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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(7):54-58
收稿日期 ：2015-11-10
基金项目 ：国家科技重大专项（2008ZX09101-032），上海市博士后科研资助计划（14R21421300）
作者简介 ：许燕，女，硕士，研究方向 ：抗感染药物 ；E-mail ：xuyan131@163.com
通讯作者 ：陆海荣，男，博士，研究方向 ：抗感染药物 ；E-mail ：haironglu09@fudan.edu.cn
黄青山，男，博士，副教授，研究方向 ：抗感染和抗肿瘤药物 ；E-mail ：qshuang@fudan.edu.cn
重组溶葡萄球菌酶成品蛋白含量测定方法的建立
许燕1，2  张宜涛2  叶贵子2  陆海荣1  黄青山1，2
（1. 复旦大学生命科学院遗传学研究所，上海 200433 ；2. 昆山博青生物科技有限公司，昆山 215316）
摘 要 ： 重组溶葡萄球菌酶（recombinant lysostaphin，rLysn）对金黄色葡萄球菌具有良好的抗菌活性，是一种新型抗菌药
物，含有该酶的药用制剂在临床上能有效控制金葡菌感染。为在 rLysn成品中增加蛋白含量测定以控制制剂的质量，建立了成品
中 rLysn蛋白含量测定方法，并进行验证。采用体积排阻高效液相色谱法（size exclusion high performance liquid chromatograph，SE-
HPLC）测定 rLysn理化对照品及成品蛋白质含量。色谱柱：TSK gel 2000SWXL（7.8 mm×30 cm，5 μm）；流动相：20 mmol/L磷酸
缓冲液（pH7.0）+0.3 mol/L NaCl ；流速：0.5 mL/min ；柱温：25℃ ；检测波长：280 nm。结果显示，rLysn在 2-32 μg范围内与峰
面积呈良好的线性关系（r2=1）；低、中、高 3种浓度的 rLysn理化对照品空白加标平均回收率为 102.9%，成品加标平均回收率为
102.1% ；3种不同上样量在不同时间内测定，蛋白含量 RSD<1% ；每隔 1 h测定同一支供试品溶液，蛋白含量 RSD为 0.98% ；同一
批供试品溶液取 6份进样，蛋白含量 RSD为 1.71%。实验结果表明，采用 SE-HPLC方法简便，准确性、精密度、稳定性及重复性好，
可用于 rLysn成品蛋白质含量的测定。
关键词 ： 重组溶葡萄球菌酶；蛋白质含量；体积排阻高效液相色谱法
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.008
Establishment of A Method for Determination of Protein Content in the
Final Product Containing Recombinant Lysostaphin
XU Yan1，2 ZHANG Yi-tao2 YE Gui-zi2 LU Hai-rong1 HUANG Qing-shan1，2
（1. Institute of Genetics，School of Life Sciences，Fudan University，Shanghai 200433 ；2. Kushan BioGreen Technology Co.，Ltd.，
Kunshan 215316）
Abstract: Recombinant lysostaphin（rLysn），duo to its solid antibacterial activity to Staphylococcal aureus，is novel antibacterial
medicine，and therapeutic agent containing this enzyme may efficiently control the infection of S. aureus. In order to control the quality of
pharmaceutical preparations with rLysn，a method of measuring the protein content in the final product with rLysn was established and verified.
Size exclusion high performance liquid chromatograph（SE-HPLC）was employed to measure the protein content in both physico-chemical
control and the final product with rLysn under the conditions as below ：a TSK gel 2000SWXL column（7.8 mm×30 cm，5 μm），the mobile
phase composed of phosphate buffer（20 mmol/L，pH7.0）and NaCl（0.3 mol/L），the flow rate was 0.5 mL/min，the temperature was 25℃，
and the detection wave length was 280 nm. As results，the rLysn（within 2-32 μg）was linearly correlated with the area of the elution peak（r2
=1）. The weighted average recovery rate for physico-chemical controls in 3 rLysn concentrations of low，medium and high was 102.9%，while
the weighted average recovery rate was 102.1%. Three supernatants were measured at different time，and RSD of protein content < 1% ；while
measurement was done for each supernatant in 1 h interval，RSD of the protein content was 0.98% ；and 6 samples from one targeted solution
were measured，RSD of the protein content was 1.71%. Above results reveal that SE-HPLC is simple and convenient，accurate，precise，
stable and repeatable approach，thus may be used for the determination of protein content in the final product of rLysn.
