全 文 ：新疆沙冬青抗冻蛋白的提取分离及其热滞活性测定?
尉姗姗 , 尹林克?? , 牟书勇 , 鲁春芳 , 赵峰侠
(中国科学院新疆生态与地理研究所 , 新疆 乌鲁木齐 830011)
摘要 : 抗冻蛋白被发现于低温环境下生存的生物体中 , 它能够吸附在冰晶表面并改变冰晶的生长形态 , 对
于增加植物的抗低温胁迫能力有重要作用。用纤维素 DE-52 离子柱层析提取分离出了冬季新疆沙冬青
( Ammopiptanthus nanus) 叶片中的抗冻蛋白 (AFPs)。差示扫描量热法 (DSC) 测定结果表明 , 当蛋白浓度为
20 mg?ml 时 , 抗冻蛋白的热滞活性 ( THA ) 为 0 .46℃。经 SDS-PAGE 电泳分析 , 此抗冻蛋白的分子量为
119 .24 kDa。
关键词 : 新疆沙冬青 ; 抗冻蛋白 ; 差示扫描量热法 ; 热滞活性
中图分类号 : Q 945 文献标识码 : A 文章编号 : 0253 - 2700 (2007) 02 - 251 - 05
Extraction , Separation and Measuration of the Thermal
Hysteresis Activity of Antifreeze Proteins from
Ammopiptanthus nanus (Leguminosae)
YU Shan-Shan, YIN Lin-Ke
* *
, MU Shu-Yong, LU Chun-Fang, ZHAO Feng-Xia
( Xinjiang Instituteof Ecology and Geography, Chinese Academy of Sciences, Urumqi 830011 , China)
Abstract: Antifreeze proteins (AFPs) , because of their ability of adsorbing onto the surface of ice crystals and modifying
their growth, have beenfound inmany different organisms that areexposed to chillingandfreezingtemperatures . It is very
important to increase the resisting and coercing ability at low temperature . DE-52 ion-exchange cellulose was used to ex-
tract and separate the antifreeze proteins from Ammopiptanthus nanus leaves . Differential scanning calorimetry (DSC) was
used to measurethethermal hysteresis activity (THA) . The results reveal that when the concentration of the protein is 20
mg?ml , the THA of the AFPs is0 .46℃ . Its molecular weight is about 119.24 kDa by sodiumdodecyl sulfatepolyacrylam
ide gel electrophoresis (SDS-PAGE) .
Key words: Ammopiptanthus nanus; Antifreeze proteins; DSC; Thermal hysteresis activity
抗冻蛋白 (antifreeze proteins, AFPs) 是生物
在适应低温过程中产生的抗寒功能蛋白之一 , 它
能够非依数性地降低水溶液的冰点 , 但对熔点的
影响甚微 , 从而导致水溶液的熔点和冰点之间出
现差值 , 这种差值称为热滞活性 ( thermal hyster-
esis activity, THA)。它具有 3 个基本特征 : 热滞
效应、修饰冰晶形态效应、抑制重结晶效应。抗
冻蛋白的这些特性吸引了很多科学工作者的注
意 , 自 20 世纪 60 年代被发现以来 , 至今在鱼
类、昆虫、真菌、细菌和植物中均发现有 AFPs
存在 (Sidebottom and Worrall , 2000; Craham等 ,
1997; Duman and Olsen, 1993; Griffith 等 , 1992;
Urrutia等 , 1992; Devries and Wohlschlag, 1969)。
新疆沙冬青 ( Ammopiptanthus nanus) 为豆科沙
云 南 植 物 研 究 2007 , 29 (2) : 251～255
Acta Botanica Yunnanica

?
?? ?通讯作者 : Author for correspondence; E-mail : yinlk@ ms.xjb. ac. cn; 电话 : 0991 - 7885391
收稿日期 : 2006 - 06 - 20 , 2006 - 12 - 01 接受发表
作者简介 : 尉姗姗 (1982 - ) 女 , 汉 , 硕士研究生 , 主要从事植物生理与分子生物学研究。 ?
