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综述与专论

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 10期
昆虫抗冻蛋白的研究进展
钟鸣 1, 2  蔡继峰 1  文继舫2
( 1中南大学湘雅医学院法医学系,长沙 410013; 2中南大学湘雅医学院病理学系,长沙 410013)
  摘  要:  抗冻蛋白是一类与冰晶有亲合力, 能够与冰晶结合并抑制冰晶生长的蛋白或糖蛋白。自 20世纪 60年代以来,
研究人员已经分别从鱼类、昆虫、植物、真菌和细菌中发现多种抗冻蛋白。其中已知鱼类抗冻蛋白有 5种, 也是研究最详细的。
但是, 近几年来发现昆虫抗冻蛋白活性普遍比较高, 因此受到研究人员重视, 研究取得了较快的发展。主要讨论昆虫抗冻蛋
白的结构特点、抗冻活性、作用机制和应用,并分析目前的研究现状提出一些待解决的问题, 以期望对昆虫抗冻蛋白的研究进
行比较系统化的整理。
关键词:  热滞活性  热滞蛋白  结构  抗冻活性  活化蛋白
Advances in InsectAntifreeze Protein Research
ZhongM ing
1, 2  Ca i J ifeng1  W en Jifang2
(
1
D epar tment of F orensicM edcine Science, X iangya School of M edicine, C entral South University, Changsha 410013;
2
D epar tment
of Pathology, X iangya School of M edicine, Central Sou th University, Changsha 410013)
  Abstrac:t  Antifreeze pro teins are a kind o f pro te ins o r g lycoprote ins wh ich have affin ity w ith ice crysta ls, can comb ine w ith ice
crysta ls, and inhib it the grow th o f ice cry sta ls. S ince the 1960s, researchers have found many k inds o f antifreeze prote ins from fishes, in

sects, plan ts, fung i and bacteria respectively. F ishes antifreeze prote ins, w ith five types, whose prote ins are a lso the most deta iled stud ied
prote ins among them. H ow ever, in recen t yea rs, insec t antifreeze prote ins have been found that the activ ity is usually h igh. So they
caused attention to resea rche rs and the researches have m ade rap id deve lopm ent. This article focuses on the structural cha racte ristics of
insect antifreeze prote ins, antifreeze activ ity, m echanism and app lications. W ith analyzing the curren t research status, and ra is ing som e
prob lem s to be so lved, w e look forwa rd to conduct am ore system a tic rev iew to the research o f insect antifreeze pro teins.
Key words:  Therm al hy stersis activ ity Therm a l hystersis pro teins S tructure Antifreeze activ ity A ctivated pro tein
收稿日期: 2010
04
12
基金项目:国家自然科学基金项目 ( 30672354) ,中南大学博士生学位论文创新项目
作者简介:钟鸣,男,博士研究生,研究方向:法医昆虫学; E
m ai:l zhongm ing529@ 163. com
通讯作者:蔡继峰,博士,副教授, E
m ai:l cjf_ jifeng@ 163. com;文继舫,教授,博士生导师, E
m a i:l jifangw en@ Y ahoo. cn
抗冻蛋白 ( ant ifreeze pro teins AFPs)的研究源于
加拿大科学家 Scho lander对于北极鱼类为什么能够
在低于其血液冰点的水里游泳的疑问, 随后他的试
验显示存在 !某种抗冻物质 ∀。 1969年动物生理学
家 Devries研究了南极几种鱼类,分离出具有抗冻效
应的一种蛋白 [ 1 ]。这种蛋白与后来发现的一系列
与冰晶有亲合力,能够与冰晶结合并抑制冰晶生长
的蛋白或糖蛋白称为 AFPs。AFPs具有一个最重要
的性质:能以非依数性形式降低溶液的冰点而对其
熔点影响甚微,从而导致溶液的熔点和冰点之间出
现差值 (如果是依数性则不会出现熔点与冰点的温
度差值 ), 这种差值称为热滞活性 ( thermal hystersis
activ ity, THA ) ,因而 AFPs亦称为热滞蛋白 ( therma l
hystersis pro te ins, THPs)
[ 2
4]
, 是衡量抗冻活性的最
重要指标。目前已知 AFPs存在于多种生物体中,
包括鱼类、昆虫、植物、真菌和细菌,而鱼类 AFPs的
研究最多 [ 5]。但是有研究表明, 从甲虫和云杉卷叶
蛾 (Choristoneura fum iferana )中分离到的 AFPs的活
性是鱼类 AFPs或抗冻糖蛋白 ( antifreeze g lycoprote in
AFGP)活性的 10- 100倍 [ 6]。并且近年来, 越来越
多的越冬昆虫被认为以产生 AFPs方式作为其对低
温适应的策略之一,不仅在昆虫的体液中,而且在昆
2010年第 10期 钟鸣等:昆虫抗冻蛋白的研究进展
虫的肠液和细胞内液中都有 AFPs的产生 [ 7] , 因此
昆虫的 AFPs研究具有重要的意义。
1 对昆虫 AFPs结构的研究
昆虫 AFPs的分子量大都在 7- 20 kD之间, AF

