全 文 ：
研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY
BULLETIN 2011年第 5期
重组溶葡萄球菌酶在牛奶中的性质研究
陆敏 1, 2 许黎明2 吴宏宇 2
张继恩 3
李国栋 2, 3 黄青山 1, 3
( 1复旦大学生命科学学院遗传学研究所遗传工程国家重点实验室,上海 200433;
2上海高科联合生物技术研发有限公司,上海 201206;
3昆山博青生物科技有限公司,昆山 215300)


摘
要:
溶葡萄球菌酶 ( Lysostaph in)是一种能高效裂解葡萄球菌细胞壁的肽链内切酶, 已有研究表明其能够有效预防
和去除奶牛乳腺中葡萄球菌的感染,但该酶在牛奶中的性质研究还缺少详细的研究数据。现对重组溶葡萄球菌酶在牛奶中
的一些性质进行研究。检测了加入溶葡萄球菌酶后牛奶性状的变化和重组溶葡萄球菌酶在牛奶中的酶活的稳定性以及溶葡
萄球菌酶在牛奶中的抑、杀菌活性。结果显示, 重组溶葡萄球菌酶未改变牛奶的外观性状; 并且重组溶葡萄球菌酶在 39
牛
奶中可以稳定存放至少 20 h以上, 酶活性保持稳定;同时重组溶葡萄球菌酶在牛奶中对金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌仍然
保持了良好的抑杀菌效果。该研究为今后溶葡萄球菌酶用于奶牛乳腺炎的治疗提供参考依据。
关键词:
重组溶葡萄球菌酶 牛奶 酶活性 杀菌
The Characteristic Study of Recombinant Lysostaphin inM ilk
Lu M in
1, 2
Xu Lmi ing
2
W uH ongyu
2
Zhang Jien
3
L iGuodong
2, 3
Huang Q ingshan
1, 3
(
1
S tateK ey Laboratory of Genetic Eng ineering, Institute of Genetics, School of Life Science, Fudan University, Shanghai 200433;
2
ShanghaiH i-T ech United B io-T echno log ical Research& D evelopmentCo. , Ltd, Shanghai 201206;
3
K unshan Boqing B io log ical Technology Co. , L td. , K unshan 215300)


Abstrac:t
Lysostaph in, a spec ific endopeptidase enzyme o f S taphy lococcus aureus, can effective ly prevent and cure infec tion of
S taphy lo coccus. But re lated stud ies on the cha racte r o f lyso staph in in m ilk we re lack. This study inspec ted some charac ter o f the recom-
b inant lysostaph in( rLysostaphin) in m ilk, such as the change ofm ilk appearance a fter add ing lysostaphin, the stability of enzym e activ ity
and the bac teric idal activ ity o f lysostaphin in m ilk. The resu lts show ed that rLy sostaph in d idn
t change the look ing o fm ilk, keep enzym e
activ ity we ll a fter adding it in to m ilk 20 h at 39
and keep its good bacter ic idal activ ity in m ilk. The study w ill re fer to the treatm ent of
lysostaphin on cow m astitis.