基金项目 : 重大基础研究前期研究专项 ( 2004CCA03400) ; 新疆维吾尔自治区自然科学基金项目 ( 200421106) ; 新疆生物资源基
因工程重点实验室开放课题 ( XJDX0201-2005-09)
冬青属 ( Ammopiptanthus) 植物。本属仅 2 种 , 起源
于古热带地区 , 为古地中海的孑遗种 , 也是温带荒
漠区现代分布仅有的常绿阔叶灌木 ( 刘?心 ,
1982)。在长期的演化过程中 , 适应了不断旱化、
寒化的生境。新疆沙冬青垂直分布范围在 1 800
～2 700 m (潘伯荣等 , 1992 ) , 自然分布区极端
低温可达零下 29 .3℃。它具有一定的抗寒结构
(周宜君等 , 2001) , 叶肉细胞中也具有一种高密
度的内含物 (韩善华等 , 1994) , 能够使沙冬青
在这种低温气候条件下正常越冬且保持常绿。
费云标等 (2000) 已经分离纯化出了同属中
的另一种植物蒙古沙冬青 ( Ammopiptanthus mon-
glicus) 冬季叶片中的抗冻蛋白 , 并测定了热滞
活性 : 当抗冻蛋白浓度为 20 mg?mL 时 , THA 为
0 .9℃。新疆沙冬青作为同一属内的近缘种植物 ,
是否也具有类似的抗冻生物活性物质———抗冻蛋
白 , 目前尚无相关研究报道。探讨新疆沙冬青在
低温胁迫条件下能否产生具有热滞活性的抗冻蛋
白 , 对于进一步认识新疆沙冬青的进化与适应机
制具有重要理论意义。
1 材料与方法
1 .1 材料
所用的新疆沙冬青 ( Ammopiptanthus nanus) 叶片材
料于 2004 年 12 月采自于中国科学院吐鲁番沙漠植物园
内的 10 年生植株。原植物产地为新疆乌恰县。从 3～5
株样株的顶部、中部和下部随机采集叶片并混匀 , 用液
氮冷藏运回 , 保存于零下 80℃备用。
1 .2 方法
1 .2 .1 样品的处理 将 100 g新疆沙冬青叶片配合液氮
用搅拌机打磨至粉状 , 加入 3 倍体积 pH 8 .6 的缓冲液
(12 mmol?L Tris-HCl , 0 . 1 mol?L NaCl , 0 . 1 mmol?L EDTA , 1
mmol?L PMSF) 混匀 , 于 4℃ , 25 000 r?min, 离心 30 min,
取上清液 , 超滤脱脂。
1 .2 .2 蛋白质组分的分离 采用美国 Bio-Rad公司的双
流速层析系统 , 将脱脂后的样品用 DE-52 离子交换柱进
行层析分离。上柱前用 pH 8 . 6 的缓冲液 ( 10 mmol?L
Tric-HCl , 100 mmol?L NaCl, 0 .1 mmol?L EDTA) 平衡柱子 ,
以 0 .6 ml?min 的流速上样 , 然后用 pH 8.6 , 50 mmol?L
Tris-HCl, 50 mmol?L Tris, 2 mol?L NaCl 进行梯度洗脱。
NaCl 的梯度洗脱浓度依次为 : 0 %～10 % , 10% , 10 %～
30% , 30 % , 30%～60% , 60% , 100%。收集各洗脱峰 ,
脱盐后冷冻干燥。
1 .2 .3 热滞活性的测定 用差示扫描量热法 (DSC) 测
定样品的热滞活性 , 所用仪器为美国 TA 公司生产的
Q100 差示扫描量热仪 , 分析软件采用仪器专用分析软件
Universal Analysis 2000。
取 20 mg?mL 的沙冬青蛋白样品 5μL 注入铝样品盘 ,
以空盘作为参比。先以 1℃?min的速率使样品由室温降
至 - 20℃ , 平衡 15 min, 样品结冰固化 , 再以 1℃?min的
速率升温至 10℃ , 从样品熔融峰上得到样品的熔点 Tm
和熔融焓ΔHm。然后以 1℃?min的速率从 10℃降温至 -
20℃ , 平衡 15 min, 再以 1℃?min的速率升温至 Th (样品
熔融峰所涵盖温度区间的某一温度 ) , 平衡 15 min, 使样
品处于部分熔融状态 , 再以 1℃?min 的速率降温至 -
20℃ , 得到融化部分再次冻结时的起始温度 T0 和焓ΔHf。
改变 Th , 重复实验。用牛血清白蛋白 ( BSA ) 和双蒸水
(ddH2 O) 作对照。
1 .2 .4 抗冻蛋白的 SDS-PAGE 电泳分析 用 SDS-PAGE
电泳 (中国科学院上海药物研究所 , 1983 ) 分析经热滞
