全 文 ：生物技术通报
研 究报告 刀了口r E Cj 孙心 L O G Y B U L L E TJ 份 2心洲为 年增刊
抗溶葡萄球菌酶 N 端合成多肤抗体的制备与鉴定
吴宏宇 ,2 黄晋江 张继恩 黄青山 ,3
,上海高科联合生物技术研发有限公司, 上海 201 2肠;2上海交通大学生命科学技术学院 , 上 海 2(X) 240 ;, 复旦大学生命科学学院遗传
学研究所遗传工程国家重点实验室 , 上海 2(X 抖33)
摘 共 : 为了制备扰溶荀萄球菌醉 N 端合成多肤杭体 ,合成了溶荀萄球菌璐(l 山phin )分子的 3一13 位的 1 个获基改
的多胶(T H卫H sA Q w LN ),并利用戊二醛双功能试剂将人工合成多肤成功地与毗H 进行揭联 ,免疫新西兰兔制备抗 l卿 pn
合成多肤的扰体 ,并经亲和层析进行了纯化 对此抗体进行鉴定的结果表明,抗浓荀萄球菌璐合成多肤杭体可与重组溶荀萄球
菌膝分子发生特异性反应 ,并可用于蛋白免疫印迹 该杭体的制备为使用亲和层析纯化溶荀萄球菌踌提供了有用的配基
关妞词: 溶蔺萄球蔺醉 杭原性多肤 多克隆杭体 踌联免疫吸附测定法 蛋白免疫印迹
P re P a ra ti o n a nd Id en t饭份tion of A nti 一lyso sta P hi n N te rm in a l
A nti ge 城 c PePtide A nti body
W u H on阶旧, ,2 H uang Jinj lan g Z han g Jien, H uan g Q in 乡halll,
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八七引 raCt : To Prepar e an ti一卜ostaP hin N terT 的alanti子ni e pep泛山 anti bo御 , : 11 A pepdde (T HE H SA Q w LN ) of 脚 staP hin
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K ey WO 川s: L脚 staP hi n An ti犷ni c pePtide Po ly cfo 初 an tibody ELIsA W o em B lot
溶葡萄球菌酶(幼叻吕扭phin )来源于 S切phy奴 oc -
cus .slm u肠旧, , 可以裂解葡萄球菌细胞壁肤聚糖的
甘氮酞五肤 键 .使得细菌溶胀裂解死亡 .2] ,成为
治疗葡萄球菌属细菌引发感染的候选药物 国内上
海高科联合生物技术研发有限公司申报的重组溶
荀萄球菌酶已经取得国家食品药品监督管理局的
治疗用第 1 类生物制品临床试验批文 (批件号
20 5功3% l) , 目前正在进行临床试验 为了满足
SFD A 对药物品质的要求和进行溶葡球菌酶结构方
面的研究的需要 ,尽可能提高溶葡球菌酶的纯度十
分必要
为获得高纯度的重组溶葡萄球菌酶以达到药
用标准 ,我们曾构建了一种以重组溶葡萄球菌酶单
克隆抗体为配体的亲和层析纯化方法l3] 但是在实
验中我们发现以溶葡萄球菌酶直接免疫制备单克
隆抗体 ,以该抗体偶联制备的亲和介质进行纯化时
无法达到较高的纯度 有文献l]报道溶葡萄球菌醉
是由 N 端开始降解的 ,而我们制备的单克隆抗体可
能是针对溶葡萄球菌酶中间部分或者是 C 端的抗
原决定簇的 ,导致纯化过程中具有相应抗原决定簇
的降解片段也可以与抗体结合 ,影响了纯度
本研究通过对溶葡萄球菌酶的抗原性分析 ,利
收稿 日期 :2以玲一03 一17
作者简介 :吴宏宇 (l 97 8一) ,男 ,工程硕士生 ,主要从事分子免疫学和生物信息学研究;E川加三1冶吐困n扣@sj tu. 曰u.cn