Key words: recombinant lysostaphin ；protein content ；size exclusion high performance liquid chromatography
2016,32(7) 55许燕等：重组溶葡萄球菌酶成品蛋白含量测定方法的建立
金黄色葡萄球菌是临床最常见的化脓性球菌，
是医院交叉感染的主要来源［1-3］。金葡菌感染能诱
发多种疾病，且容易引发大规模爆发性感染，尤其
是耐甲氧西林金葡菌（MRSA）的多药耐药性和交
叉耐药性给临床治疗带来极大的困难［4-11］。目前，
以万古霉素为代表的糖肽类抗生素是治疗 MRSA 感
染的首选用药。但是，近年来，由于万古霉素的应
用增加，陆续发现对万古霉素中介和耐药的金葡菌
（VISA 和 VRSA）［12-14］。因此，迫切需要开发与传
统抗生素作用模式不同的新型抗菌药物。
溶 葡 萄 球 菌 酶（lysostaphin，Lysn） 是 一 种 含
Zn2+ 的金属蛋白酶，具有肽链内切酶活性［15］，能特
异性地水解金葡菌细胞壁肽聚糖交联结构甘氨酸五
肽桥，从而产生破壁溶菌作用，具有极强的抗金葡
菌活性［16-18］。体外条件下 rLysn 清除金葡菌的作用
非常快，在≥ MIC 水平（约 0.03-0.125 μg/mL），对
受试菌通常 30 min 内可杀灭 90% 以上，2-4 h 可杀
灭 99.9% 以上［19］。对 MRSA 也有同样显著的体外
抗菌效果，并且优于糖肽类抗生素万古霉素［20-22］。
Lysn 对金葡菌具有的快速溶菌作用，使得其成为国
内外研发抗耐药金葡菌感染的热点［23-25］。目前国内
已经将重组溶葡萄球菌酶（recombinant lysostaphin，
rLysn）研制成药用制剂，用于治疗皮肤创面金葡菌
感染。
对 rLysn 成品中的蛋白含量测定，可以控制和
评价 rLysn 成品的质量。由于 rLysn 在制剂制备过程
中加入了人血白蛋白作为保护剂，常规的蛋白含量
测定方法不适合成品中蛋白含量的测定。目前采用
的 C18 柱反相高效液相色谱法测定 rLysn 成品蛋白
质含量［26］，但该法的分离效果不好，且洗脱程序
复杂。本实验采用体积排阻高效液相色谱法（size
exclusion-high performance liquid chromatography，SE-
HPLC），测定 rLysn 成品中的蛋白含量，旨在高效分
离 rLysn 和人血白蛋白，并简化实验流程，为提高
rLysn 成品质量标准奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品和标准品 rLysn 理化对照品（蛋白含量
为 619 μg/ 支，批号：20120202）、rLysn 成品（400 U/ 支，
批号 ：20120801）、不含 rLysn 的空白制剂（安慰剂，
批号 ：20120802），上海高科联合生物技术研发有限
公司制备。
1.1.2 主 要 试 剂 及 仪 器 Agilent 1260 HPLC 色 谱
仪，美国 Agilent 公司 ；色谱柱 ：TSK gel 2000SWXL
（7.8 mm×30 cm，5 μm）， 日 本 Tosoh 公 司 ；NaCl，
Na2HPO4·12H2O，NaH2PO4，分析纯，国药集团。
1.1.3 色谱条件 色谱柱 ：TSK gel 2000SWXL（7.8
mm×30 cm，5 μm）；流动相 ：20 mmol/L 磷酸缓冲
液（pH7.0）含 0.3 mol/L NaCl ；流速 ：0.5 mL/min ；
柱温 ：25℃ ；检测波长 ：280 nm。
1.2 方法
1.2.1 溶液的制备
1.2.1.1 对照品溶液 将 rLysn 理化对照品用超纯水
溶解并稀释制成 1 mg/mL 和 1.6 mg/mL 的溶液。
1.2.1.2 供试品溶液 取 rLysn 成品 1 支，用 1 mL
超纯水溶解。
1.2.2 方法的验证
1.2.2.1 线性分析 取 1 mg/mL 理化对照品溶液，
分别进样 2、4、8、16 和 32 μL，按此进样量各重复
进样 2 次，以进样量（μg）为横坐标，样品峰面积（S）
为纵坐标，绘制标准曲线，进行线性回归，计算相
