
到 Hela,HEK-293 等细胞和鼠的肝、脑和肌肉等组织
中发现，这样的突变相对于未突变的 rAAV2 来说，
突变体的转导率不但不会增高，反而会降低。这就
说明，不是所有位点突变都可以增加转导率。由此
可知，目前对于点突变的研究还没有一个统一的定
论。虽然，突变受体结合位点氨基酸残基的改变能
影响转导效率，也只是改变残基类型，但能提高转
染效率的突变暂时没有分类。如突变成碱性氨基酸，
酸性氨基酸或中性氨基酸残基会发生何种情况，都
会提高或者产生何种效果等。
表达有作用还未进行系统、深入的研究。而且，点
突变的氨基酸选择范围很大，一个氨基酸位点可以
突变成常见的氨基酸就有 20 多种。这就给利用点突
变对衣壳蛋白进行修饰造成了很大困难。但目前拥
有的高通量技术水平为衣壳蛋白基因工程点突变修
饰创造了很好的平台。
2 人工插入碱基改造衣壳蛋白基因的修饰
今天，AAV 被广泛应用于单基因遗传疾病治疗
的研究，甚至被人们寄予治疗肿瘤疾病的厚望。硫
酸乙酰肝素蛋白聚糖（heparan sulfate proteoglycan，
HSPG）是 AAV2 的主要受体，其在多种组织和细胞
种类中都有表达。这样给利用 AAV 载体作为肿瘤靶
向治疗的方式出了一个难题。而且，虽说 AAV 载体
在组织或细胞中的内源性免疫反应很低，但载体始
终还会在肝脏和脾脏等组织中积累［13］，这对 AAV
系统治疗器官疾病很不适合。因此，一个有效的策
略是通过修改 AAV 衣壳构建自身人们所需的具有靶
向受体或组织特异性趋性的重组 AAV（rAAV）载
体。在 WT-AAV 中，自身有 HSPG 受体结合位点，
能进入宿主。因此，可以插入所要求具有特异性靶
向配体或具有区别于自身配体的一些新的更广的配
体基因。
2.1 插入型突变种类
在 Yang 等［14］的研究中 , 首次进行了在 AAV2
载体中的 VP2 衣壳内插入了抗人 CD34 单链抗体可
变区的 sFv 序列。通过 AAV 载体的表达之后，发现
插入后的突变体改善了因缺乏 AAV2 受体而感染率
低的 CD34 阳性造血干细胞对 AAV 的感染性。通过
这个试验验证了在 AAV 衣壳插入所需受体或配体的
方法可行。紧接着，Anne 等［15］通过对犬科的细小
病毒三维结构的比较推断，AAV 衣壳蛋白有 6 个不
同的茎环结构可以插入所需的具有靶向的配体（分
别在 261、381、447、534、573 和 587 氨基酸位置）。
Anne 等插入一个可结合许多细胞整合素的 14 个氨
基酸肽段的 L14 配体。试验结果证实，用这种方式
构建的 rAAV 和 WT-AAV 有相近的包装效率。而且，
在 587 位点插入突变的 rAAV 在表达 L14 特异整合
素受体肿瘤细胞中能进行高效的转染表达。Wu 等［16］
研究了 7 个不同位点的插入突变（分别在 1、34、
图 2 BR3 在 AAV2 中 VP1 基因上位置示意图
HDVP1
PLA2 BR3 受体结合区域
VP2
VP3
+ +
+
+
+
1.4 AAV2之外的点突变
也有人研究 AAV2 以外其他类型点突变。例如，
Qiao 等［12］对 AAV6 暴露于衣壳蛋白表面的酪氨酸
进行点突变，酪氨酸突变成苯丙氨酸（即 Y-F 突变）。
研 究 发 现 Y445F、Y731F 突 变 之 后 的 6 型 AAV 对
骨骼肌的转导会增强。而在 Petrs-Silva 等［9］ 在对
AAV2 突变研究的同时，还进行了 AAV8 的 Y730F、
Y733F 和 AAV9 的 Y446F 突变。研究发现视网膜下
注射的 AAV 转导率也会有所提高。
总之，目前对于 AAV 点突变的研究还限于初
始的阶段，主要集中在 AAV 暴露于衣壳蛋白外面与
受体结合部位的氨基酸进行突变。其余的点突变类
型只限于凌乱的突变研究。对何位点突变是肯定有
效，哪些位点是突变之后在不同的组织或细胞转录
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138、226、447、519 和 664 氨基酸位点）。结果证明，
这些位置中的大部分都能导致 AAV 部分缺陷。但是
在 1 和 138 位（VP1 和 VP2 的 N-末端位置）插入丝
氨酸蛋白酶抑制剂配体能使 AAV 的趋向性改变。而
且对于 IB3 细胞的转染率也比 WT-AAV 提高大约 15
倍。他们还预测在 509-522 和 561-591 位置可能是
肝素结合簇暴露于衣壳表面的位置。Shi 等［17］进行
25 个插入突变的研究，结果得出 5 个比未插入突变
载体的转染率更有优势的插入型载体。其插入的位
置分别是 139、161、459、584 和 587。他们插入了
促黄体激素配体（luteinizing hormone receptor, LH-R）
大约 15 个氨基酸大小的肽段。而且证明，在没有表
达肝素受体的卵巢癌细胞 OVCAR-3 中利用插入型