Ps结构呈多样性 [ 8 ] ,即使同一种 AFP也存在多种同
源异构体 ( iso forms) ,具有不同于鱼类 AFPs的独特
结构 [ 9, 10] ,这被认为是自然选择和平行进化作用所
致 [ 11] ,但是却都能与冰晶表面的棱柱或 /和基面很
好地结合而具有同样的功能 # # # 抗冻。
早在 30年前第一种昆虫 AFPs就已经从黄粉虫
(Tenebriomolitor)中分离出 [ 12] ,而且后来在蜘蛛 ( sp i

ders)
[ 13
15]、螨 (m ites) [ 16, 17 ]、蜈蚣 ( centipedes) [ 18, 19 ]、
北极鳞翅目 ( Embryonop sis multicellular ) [ 20]、长角牛
甲虫 ( Phagium inqu isitor ) [ 21]、蛾 ( moths) [ 6, 20, 22 ]、松
针瘿蚊 (Thecodip losis japonensis ) [ 23]、美洲脊胸长椿
(Oncopeltus fasciatus )
[ 24] 以及赤翅甲 ( Dendroides
canadensis)和云杉卷叶蛾等 [ 16, 25, 26]陆地节肢动物
中均发现有 AFPs, 但是对昆虫 AFPs的研究集中
在黄粉虫、赤翅甲、云杉卷叶蛾等为数不多的几
种昆虫中 [ 9, 27 ]。所以, 到目前为止也只是对它们
的 AFPs结构进行了详细研究 , 主要的结构特点
见表 1。
表 1 几种昆虫结构特点
黄粉虫 赤翅甲 云杉卷叶蛾
分子量 ( kD ) 8. 4- 13 约 8. 7 9. 0
一级结构 富含苏氨酸、半胱氨酸,
富含苏氨酸、半胱
氨酸,
富含丝氨酸、
苏氨酸,
12个氨基重复 12- 13个氨基重复 15个氨基重复
二级结构
折叠
折叠
折叠
异构性 (H et

erogeneity)
同源异
构体 ( 17 )
同源异
构体 ( 13)
同源异
构体 ( 9)
黄粉虫 AFPs( TmAFP )有 17种同源异构体的
cDNA被鉴定,编码 84、96或 102个氨基酸, 组成的蛋
白分子量在 8. 4- 13 kD之间。分析结构显示为右手

螺旋,有 6- 10圈螺旋不等,每一圈由 12个氨基酸
组成。TmAFP富含半胱氨酸 ( 19 mo l% )和苏氨酸
( 21- 26mol% ),有 12个氨基酸的重复单位 CTxSxx