通讯作者:黄青山;E一m 1:砂 uan 砰响dan ,ed u. cn
2以为 年 增 刊 吴宏宇等:抗溶葡萄球菌酶 N 端合成多肤抗体的制备与鉴定 353
用 N 端表位多肤与 K LH 的偶联蛋白作为抗原进行
免疫 , 制备出了抗溶葡萄球菌酶 N 端表位多肤的
抗体 , EU SA 和 W es te m Bl ot 检测显示与溶葡萄球
菌酶重组蛋白具有特异性反应 该抗体的制备为进
行溶葡萄球菌酶亲和层析纯化提供了有用的工具
1 材料与方法
1.1 仪 器和试剂
R oneer 多肤合成仪购自 A pplied Syste m 公司 ;
A KTA ex plore r HI Tra p Pro te in A 亲和层析预装柱 ,
购 自Ph ~ ac ia 公司 ;96 孔酶标板购 自美国 Bec ton
D ickinso n L山 w are Euro pe 公司 ;550 型酶标仪 , B IO -
R AD 公 司
溶葡萄球菌酶 N 端 (3一13 位 ) 抗原性多肚
(TH EH SA QW LN )由上海高科联合生物技术研发有
限公司多肤合成部提供 ;K LH ,完全福氏佐剂 ,购自
Si gm a 公司 ;H RP 一羊抗兔 I西 , 购 自华美生物工程
公司 ;邻苯二胺 (O PD ) ,购自中国医药集团上海化
学试剂公司 其他试剂均为国产分析纯或生化试
剂
健康新西兰白兔 ,雄性 , 2 只 , 2.3一2.skg ,第二
军医大学实验动物室提供 动物购买后饲养 7 天用
于实验 ,环境温度(20土3) ,相对湿度为 50 % 一65 % ,
开灯 12 h ,黑暗 12 h , 自由进食和饮水
1.2 杭原肤的设计与合成
应用 A nth eP Io t 2 Xx151对溶葡萄球菌酶蛋白进
行抗原性 ,疏水性 ,溶液接触性性等分析 ,发现溶葡
萄球菌酶蛋白的 3一13 位的 n 个氨基酸具有较好
的抗原性和溶液接触性 , Bl as t方法检测此序列的
特异性 ,未发现相似序列 ,二级结构分析预测其为
一段螺旋结构 ,决定选用此段多肤作为抗原多肤
选定的抗原多肤在全自动多肚合成仪上由固
定赦基向氨基端递增合成后获得粗品 粗品溶于
0.1% 三氟乙酸 , 经过孔径为 0.2 林m 的滤膜过滤
后 ,用 C 18 反向柱进行分离纯化 ,收集洗脱峰 ,冷冻
干燥 最后将纯化后的合成肤加人 SO U RC E SR PC
ST4 .61 巧0 色谱柱进行 H PLC 分析以鉴定其纯度
1.3 合成 多肤与载体的偶联
取 K出 s m g 与 Z m g 多 肤 溶 解 到 5(X) 林l
0.lm ol/1 PB S (pH 7.4 )中 ,冰浴中边振荡边加新鲜配
制的 0. 3% (V /V ) 戊二醛溶 液 lml , 使终浓度 为
0. 2% , 然后室温作用 Z h , 倒转试管数次 , 加 1
m m ol lL 甘氨酸 ,以封闭未反应的戊二醛 ,继续反应
30 m in 最后以 0.01 m ollL pH 7.0 PBS 液 4 充分
透析除去过量的戊二醛 ,一20 保存备用
1.4 杭 多肤抗体的制备
取新西兰白兔 ,标记 l# 2# 将 2.0 m g 偶联蛋
白原用 2. om l 磷酸缓冲盐溶液(PBS 缓冲液 )溶解 ,
与 2. om l福氏完全佐剂按 1:1 比例混合均匀 , 用注
射器反复抽吸制成乳剂 ,按照常规方法于背部皮下
多点注射进行初次免疫 ,每只兔子注射约 1.7ml 3
周后进行第 1次加强免疫 , 免疫抗原的浓度同前 ,
每只兔子皮下注射 1.5耐 第 1 次加强免疫 2 周后