AAV 转导发现能对其进行转导。rAAV 载体转导的
LH-R 水平与用黄体酮刺激 OVCAR-3 表达 LH-R 水
平相比较发现，载体转导水平比激素黄体酮刺激表
达的水平高。这证明，当插入 LH-R 到无法表达肝
素结合受体的细胞中，载体能有效的靶向细胞，并
且能高效表达插入的外源基因。这些试验充分说明，
在 AAV 衣壳蛋白内插入配体基因的办法可行，且效
果好，也验证了很多位点可以作为插入型 AAV 突变
的位点。
2.2 插入基因大小研究
试验证明直接插入一些小配体基因的办法是可
行的。但是对于插入外源配体基因多大是可允许的，
Warrington Jr 等［18］分别在 VP1 和 VP2 重叠序列 138
位点插入 3 种不同长度肽段序列，即 8 kD 的小鼠趋
化因子连接区域序列（CX3CL1），18 kD 人荷尔蒙
瘦素肽段序列和 30 kD 的绿色荧光蛋白序列。其发
明了一种外源基因插入到 AAV 衣壳蛋白基因中的
方法。这种方法最大能插入 30 kD 的肽段序列，而
且对病毒的富集或侵染影响都很小。他们还发现，
在 138 位残基后面区域不适合插入肽段的原因是由
于 VP3 缺损而导致病毒颗粒不够形成，VP2 衣壳蛋
白并不是病毒侵染所必须的元件。因此，在 VP1 和
VP2 重叠位置可作为插入位点的最佳区域。Boueas
等［19］进一步研究表明，在最常暴露于衣壳表面能
靶向受体的 AAV2 衣壳蛋白氨基酸的 587 和 588 位
置可以插入肽段序列，而且最大能插入的肽段氨基
酸序列长至 34 个氨基酸残基。同时，第 453 位点也
能作为新的插入突变位点。
2.3 AAV2型外的插入突变
通过对衣壳插入外源配体基因 sFv 序列，L14
配体序列，丝氨酸蛋白酶抑制剂配体序列，LH-R
序列，CX3CL1 序列，人荷尔蒙瘦素肽段序列，绿
色 荧 光 蛋 白 序 列，RGD-4C 肽 段 基 因［20］， 以 及
THALWHT 配体序列［21］等配体的研究，发现其中
最适合插入的位置是经多人研究的第 138 和 587 位
点，插入肽段的大小都是在 34 kD 以下的一些肽段。
其他位置的插入因影响 AAV 病毒本身肝素结合受体
功能和病毒自身的复制和侵染等原因未被人们深入
研究。而除了 AAV2 之外的其他类型的 AAV，由于
研究插入型突变范围较广、难度大而未见太多报道。
所以，目前插入型突变的研究主要集中于 AAV2。
3 衣壳基因缺失的研究
McCarty 等［22］ 首 次 构 建 出 自 我 补 偿 型 AAV
（self-complementary AAV, scAAV）， 发 现 去 除 AAV
双侧 ITR 中的任一 D 序列，能形成双链互补基因组
的 scAAV。随后 Buie 等［23］研究发现，scAAV 能很
好的转导和表达肝脏等器官的基因。但对于 AAV 衣
壳的其他缺失修饰鲜有人研究。直到 2010 年，Hida
等［24］第一次专门对 AAV5 衣壳基因缺失进行研究。
其利用 DNase I 对 AAV5 衣壳基因特定区域进行缺
失或串联重复突变，成功构建了 9 个突变体。最大
缺失 119 个碱基序列，其余大部分都是 4-27 碱基的
缺失。随后研究发现，只有 4 个缺失突变体或串联
重复突变体有作用。其中 3 个能跟 WT-AAV 一样进
行颗粒包装，另外一个在 293T 和 BEAS-2B 细胞中
病毒的转导有增强的现象。但他们研究的最终目的
是为了找出在衣壳蛋白基因中哪些位点是可以作用
配体基因插入的位点，并不是利用缺失来修饰衣壳
蛋白。因此，到目前为止，对于衣壳基因哪些碱基
缺失是可增加转导、降低免疫的，哪些位点缺失是
对衣壳蛋白进行修饰的等方面的研究还很少。
4 AAV 衣壳蛋白基因工程修饰应用前景
通过对 AAV 衣壳进行点突变，可以得到转导
率相对较高的 rAAV 类型。而进行插入型突变，可
以提高 rAAV 对不同组织和细胞靶向性的专一度及
连文昌等 ：AAV 衣壳蛋白基因工程的修饰研究进展
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011年第12期26
范围。但对于缺失的研究还有待于进一步研究。如
哪些缺失是可减少 AAV 自身基因组大小、增加外源
基因插入的长度但对载体本身又是优化的缺失。通
过对 AAV 衣壳蛋白基因修饰的这 3 个方面突破性研
究，相信 AAV 作用基因治疗的载体会越来越受人们
的关注。而且近几年来， rAAV 基因药物在临床试验
上使用的良好治疗效果及其安全性使人们对 rAAV
基因药物的研究和开发充满信心［25-27］，基因治疗肿
瘤之路也会越走越宽。
参 考 文 献
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（责任编辑 狄艳红）
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