CxxAxT
[ 11, 28]。这种在每圈螺旋中重复出现氨基酸
TCT基序被认为赋予昆虫 AFPs极高的 THA[ 11]。
赤翅甲 AFPs( DAFP)亦包括几种同源异构体,
其中研究比较深入的是 DAFP21和 DAFP22,分子量
约 8. 7 kD,分别含 83和 84个氨基酸残基。它们组
成含 12或 13氨基酸残基的 7个重复单元 ( CTxSxx

CxxAxTx )。每个重复单元中的第 1与第 7个半胱
氨酸形成二硫键, 这 8对二硫键赋予其二级结构以
稳定性。DAFP的结构随温度而有所变化, 在 25∃
时有 46%
折叠, 39%转角, 2%螺旋, 13% 无规则
结构,当遇到冰时螺旋和
折叠稍有增多而转角和
无规则结构则减少 [ 8, 29, 30, 31]。
云杉卷叶蛾 AFPs( sbwAFP,或 C fAFP)的 cDNA
编码多种分子量不同的蛋白质, 其中 9 kD型 ( 337
或 C fAFP
337)结构已通过核磁共振技术和 X射线
结晶技术测定 [ 9, 30] ,成为重组表达关注的焦点。 sb

wAFP富含丝氨酸和苏氨酸, 与任何已知甲虫、鱼类
及植物 AFPs都没有发现有同源性序列, 其成熟肽
具有 90个氨基酸。核磁共振研究揭示 sbwAFP的
结构是左手
螺旋,每一圈有 15- 17个氨基酸形成
一个富含苏氨酸的平面, 这个平面可能是与冰晶结
合的面 [ 26]。而 CfAFP的一种同源异构体 C fAFP2501,
分子量 12 kD,比 C fAFP多出 2圈螺旋,这多出的 2圈
上同样具有 Thr2X2Thr基序 [ 27, 31]。
除了对以上 3种昆虫有详细的研究外,近几年
来研究人员对准噶尔小胸鳖甲 (M icrodera punctipen

nis dzhungarica ) AFPs(M pAFP)和雪跳蚤 (H ypogas

trura harvey i) AFPs( HhAFP)也进行了比较详细的
研究。M pAFP分子量为 10 kD,富含半胱氨酸、苏氨
酸、丙氨酸和天冬氨酸。具有含
片层的特殊螺旋
即由 7个重复序列 ( TCTXSXXCXXAX )组成的右手