Key words:
Recom binant ly sostaphin M ilk Enzym e activ ity D isinfect
收稿日期: 2010-10-26
基金项目:国家科技支撑计划项目 ( 2006BAD31B01 ),浦东新区科技发展基金项目 ( PKJ2008-N05)
作者简介:陆敏,女,硕士研究生,工程师,研究方向:微生物检测; E-m ai:l anuo79@ yahoo. com. cn
通讯作者:黄青山, E-m ai:l qshuang@ fudan. edu. cn
奶牛乳房炎和子宫内膜炎是困扰我国奶牛业发
展的两个主要难题, 给整个产业造成了巨大的经济
损失。在我国, 乳腺炎是乳牛场最严重的疾病之
一 [ 1- 4] ,在严重的地区,临床型乳房炎年发病率高达
30%,隐性乳房炎年阳性率高达 70%以上 [ 5] , 乳房
炎的病原菌有 50%以上是葡萄球菌, 尤其是金黄色
葡萄球菌 [ 6, 7]。患乳腺炎的奶牛, 不仅牛乳产量将
减少 15- 20% [ 8 ] ,降低了奶牛养殖经济效益, 同时
容易导致奶牛的泌乳功能丧失,使奶牛被迫淘汰,废
弃率相应提高,而且直接影响牛乳的品质,使乳汁中
细菌超标,降低了牛奶的营养成分和品质。由奶牛
乳腺炎引起的经济损失也是相当巨大的,据国外报
道 [ 9] , 美国每年因奶牛乳腺炎引起的损失可达 20亿
美元,欧洲的情况与美国也类似。我国每年因乳房
炎引起的奶牛泌乳量降低所造成的损失,每头牛约
1 200- 3 600元 [ 10]。目前在防治该病上主要采取
抗生素治疗,但抗药性和耐药性菌株的比例逐渐升
高, 现有的抗生素对隐性乳房炎的治疗效果不理想,
2011年第 5期 陆敏等: 重组溶葡萄球菌酶在牛奶中的性质研究
一旦治疗就必须弃奶,产生巨大的经济浪费,也不利
于环保。而且长期大量使用抗生素造成牛奶中药害
残留及药物蓄积,危害动物及人类的健康。
目前国内牧场通常用青霉素、链霉素组合制剂
来防治乳腺炎,该法治愈率低, 易产生耐药性和牛奶
中有抗生素残留的问题。目前急需能够有效治疗奶
牛乳腺炎的新型药物。近年来,生物酶及多肽类物
质因其能直接裂解细菌细胞壁或细胞膜的独特杀菌
机制得到越来越多的重视。由于溶葡萄球菌酶是一
种能够直接裂解葡萄球菌细胞壁并快速杀灭细菌的
生物酶,特别是对抗生素耐药的细菌也有同样好的
抑杀菌效果 [ 11 - 13 ] ,而且溶葡萄球菌酶治疗后不会在
动物体内残留,牛奶中存在的酶可以直接用巴氏消
毒的方法灭活, 安全性较高, 现已成为新的研究
热点 [ 14]。
研究发现 [ 15, 16] ,将溶葡萄球菌酶的基因转入奶
牛中, 分泌的牛奶中可以检测到含有 0
9- 14
g /mL
溶葡萄球菌酶,与没有转基因的奶牛相比,转基因奶
牛可以有效抵抗金黄色葡萄球菌的感染, 在牛奶中
含有 3
g /mL的溶葡萄球菌酶就可以起到有效的
保护作用。基于溶葡萄球菌酶在预防和治疗奶牛乳
腺炎中的潜在价值, 开发其在治疗奶牛乳腺炎的适
用性具有非常重要的实用价值,同时也可产生显著
的经济效益和社会效益。本研究主要进行了重组葡
萄球菌酶在牛奶中酶活变化及其对牛奶性质影响的
研究, 通过对部分革兰氏阳性菌的折、杀菌活性测定
及加入酶后牛奶外观性状变化的观察, 对溶葡萄球
菌酶在牛奶中的基本性质进行初步研究。该研究为
今后溶葡萄球菌酶用于奶牛乳腺炎的治疗提供参考
依据。
1 材料与方法
1
1
材料
1
1
1 药品与试剂
新鲜牛奶,采自上海浦东新
区群乐奶牛场。重组溶葡萄球菌酶粉, 105 U /mg,
批号: 20080503上海高科联合生物技术研发有限公
司。0
2 mo l/L ( pH 10
0)的 G ly-N aOH 缓冲液、50
mmo l /L( pH7
5)的 Tris-HC l缓冲液、95%乙醇,本公
司自配。MH培养基购自营养琼脂培养基、链球菌
培养基国药化学试剂公司。
1
1