关系数（r2）。
1.2.2.2 准确性验证 取 1.6 mg/mL 理化对照品溶液
将空白制剂和 rLysn 成品溶解并稀释至理化对照品
加标终浓度分别为 0、0.2、0.4 和 0.8 mg/mL，每一
浓度上样 20 μL。计算加标回收率。按照上述方法重
复测定 3 次。
1.2.2.3 精密度验证 用浓度为 1 mg/mL 的理化对照
品溶液，采用体积法进样，分别进样 4、8 和 16 μL，
得到低、中、高 3 种进样量（4、8 和 16 μg）的峰面积。
每一种进样量在不同工作日分别测定一次，计算每
一种进样量的峰面积的均值、标准差和 RSD。
1.2.3 稳定性 取同一份供试品溶液，每次上样 20
μL，每小时进样 1 次，共 6 次，计算 rLysn 峰面积
和 RSD。
1.2.4 重复性 取同一批供试品溶液 6 份，分别
进样 1 次，每次上样 20 μL，计算 rLysn 峰面积和
RSD。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.756
2 结果
2.1 SE-HPLC色谱分析
rLysn 理化对照品及 rLysn 成品的 SE-HPLC 色谱
图（图 1）显示，rLysn 和人血白蛋白的分离度大于
2.5，表明本色谱方法能够满足成品中各组分达到基
线分离。
平均回收率为 102.9%，表明该测定方法准确性高。
成品加标回收率结果见表 3，3 种浓度的加标回收
率分别为 105.8%、98.7% 和 101.8%，平均回收率为
102.1%，进一步表明该测定方法准确性高。
2.2.3 精密度 3 种不同上样量的 rLysn 理化对照品，
分别于不同试验日进行精密度试验。数据取自 3 次
标准曲线实验结果（表 4），RSD<1%，表明该方法
精密度高。
2.2.4 稳定性 取同一份供试品溶液，每小时进样
1 次，共 6 次，结果见表 4，RSD 为 0.98%，表明样
品溶解后在 6 h 内稳定性良好。
2.2.5 重复性 取同一批供试品溶液 6 份，分别进
样 1 次，共 6 次，结果见表 4，RSD 为 1.71%，表明
该方法重复性良好。
3 讨论
rLysn 对金葡菌具有良好的体外抗菌活性，且对
甲氧西林敏感的金葡菌（MSSA）和 MRSA 有同样显
著的抗菌效果。rLysn 药用制剂，能有效治疗金葡菌
感染，且不易产生耐药性［27］。对 rLysn 制剂中主药
蛋白即 rLysn 含量进行测定，能有效控制和评价制
剂的质量。
由于 rLysn 冻干粉制剂中含有人血白蛋白，为
了确定成品中 rLysn 的蛋白质含量，需要选用一种
合适的方法，能够将 rLysn 与人血白蛋白有效分离，
同时又能定量测定 rLysn 的蛋白质含量。根据两者
分子量大小差异，采用体积排阻高效液相色谱法，
将成品中的 rLysn 与其它作为保护剂的蛋白成分按
照分子量大小进行分离。由于选择体积排阻高效液
相法，洗脱程序变得简化，我们选择含氯化钠的磷
酸缓冲液作为流动相。该方法在一定条件下，可以
将 rLysn 和人血白蛋白有效分离，在 2-32 μg 上样量
范围内，rLysn 理化对照品上样量和峰面积之间呈现
良好的线性关系，相关系数 r2=1。因此，可以制备
mAU
350
300
250
200
150
100
50
0
0 5 15 25 35302010
1
C ᰦ䰤min
mAU
350
300
250
200
150
100
50
0
0 5 15 25 35302010
B ᰦ䰤min
mAU
350
300
250
200
150
100
50
0
0 5 15 25 35302010
A ᰦ䰤min
1 ：rLysn 峰 ；A ：空白对照 ；B ：rLysn 理化对照品 ；C ：rLysn 成品
图 1 SE-HPLC 色谱分析图
2.2 方法的验证
2.2.1 线性范围 经 5 次进样，计算峰面积，结
果见下表 1，得到的回归方程和相关系数分别为
y=185.93x-2.0042，r2=1 ；y=189.46x-17.138，r2=1 ；
y=188.49x-6.9125，r2=1。 结 果 表 明，rLysn 在 2-32
μg 范围内与峰面积成良好的线性关系（注 ：后续数