进行第 2 次加强免疫 ,每只兔子注射 1.Oml ,免疫抗
原的浓度同前 第 2 次加强免疫前取静脉血 1.oml ,
分离血清 ,用 EU SA 法测定兔血清抗合成多肤的效
价 第 2 次加强免疫 Zw 后 ,用生理盐水配制免疫抗
原使成 1.0 m g/nil 浓度 , 兔耳静脉注射 1.0 m l只 ,
进行第 3 次加强免疫 同时取静脉血 1.oml .分离血
清 ,测定兔血清抗合成多肤的效价 第 3 次加强免
疫 lw 后 ,颈动脉放血 ,收集血清 ,一20 冻存
1.5 亲和层析纯化多肤抗体
收集的兔抗血清静过离心和微滤后 ,采用 Hi -
Trap 而 te in A 亲和层析柱进行纯化 将 5. o ml 的
H ITra p 阮 tein A 亲和层析预装柱 ,与 A KTA explor-
er系统相连接 , 用 0.lm ol lL Tri s一H a 缓冲液 (含
0.15 m ol/L N aCI, pH 7.5) 充分洗涤平衡后上样 ,以
相同缓冲液洗去未结合的杂蛋白质后 ,用 0.lm ol /L
G ly一H C I缓冲液(含 0.15 mo l/L NaCI, pH 2.8)洗脱 ,
收集洗脱峰 , 并用 pH 7. 5 的 Tri s一H cl 缓冲液中和
后 ,冻干备用 用 SD S一PA G E 分析多抗的纯度
1.6 抗 体 EU S A 检 侧
以 0.2卜g/m l重组溶葡萄球菌酶为包被抗原 ,间
接 E U SA 方法分别检测三次兔耳静脉取样血清中
抗体的效价
1 .7 W estern B lot
重组溶葡萄球菌酶经 SD S一PA G E , 转移 PV DF
膜 ,浸人质量浓度 (g/m l)1% 牛血清白蛋白(稀释液
TBS一T 缓冲液 , 含 0.05 % Tw een 20 ) , 室温封闭 l
354 性物技术透稚刀勿. 几加城盯 2(X 为 年 增 刊
h ,用 TB S一T 洗 2 次 抗体用 TB s一T 稀释到 1此/耐 ,
取 5耐 加到小玻璃皿内 ,铺上 PV D F 膜 ,室温下作
用 l h 转移膜经洗涤后 , 加人稀释的辣根过氧化
物酶标二抗 12耐 , 室温作用 lh 重复上述清洗步
骤 加人 E CL 试剂盒增强液与氧化剂混合 ,加到转
移膜上作用 1 m in ,放射 自显影
2 结果
2.1 杭原肤的设计与合成
应用 A nth eP ro t 20( X) 对溶葡萄球菌酶进行抗原
性 ,疏水性 ,溶液接触性等性质分析 ,发现溶葡萄球
菌酶蛋白的 3一13 位的 1 个氨基酸具有较好的抗
原性和溶液接触性 , 是理想的抗原表位 序列为
TH EH sA Q w LN , 二级结构分析预测其为一段螺旋
结构
H PLC 对合成多肤进行纯度分析 ,结果见图 l
除上样峰外 ,样品呈单一峰且只有轻微波动 ,纯度
分析接近 o %
2. 3 多肤抗体的纯化
抗血清经 po te in A 亲和层析纯化后 , SD S-
以 GE 电泳的结果如图 3 所示 ,抗体纯度达到 90 %
以上
圈 3 纯化抗体的电泳圈
M : p魄 in n坦ker ; l : 即石l联 ly of # lrab b it; 2 : an ti l洲xly of #2 仆山b i
卜. { }L _ _ 斗_ _ __, _ _
} } :
奋
2. 4 多肤抗体特异性的鉴定
We ste m Bl ot 结果如图 4 所示 , 抗体的特异性
非常明显 ,与我们先前制备的单克隆抗体的特异性
相当 而且蛋白印迹结果可以看到抗溶葡萄球菌酶
N 端合成多肚抗体结果的杂条带明显的少于我们
先前制备的单克隆抗体 ,用此抗体作为配基纯化溶
葡萄球菌酶可以避免与 N 端降解的溶葡萄球菌酶