螺旋结构。每圈由 12个氨基酸组成, 共 7圈螺
旋,每一螺旋之间由 1个二硫键连接,起到稳定蛋白
结构的作用 [ 32]。
HhAFP分子量 6. 5- 15. 7 kD, 富含甘氨酸, 有
多个 GGX基序。由于存在 4个脯氨酸使这些重复
的基序形成了规则的
螺旋结构, 蛋白质也因此折
叠成了交互平行和反平行的结构。连接的二硫键和
氢键赋予了 HhAFP一定的稳定性。有意思的是那
些偶数的螺旋结构共同形成了一个扁平状的疏水表
面, 这个面被认为是其与冰晶的结合面,但至今没有
得到科学的试验验证 [ 33]。 2008年 Pente lute等 [ 34]通
9
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 10期
过对 HhAFP的晶体结构的研究确定了 HhAFP的结
构模型。
2 对昆虫 AFPs抗冻活性的相关研究
目前昆虫 AFPs抗冻活性的最主要评价指标是
THA。AFPs的 THA大小除了与昆虫 AFPs种类本
身有关外主要与 AFPs浓度、活化蛋白等多种活化
剂及其它许多因素有关。
2. 1 AFPs种类与 THA的关系
昆虫 AFPs在体外没有活化蛋白作用下其 THA
仍然远高于鱼类 AFPs。 20 mo l/L的云杉卷叶蛾
AFPs能降低冰点 108∃ , 而美洲拟鲽 ( P leuronectes
americanus ) %型 AFPs在浓度到达 400 mol/L时,
仅能使冰点降低 027∃ [ 27]。 TmAFP浓度为 20
mo l/L时能使冰点降低 14∃ ,而 III型鱼类 ( ocean
pout)AFPs的浓度为 218 mo l/L时才降低相同的冰
点 [ 35]。这些差异既存在于分离的天然 AFPs中,也
存在于纯化单一成分的重组 AFPs或合成 AFPs中,
因此排除了在体外昆虫 AFPs活性的提高是由于其
他成分加入的解释 [ 36]。
2. 2 AFPs浓度与 THA的关系
用 TmAFP抗体与含不同浓度该蛋白的昆虫体
液进行W estern B lot试验,结果表明 THA与 AFPs浓
度之间的关系呈双曲线型 [ 37] , 并且在双曲线斜率
变化最大部分的浓度与昆虫体内 AFPs的生理浓度
非常吻合, 这提示昆虫体内 AFPs浓度较小的改变
就会对其 THA造成较大的影响 [ 27]。
2. 3 AFPs活化蛋白与 THA的关系
早期研究者发现在昆虫体内的 AFPs活性很
高 [ 6, 38, 39 ] ,但纯化后的 AFPs的 THA明显降低; 即使
在较高浓度下的纯化 AFPs, 其 THA仍低于血淋巴
的 AFPs,但是在重组表达和纯化出这种蛋白之前,
研究者对 AFPs的这一特殊性质并没有引起足够的
重视 [ 23, 40]。后来有学者发现在 DAFP水溶液中加
入抗血清,其 AFPs的活性可增加 3倍, 甚至在不能
检测到 THA的低浓度 AFPs溶液中加入适量抗体,
也能使 THA升至 1. 5- 2. 5∃ [ 41 ]。上述现象说明昆
虫血淋巴中可能存在另外一些可以与 AFPs结合的
物质, 从而大幅度提高其活性。
这类蛋白可称为 AFPs的活化蛋白, 目前已经在
赤翅甲中发现这种蛋白质。Duman等 [ 42]发现 THA为
1. 6∃ 的 DAFP,加入一种从血淋巴中分离出来而本
身无 THA的 70 kD的蛋白质后, AFPs的活性增加
至 5. 24∃ ,而加入一般蛋白质则无效, 所以目前认
为这种 70 kD的蛋白就是 AFPs的内源活化蛋白。
这种活化蛋白的发现开辟了 THA调节机制研究的
新领域,使 AFPs的研究上升到蛋白间相互作用的
高度,而不仅只是停留在用一种蛋白来解释其复杂
的抗冻机制这种单因素作用的水平。
某些昆虫体内分子量较大的冰核蛋白,也显示
出轻微的活化作用 [ 41]。另外, 一些小分子量的物质
也能提高昆虫 AFPs活性 [ 43]。如柠檬酸盐的增强效
应最强,它能够提高 AFPs的 THA近 6倍;其次是琥