2 试验仪器 U ltrospec3300pro型分光光度
仪, 法玛西亚公司; 恒温水浴锅,恒温培养箱,上海森
信仪器公司;微量移液器, Eppendorf公司。
1
1
3 菌株
购自中国药品生物制品检定所。
1
2 方法
1
2
1 重组溶葡萄球菌酶粉对牛奶性状的影响
1
2
1
1
不同比例混匀下的牛奶性状观察 取重
组溶葡萄球菌酶粉,用少量蒸馏水溶解后按不同比
例和牛奶混匀,样品与牛奶混匀比例分为 1
1、1
2、
1
4、1
8及 1
16, 使终溶葡萄球菌酶的浓度分别为
32、16及 8 U /mL。
1
2
1
2
含不同浓度溶葡萄球菌酶的牛奶性状观
察
取重组溶葡萄球菌酶粉, 用蒸馏水溶解后按一
定比例和牛奶混匀, 使终浓度为 32、16、8、4、2及
1U /mL,混匀比例分别为 1
4、1
8及 1
16。
1
2
1
3
观察牛奶性状
分别于 39
水浴放置,
在 10 m in、30m in、60 m in、2 h、4 h、8 h及 16 h的不
同时间观察牛奶外观性状, 是否出现沉淀分层等
现象。
1
2
2 重组溶葡萄球菌酶酶活检测比较
1
2
2
1
供试样品制备 取重组溶葡萄球菌酶粉,
用少量 50mmol /L Tris-HC l( pH 7
5)缓冲液溶解,再
分别用新鲜牛奶和 Tris-HC l缓冲液稀释不同倍数,
随机选取相同稀释度下不同溶剂的样品备用。
1
2
2
2
活性参考品制备
取公司内部参考品
( 4
5 U /50
L) 1支, 准确加入 450
L、50 mmo l/L
Tr is-HC l( pH7
5)缓冲液溶解, 即为 9
0 U /mL对照
品标准溶液。
1
2
2
3
重组溶葡萄球菌酶标准曲线制备 取洁
净干燥的 Eppendorf管 6只, 标号, 按表 1顺序每管
中加入对应量的溶葡萄球菌酶参考品溶液, 再加入
不同量的 0
2 mo l/L G ly-N aOH 缓冲液。然后按序
号加入色源底物 KNR-PG 130
L, 每管加入底物后
迅速在旋涡混合仪上混匀。将加好上述溶液的 Ep-
pendorf管迅速移入 37
的恒温水浴锅中定时反应
20m in。从水浴中取出 Eppendorf管, 按序号加入
300
L 95%乙醇终止反应,并于 10 000 r/m in离心
10m in,离心结束后,取上清液于 595 nm处,以 0号
管为空白测定吸光度。根据测得的吸光度值及相对
应的参考品浓度 C (U /mL), 求得线性回归曲线:
A = KC+ B
163
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2011年第 5期
其中 K为标准曲线的斜率, B为截距, A为吸光
度, C为浓度 ( U /mL)。
表 1
标准曲线制备
管号 底物
(
L )
G ly缓冲液
(
L)
rLysn
(
L)
rLysn终浓度
(U /mL )
0 130 770 0 0
1 130 750 20 0
2
2 130 730 40 0
4
3 130 710 60 0
6
4 130 690 80 0
8
5 130 670 100 1
0
1
2
2
4
重组溶葡萄球菌酶样品活性检测 取
1
2
2
1样品置于 39
(接近奶牛体温 )水浴不同
时间 ( 0 m in、15 m in、30m in、45 m in、60 m in、120 m in
及 20 h)后取样冷冻保存。再将所有冷冻保存的待
测样品进行活性测定, 测定方法同标准曲线, 用
50 mmo l/L Tris-HC l稀释液 ( pH 7
5)预稀释后, 取
50
L用于测定。空白管分别与所测样品的稀释液
( T ris-HC l稀释液或鲜牛奶 )相对应消除差异。
1
2
3 重组溶葡萄球菌酶的最小抑菌浓度 (M IC )
测定
1
2
3
1
药液配制 将重组溶葡萄球菌酶粉用灭