据均由回归方程 Y=189.46x-17.138，r2=1 得出）。
2.2.2 准确性 空白制剂加标回收率结果见表 2，3
种浓度的加标回收率在 101.6%、103.8% 和 103.5%，
表 1 五种不同上样量 rLysn 理化对照品的峰面积
蛋白量（μg）
2 4 8 16 32
峰面积 1（A） 361.9 740.3 1490 2983.4 5942
峰面积 2（A） 358.9 739.3 1502.8 3015.8 6044.2
峰面积 3（A） 371.4 745.3 1498.5 3013.3 6023.4
2016,32(7) 57许燕等：重组溶葡萄球菌酶成品蛋白含量测定方法的建立
标准曲线，根据成品中 rLysn 的峰面积计算出成品
中 rLysn 的蛋白质含量。
与 RP-HPLC 法相比，SE-HPLC 法能更好的分
离 rLysn 和人血白蛋白，该法的线性范围 2-32 μg
比 RP-HPLC 法的 5-30 μg 范围更宽，准确性比 RP-
HPLC 法更好，精密度（RSD<1%）远高于 RP-HPLC
法（RSD 在 3%-6%），且稳定性良好。在 rLysn 成
品蛋白质含量测定上，SE-HPLC 比 RP-HPLC 更加简
便、准确，更适合用于 rLysn 成品蛋白质含量测定。
4 结论
本实验建立了一种测定 rLysn 成品蛋白质含量
的 SE-HPLC 法，该方法简便、准确、重复性好。在
该方法确定的测定条件下，可以将 rLysn 和人血白
蛋白有效分离，并且以 rLysn 理化对照品作对照，
在一定上样量范围内，可以对样品中的 rLysn 进行
准确定量。该方法可用于 rLysn 成品蛋白质含量的
测定，从而更好的控制和评价该制剂的质量。
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表 2 三种浓度的空白制剂加标回收率结果
加标量 /μg
峰面积（A） 测定值 /μg
x-±s RSD/% 回收率 /%
1 2 3 1 2 3
4（低） 771 741.4 745.8 4.16 4.00 4.03 4.06±0.084 2.07 101.6
8（中） 1538.3 1565.3 1562.6 8.21 8.35 8.34 8.30±0.078 0.95 103.8
16（高） 3100.1 3142.1 3117.7 16.45 16.67 16.55 16.56±0.111 0.67 103.5
表 3 三种浓度的成品加标回收率结果
加标量 /μg
峰面积（A） 测定值 /μg
x-±s RSD/% 回收率 /%
1 2 3 1 2 3
0（空白） 1640.8 - - - - - - - -
4（低） 2422.1 2424.5 2428.8 4.21 4.23 4.25 4.23±0.018 0.42 105.8
8（中） 3114.1 3117.7 3128.1 7.87 7.89 7.94 7.90±0.038 0.49 98.7
16（高） 4693.3 4715.9 4720.6 16.20 16.32 16.35 16.29±0.077 0.47 101.8
表 4 SE-HPLC 法的精密性、稳定性及重复性验证结果
项目 上样量 /μg
峰面积（A）
x-±s RSD/%
1 2 3 4 5 6
精密性
4（低） 740.3 739.3 745.3 — — — 741.63±3.21 0.43
8（中） 1490 1502.8 1498.5 — — — 1497.1±6.51 0.44
16（高） 2983.4 3015.8 3013.3 — — — 3004.2±18.03 0.60
稳定性 — 1667.5 1671.8 1677.4 1665.1 1642.9 1692.7 — 0.98
重复性 — 1640.8 1642.9 1579.7 1581.1 1614.5 1611.8 — 1.71
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.758
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（责任编辑 狄艳红）