珀酸盐、苹果酸盐、天冬氨酸盐、谷氨酸盐和硫酸铵,
它们能提高 AFPs的 THA约 4倍; 甘油、山梨醇、丙
氨酸和重碳酸铵提高 AFPs的 THA 3倍。此外,短的
光周期、低温和干燥都能引起黄粉虫血淋巴的 THA
提高。
3 对昆虫 AFPs作用机制的研究
目前对昆虫 AFPs的作用机制还不是十分明
确,主要的研究学说有以下几种。 1977年 Raymond
和 Devries提出 !吸附抑制机制 ∀学说来解释 AFPs
的作用机理,是这方面最早的学说。他们认为 AFPs
通过吸附到冰晶表面抑制冰晶生长, 而不是通过把
水与冰进行隔离, 使得水不再结冰。对大多数溶液
中的蛋白而言,缓慢生长的冰晶能把这些蛋白从冰
的前面推开,阻止蛋白与冰晶相结合,使与冰结合的
蛋白量低于溶液中的 10% ; 而 AFPs却与之相反,
89%的 AFPs结合于冰上, 而且与冰之间的相互作
用非常稳定。通过 Ke lv in效应抑制其生长。大致
模式是冰晶一般垂直于晶体表面生长,当杂质吸附
于冰晶生长方向的表面时, 冰在杂质间生长的弯曲
度必然加大即曲率增大,使冰晶边缘的面积也增加。
因表面张力的作用,增加的表面积必将使体系的平
衡状态发生改变,从而使冰点下降 [ 44 ]。该学说被后
来的一些试验所证实, Du等 [ 45 ]第一次采用了 !微粒
冰核 ∀技术, 定量检测到 AFPs通过吸附到冰核表
面, 抑制其生长。
2002年 Jia和 Dav ies在 !吸附抑制机制 ∀学说
的基础之上提出了一个可适用于目前已经发现的
AFPs!表面互补 ∀学说, 该学说也被称为 !受体 # 配
10
2010年第 10期 钟鸣等:昆虫抗冻蛋白的研究进展
体 ∀学说。在这个学说中 AFPs是受体, 冰是配体,
AFPs与冰晶之间所形成的表面互补与多种相互作
用力有关,互补的表面面积越大则相互作用力越强,
如果 AFPs从冰晶上脱离下来则必须同时破坏这些
相互作用力,这在动力学上几乎是不可能的,从而导
致了 AFPs与冰晶之间结合的不可逆性。在该学说
中不同类型的 AFPs能与不同形状的冰晶表面结
合,冰晶就像配体一样,通过表面互补选择性地与不
同的受体 (AFPs)结合。这种表面互补方式可适用
于所有的 AFPs,形成表面互补的相互作用力中主要
是疏水作用力和范德华力, 氢键起着次要的作
用 [ 8]。2002年, Cheng等应用量子力学分子轨道计
算方法分析 AFP
&, 结果表明 AFP
&有一个结合
面, 它含有 19氨基酸残基, 可与冰晶表面相吻
合 [ 46] ,进一步验证了这种学说的合理性。
1983年 DeV iles[ 47]提出了 !晶格匹配 ∀学说来
解释美洲拟鲽 AFPs的作用机制, 1993年 Kn ight
等 [ 48]在 !晶格匹配 ∀学说的基础上提出了 !晶格占
有 ∀学说, 对其进一步完善。此外, Yang等 [ 49]于
1988年提出 !偶极子 -偶极子 ∀学说。
4 昆虫 AFPs的应用
AFPs有着比较广泛的应用, 在改善冻融食品的
质量和产品的储存方面具有潜在的应用价值 [ 50 ]。
融合 AFPs在疾病治疗如器官、组织、细胞等的低温
保存等方面也有着潜在的重要性 [ 35, 36, 38
41, 43, 50
55 ]。
在食品工业中,最近有学者报道用乳酸球菌生产的
重组鱼类%型 AFPs类似物处理肉和生面团进行冷
冻对照试验。AFPs处理过的肉比未处理过的肉,在
感观上水分和蛋白质丢失更少;而处理过的生面团
比未处理过的生面团具有更好的发酵能力, 并且用
处理过的面团做的面包与新制面团做的面包有同样
的消费接受度 [ 56]。在医学上, Gabriel等 [ 51 ]首次报
导了在老鼠的心脏移植中, 用 AFPs低温保藏心脏
从而成功地保护了心肌结构。M elan ie等 [ 57]的研究
认为, AFPs具有稳定膜结构和细胞的功能。AFPs
可以对红细胞进行低温保存,对红细胞的保护效率
与它们的 THA相关 [ 58]。值得注意的是,有研究人
员对 AFGP进行改造, 合成 C端连接 AFGP类似物