菌蒸馏水配制成 1 280 U /mL贮备液,即配即用。
1
2
3
2
菌液制备 质控菌株和试验菌株接种琼
脂平板,置 37
过夜培养后, 挑取 1- 3个单菌落接
种于 MH培养液, 置 37
孵育 16- 18 h,使菌体浓
度达 5- 7
5
108 CFU /mL。将原菌液用无菌牛奶
或 MH培养液分别按 1
1 000稀释作为试验菌液。
1
2
3
3
接种培养 将重组溶葡萄球菌酶浓溶液
用新鲜牛奶依次倍比稀释成 128、64、32、16


0
125U /mL,用微量移液器将稀释好的药液依次加
入标记好的无菌试管内, 每管 1mL,第 12管中加不
含药物的无菌牛奶作为阴性对照, 再将用牛奶稀释
后的试验菌液依次加入试管中,每管 1 mL,使每管
内药物的终浓度为 64、32、16

0
0625 U /mL, 第
12管加 1mL牛奶。同法用 MH培养液代替新鲜牛
奶将酶溶液按同样的梯度进行稀释, 再加入等体积
用培养液稀释后的菌液作为对照组试验, 同样设空
白培养基作为阴性对照。混匀,将所有试管置 37

培养 18- 24 h。
1
2
3
4
转接培养 因样品中加有牛奶后呈乳浊
液, 不易直接观察结果, 需进行再培养。取含牛奶的
试管样品,分别取一环在营养琼脂平板上进行划线
培养后观察结果。加 MH培养液的试管则可直接观
察结果。
1
2
3
5
M IC及 MBC判定 转接培养后平板上无
细菌生长的对应试管中样品的最低浓度即为该药物
的 MBC。MH培养液对照试验组中试管溶液依旧澄
清, 与阴性对照管无明显差异,对应试管中样品的最
低浓度即为该药物的 M IC, 再吸取邻近 M IC值无细
菌生长的试管内培养物涂布在琼脂平板上,置 37

培养 24 h观察,平板上无细菌生长对应管的最低药
物浓度为该药物的最小杀菌浓度 (MBC)。
2 结果
2
1 重组溶葡萄球菌酶粉对牛奶外观性状的影响
重组溶葡萄球菌酶与牛奶以 1
1、1
2、1
4、1
8
和 1
16的体积比混匀, 终浓度分别为 32、16和
8U /mL,在 39
水浴放置 10 m in、30 m in、60 m in、
2 h、4 h、8 h和 16 h后牛奶外观未发生明显变
化, 仍为正常白色乳浊液, 表明牛奶中含有较大
体积的溶葡萄球菌酶时对牛奶的外观性状不产
生明显影响。
重组溶葡萄球菌酶在 32、16、8、4、2和 1 U /mL
终浓度下, 与牛奶混匀比例分别为 1
4、1
8、1
16
时, 39
水浴放置 10m in、30m in、60m in、2 h、4 h、8
h和 16 h后牛奶外观未发生明显变化, 仍为正常白
色乳浊液。表明牛奶中含有较高浓度的溶葡萄球菌
酶时对牛奶的外观性状不产生明显影响。
2
2 酶活检测比较
2
2
1
标准曲线绘制 见图 1和表 2。
2
2
2
重组溶葡萄球菌酶样品活性检测
重组溶
葡萄球菌酶分别在新鲜牛奶和 T ris-HC l稀释液中
稀释配制后的酶活性测定结果 (表 3)表明, 不同
稀释液对酶的活性无明显影响, 差异不显著 ( P >
0
05)。
重组溶葡萄球菌酶在 39
水浴不同时间后的
酶活测定结果 (表 4)显示, 在 39
下水浴 20 h后,
酶的活性基本不变,差异不显著 (P > 0
05)。
164
2011年第 5期 陆敏等: 重组溶葡萄球菌酶在牛奶中的性质研究
图 1
重组溶葡萄球菌酶活性参考品标准曲线
表 2
重组溶葡萄球菌酶活性参考品标准曲线
活性 C( U /mL ) A595吸收值
0
20 0
268
0
40 0
521
0
60 0
732
0
80 0
9587
1
00 1
14
表 3 不同稀释液下酶的活性测定结果
所用稀释液 酶活测定结果 ( U /mL)
1 2 3 4 5 6 7
平均值 CV (% )
鲜牛奶 20
6 18
0 15
5 17
6 17
5 17
6 15
4 17
5
T ris-H C l 18