片断结合 ,提高溶葡萄球菌酶的纯度
一4.砖
. 璐
咭Jl竹吸份成民目.自n寸幼 t.t叭月.户创夕,
田 1 纯化的抗原肚 H p LC 层析圈讲
2. 2 多肤杭体的制备与效价
用间接 EU SA 方法抗体测定兔抗血清的效价
血清样本分别在初次免疫后第 3 , 5 , 7 周时取得
M : P以 e in
圈 4 W 6St6m BI ot 检侧
m 业 er : l: an ti 一ly明 ta P卜 in monc lonal an ti伙d y: 2 : 即 石-
N t~ nal an ti genie pe pti de an tilx喊ly (初th 以汀)
君舀.愁口他乞牙
N 时 , .. 脚
圈2 三次取样的抗体效价圈 3 讨论重组溶葡萄球菌酶的纯化研究工作我们已经
2仪为 年 增 刊 吴宏宇等:抗溶葡萄球菌酶 N 端合成多肤抗体的制备与鉴定 355
进行了 10 多年的研究 , 最近为获得高纯度的重组
溶葡萄球菌酶以达到药用标准 ,我们曾构建了一种
以重组溶葡萄球菌酶单克隆抗体为配体的亲和层
析纯化方法 但是在实验中我们发现以溶葡萄球菌
酶直接免疫制备单克隆抗体 ,以该抗体偶联制备的
亲和介质进行纯化时无法达到较高的纯度 有文献
报道溶葡萄球菌酶是由 N 端开始降解的 , 而我们
制备的单克隆抗体可能是针对溶葡萄球菌酶中间
部分或者是 C 端得抗原决定簇的 ,导致纯化过程中
具有相应抗原决定簇的降解片段也可以与抗体结
合 ,影响了纯度 初始我们准备构建融合蛋白(仅包
含溶葡萄球菌酶 N 端的一个抗原决定簇 ) 制备单
克隆抗体 ,用这种单克隆抗体制备的亲和介质来纯
化可避免降解片段的结合 ,从而获得更高纯度的溶
葡萄球菌酶 但是融合蛋白的构建 ,表达和纯化过
程比较复杂 ,耗时 ,而多肚制备抗体作为快速制备
抗体技术的一种 ,通过对抗原或者抗原表位的快速
合成然后直接或者偶联一个大分子蛋白后去免疫
动物从而获得抗体 ,制备流程简单可控
抗多肤抗体制备技术的关键就是抗原表位肤
的设计和蛋白偶联技术 氨基酸序列的亲水性 表
露性 柔韧性决定了多肤的抗原性 早前的抗原表
位的选择主要就是依据这些基本原则进行人工选
择的 ,对于短序列还比较容易 ,但是对于大蛋白进
行人工表位分析就比较困难了 现代生物信息学提
供了一种简单 ,快速的方法 ,即用计算机软件预测
抗原表位 赵明辉等16在抗 Re si sti n 合成多肤抗休
的制备及鉴定研究中使用 A ni heP m t进行抗原设
计 ,周厚德等17 在 SPLU N C I 多肤抗体的设计与制备
研究中使用 D S G EN E I.1 基因分析软件进行抗原
肤设计 本研究在参照文献运用 A nth eP ro t Z以刃对
溶葡萄球菌酶进行抗原性分析 ,选择亲水性和暴露
性好的多肤作为抗原多肤 关于蛋白偶联方法的选
择 ,赵丽等[8] 曾在对 4 段牛 PrP 合成肤段的抗原性
研究中比较了 M B S,戊二醛两种偶联方法 ,结果显
示所产生的抗体效价无显著性差异 ,仅有一个合成
肤段的戊二醛偶联产生的抗体效价明显高于 M BS
偶联产生的抗体效价 本研究中就直接选用了戊二
醛偶联方法 ,结果表明戊二醛偶联方法产生的抗体
效价达到 T 105 El SA 和 W estern Blot实验证明此
抗体特异性与我们先前制备的溶葡萄球菌酶抗体
的特异性一样 抗溶葡萄球菌酶 N 端合成多肤抗
体的制备为使用亲和层析纯化溶葡萄球菌酶提供
了有用的配基 使用这种抗体进行溶葡萄球菌酶亲
和层析纯化的工作我们正在进行中
, 考文献
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