的化合物,该化合物有很强的抑制重结晶作用而不
具有 THA,是新型的抗冻剂,有广泛的应用前景 [ 59]。
以上 AFPs的应用主要是使用鱼类的基因进行
的,而昆虫 AFPs的活性一般高于其它种类的 AFPs,
同时存在内源性活化因子,因此用它们的基因进行转
基因动植物等基因工程的研究可能有更明显的低温
保护效应。最近几年多种表达载体和宿主菌被用来
表达昆虫 AFPs,于此同时,酵母表达系统也被用来表
达富含二硫键的昆虫 AFPs[ 60]。遗憾的是,到目前为
止还没有具有活性 AFPs的高产表达系统 [ 61]。但是
也取得了一些成果, 例如, Ho lmberg等结合植物偏爱
的密码子合成了 sbwAFP基因,与烟草病原相关蛋白
基因融合表达,获得的转基因烟草表现出了较强的抗
冻活性。 2002年 Huang等 [ 62]将 DAFP基因成功导入
拟南芥中并在转基因株系细胞提取物中检测到具有
THA的 AFPs的表达。 2008年W ang等 [ 32]成功地通
过农杆菌浸染法将 MpAFP基因导入烟草中, 试验证
明转基因烟草的抗寒能力加强了。
虽然昆虫 AFPs的应用有比较可观的前景而且
也取得了一些研究成果, 但是由于昆虫 AFPs独特
的结构和生物学活性 (小分子量, 众多的异构体 )给
分离纯化天然昆虫 AFPs带来一定的难度。AFPs细
菌表达系统中往往不能表达具有活性的正确构象的
昆虫 AFPs或者是产生不可溶性的包涵体蛋白, 这
类蛋白必须经过变性、复性、氧化和重折叠过程之后
才能获得有活性的正确折叠的 AFPs, 而该过程往往
需要较复杂的纯化方法 [ 60, 63
65] , 因此昆虫 AFPs的
应用仍有许多需要解决的问题。但是,随着研究的
不断深入,相信昆虫 AFPs必将在农业、医学和食品
科学等领域具有更加广阔的应用前景。
5 问题与探讨
关于 AFPs的命名目前存在 AFPs、THPs和冰结
合蛋白 ( ice structuring proteins)三种说法。这三种
命名方法大致都是从结构和功能方面来考虑的, 均
有它们的合理性。其中有学者 [ 66]专门撰文指出,
AFPs容易造成它具有阻止 !冻 ∀ (即结冰 )的误解,
而实际上该类蛋白是与冰结合通过控制冰晶的大
小、形状和聚集来影响冰晶生长和作用。另外一个
问题又产生了: AFPs以其具有的 THA来确定其存
在的,那么是否应该称为热滞蛋白更为合理? 目前
已经出版的文献以 AFPs命名为主, 已基本上是约
定俗成,要在短时间内改变可能有一定的难度, 因
11
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 10期
此,与其进行命名之争,不如暂时按约定俗成处理,
根据以后的研究成果再分类命名。为了把 AFPs中
的 AFGP也包括进来, 可以考虑使用 !抗冻蛋白家族
( ant ifreeze pro te ins fam ily) ∀来统领这类蛋白; 如果
以后发现更多的种类, 不妨称之为 !抗冻蛋白超家
族 ( antifreeze prote ins superfam ily) ∀, 这样命名比较
容易让大多数学者接受且符合蛋白质命名的惯例。
目前 AFPs的研究主要关注其本身的结构、功
能、作用机制和应用, 然而抗冻 (低温保护 )是机体
对低温环境的一系列复杂的适应性调控过程, 因此
必然是一个多基因多蛋白网络参与调控的复杂过
程。所以,在立足 AFPs本身研究的同时, 适度的重
视与其有相互作用的基因和蛋白的研究,即对 ! AF

Ps调控网络 ∀的研究,可能对揭示 AFPs的作用机制
和功能有一定帮助。
除了上述的一些待解决的问题外, 在昆虫 AFPs
方面研究的种类相对于昆虫总体数量来看明显不
够,因此其后续的作用机制、功能和应用都无法给予
比较满意的解释, 所以昆虫 AFPs的研究尚有许多
谜团等待被揭开。
参 考 文 献
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