7 16
4 17
5 17
0 16
7 15
6 23
6 17
9
0
29
表 4 水浴不同时间下酶的活性测定结果
稀释液名称 39
水浴不同时间后酶活测定结果 ( U /mL)
0 m in 15m in 30m in 45 m in 60 m in 120m in 20 h
平均值 CV%
鲜牛奶
T ris-H C l
168
2
171
1
175
170
8
170
8
167
9
173
8
161
6
177
3
169
0
178
8
170
5
170
162
5
171
9
3
63
167
6
3
68
结果为 3次试验平均值
2
3 杀菌效果检测
重组溶葡萄球菌酶对金黄色葡萄球菌、表皮葡
萄球菌及链球菌的抑、杀菌结果 (表 5)显示,重组溶
葡萄球菌酶在牛奶中的最小杀菌浓度比 MH组稍
高,表明牛奶可作为细菌的一种保护剂,在一定程度
上减弱了酶的杀灭活性, 但仍可在较低浓度下杀灭
牛奶中的细菌。
3 讨论
重组溶葡萄球菌酶作为高效杀菌的生物蛋白,
在替代传统的抗生素类药品方面具有多重优势。本
试验针对重组溶葡萄球菌酶用于治疗奶牛乳腺炎时
碰到的首要问题:酶蛋白的作用是否会影响牛奶自
身的性状;牛奶中其生物活性是否有明显变化等做
了相关的试验。尽量模拟现实情况下的条件, 选取
新鲜挤出的牛奶作为试验材料, 选取奶牛的体温
(约 39
)作为试验温度, 试验结果对临床试验的方
案提供参考。
表 5
重组溶葡萄球菌酶对链球菌的抑杀试验结果
菌株名称 菌株编号 牛奶组
M BC
MH培养基
组 M IC
MH培养基
组 MBC
金黄色葡萄球菌 ATCC29213 1 0
125 0
5

金黄色葡萄球菌 ATCC 6538 1 0
063 0
25
金黄色葡萄球菌 ATCC 43300 1 0
125 0
25
金黄色葡萄球菌 CMCC 26003 1 0
125 0
25
金黄色葡萄球菌 ATCC 27217 1 0
063 0
125
表皮葡萄球菌 ATCC 26096 1 0
125 0
25
表皮葡萄球菌 ATCC12228 1 0
063 0
125
表皮葡萄球菌 ATCC 26103 1 0
125 0
25
停乳链球菌 ATCC 9926 2 0
25 0
5
停乳链球菌 ATCC 35666 2 0
25 0
5
无乳链球菌 ATCC 624 2 0
5 1
0
无乳链球菌 AS 1
1481 2 0
5 1
0
试验温度为 38- 39

试验表明,重组溶葡萄球菌酶粉在 32U /mL浓
度与牛奶 1
1体积比混匀下, 39
水浴 16 h后对牛
165
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2011年第 5期
奶的外观性状未产生影响, 拟定的实际使用浓度仅
为 4- 8 U /mL, 更不可能对牛奶的性状产生影响。
另外, 溶葡萄球菌酶在鲜牛奶中 39
下水浴 20 h后
酶活性未受到明显影响, 酶活测定结果显示与起始
浓度基本一致,表明溶葡萄球菌酶在牛奶中活性保
持稳定。同时,重组溶葡萄球菌酶在牛奶中仍具有
良好的抑、杀菌效果。虽然牛奶常作为一种保护剂,
对细菌具有一定的保护作用,在一定程度上影响了
酶的作用,与 MH培养液组相比所需的浓度稍高,但
在牛奶中仍只需在 1- 2 U /mL的较小浓度下即可
达到最小杀菌浓度。该试验结果为今后开展临床试
验奠定基础。
参 考 文 献
[ 1] C lim oMW, Eh lertK, Archer GL. M ech an ism and supp ress ion of ly-
sostaph in resistance in oxacill in-resistant S taphylococcu s aureu s. J
An tim icrob Agent Ch emother, 2001, 45( 5) : 1431-1437.
[ 2] K ehrli Jr ME, Shuster DE. Factors affect ing m ilk som at ic cells and
the irrole in h ealt h of the bovine m amm ary g land. JDairy S c,i 1994,
77: 619-627.
[ 3] 刘佩红,黄忠,王健.奶牛乳腺炎病原的分离鉴定及耐药性分析.
中国奶牛, 2004 ( 1) : 43-45.
[ 4] 倪春霞,蒲万霞.奶牛乳房炎病原菌的分离鉴定及耐药性分析.
西北农业学报, 2010, 19( 2) : 20-24.
[ 5] 潘虎,刘纯传,张礼华,等.我国部分地区奶牛乳房炎的病因及发
病情况调查.中国兽医科技, 1996( 2) : 16-17.
[ 6] 马保臣,秦卓明,李建基,等.奶牛隐性乳腺炎病原菌的分离鉴定
和体细胞数及酶的相关性研究. 家畜生态学报, 2006, 27 ( 2 ) :
63-67.
[ 7] 宋华容,李正国,罗瑞卿,等.石河子地区奶牛乳房炎病原菌分离
鉴定及中药抑菌试验.安徽农业科学, 2009, 37 ( 9) : 4044-4047.
[ 8] 赵兴绪,等.兽医产科学 (第 3版 ) [M ] .北京: 中国农业出版社,
2002: 458-459.
[ 9] LundT, M iglior F, Dekk ers JCM, et a.l Gen et ic relationsh ips betw een
clin icalm ast itis, somat ic cell count, and udder con form ation in Dan-
ish H olsteins. L ives tock Product ion S cience, 1994, 39( 3) : 243-251.
[ 10] 李国江,邹风驰. 奶牛隐性乳房炎的检测与评估. 中国奶业,
1998( 3 ) : 16-17.
[ 11] 杨信怡,游雪甫,娄人慧.重组溶葡球菌酶的体外抗菌活性研
究.中国新药杂志, 2006, 15 ( 24) : 2107-2111.
[ 12] 黄青山,贾敏,吴聪明.重组溶葡萄球菌酶对奶牛乳房炎和子宫
内膜炎常见病原菌的体外杀菌试验. 中国兽药杂志, 2007, 41
( 8) : 41-47.
[ 13] Y ang X, L iC, Lou R, et a.l In vi tro activ ity of recom b inan t lu sosta-
ph in again st S taphy lococcus aureus isolates from hospitals in B e-i
jing, C h ina. J Jou rnal ofM ed icalM icrob iology, 2007, 56: 71-6.
[ 14] Donovan DM, Dong S, GarrettW, et a.l Pept idoglycan hydrolase fu-
sionsm ain tain their parental sp ecificities. J App l Environ M icrob-i
o,l 2006, 72 ( 4) : 2988-2996.
[ 15] Donovan DM, K err DE, W allR J. Eng ineering disease resistan t ca-t
tle. T ran sgen ic R es, 2005, 14( 5) : 563-567.
[ 16] W all RJ, Pow ell AM, Paape M J, et a.l Gen et ically enhan ced cow s
resist in tram amm ary S taphylococcu s aureus in fection. N at B iotechn-
o,l 2005, 23 ( 4) : 445-451.
[ 17] Oldham ER, D aley M J. Lysostaph in: u se of a recom binant bacter-i
cidal en zym e as a mast it is therapeu tic. J Dairy S c,i 1991, 74 ( 12 ):
4175-4182.
[ 18] Daley M J, O ldham ER. Lysostaphin: immunogen icity of locally ad-
m in is tered recomb in ant p rotein u sed inm ast it is therapy. V et Immu-
no Imm unopatho,l 1992, 31 ( 3-4 ): 301-312.
(责任编辑 马鑫 )
166