活性测定后具有热滞活性的蛋白质组分 , 分离胶浓度为
10% , 采用北京赛百盛基因技术有限公司的标准蛋白质
PRO-STAINTM MarkerⅠ作标准 , 测定蛋白质的分子量。
2 结果与分析
2 .1 DE-52 分离各个蛋白质组分
经 DE-52 离子交换柱层析 , 收集得到 18 个
洗脱峰 ( 图 1 ) 。以水为空白 , 牛血清白蛋白为
对照 , 考马斯亮蓝染色 , 用紫外 - 可见分光光度
计 ( DU800 Beckman coulter) 进行全波长扫描 ,
得知所有洗脱峰中有 5 个洗脱峰为非蛋白峰 ( 峰
1、2、3、4、18) , 从而初步分离出了新疆沙冬
青叶片中的各个蛋白质组分。
图 1 DE-52 离子交换柱层析
1 . pH 变化 ; 2 . NaCl 浓度变化 ; 3 . 蛋白分离
Fig . 1 DE-52 ion-exchange chromatography of antifreeze proteins
1 . the changeof pH ; 2 . the change of NaCl% ;
3 . the separation of the proteins
252 云 南 植 物 研 究 29 卷
2 .2 ddH2 O、BSA、AFP 的冻结—融化曲线
图 2 给出了 ddH2 O、BSA 溶液和 AFP 溶液冻
结—融化过程的热流—温度曲线 , 并出现过冷冻
结峰。它们的熔点 Tm 和熔融焓ΔHm 值见表 1。
2 .3 ddH2 O 的 DSC 热流曲线
取 5 mg的 ddH2 O 作为抗冻蛋白溶液的对照进
行 DSC 实验。当停留温度 (Th ) 取值分别为: -
1.26℃ , - 1.22℃ , - 1.2℃ , - 1.17℃ , - 1 .14℃时 ,
融化部分又再次冻结的热流 - 温度曲线见图 3 (A)。
由图 3 (A) 可见 , 随着 Th 的升高 , 再次冻
结峰的面积逐渐增大 , 即部分熔融体系中融化量
逐渐增大 , 则冰晶核的含量逐渐减少。随着降温 ,
已融化部分立即重新结冰 , 放热峰曲线平滑 , 没
有冻结滞后的现象 , 可见双蒸水没有热滞效应。
2 .4 BSA 的 DSC 热流曲线
取 5 mg 20 mg?mL 的 BSA 溶液作为抗冻蛋白
溶液的对照进行 DSC 实验。当停留温度 ( Th )
取值分别为 : - 1.61℃ , - 1 .52℃ , - 1.42℃ , -
1.34℃ , - 1. 28℃ , - 1.22℃时 , 融化部分又再次冻
结的热流 - 温度曲线见图 3 ( B)。
由图 3 ( B) 可见 , 随着 Th 的升高 , 再次冻
结峰的面积逐渐增大 , 即部分熔融体系中融化量
表 1 ddH2 O、BSA 和 AFPs 的熔点 ( Tm ) 和熔融焓 (ΔHm )
Table 1 The melting temperature and melting enthalpy
of ddH2 O, BSA and AFPs
样品 Sample 双蒸水 牛血清白 抗冻蛋
( mg) ddH2 DO 蛋白 BSA 白 AFPs
熔点 Tm ( ℃ ) - 1 ?. 18 - 1 ?. 42 - 3 .84
熔融焓ΔHm ( J?g) 289 !. 7 261 6. 2 224 7. 1
图 2 ddH2 O、BSA 溶液和 AFP 溶液的冻结—融化曲线
Fig . 2 The curveof the freezing and melting of ddH2 O,
BSA solution and AFP solution
图 3 DSC 热流曲线
A . ddH2 O的 DSC 曲线 ; B . BSA 的 DSC 曲线 ; C . 无抗冻活性的蛋白组分的 DSC 曲线 ; D . 新疆沙冬青 AFP 的 DSC 曲线
Fig . 3 DSC curve A . DSC curve of ddH2 O devoid of AFP; B . DSC curve of BSA solution devoid of AFP ; C . DSC curveof protein
solution devoid of AFP; D . DSC curve of the AFP isolated from Ammopiptanthus nanus
3522 期 尉姗姗等 : 新疆沙冬青抗冻蛋白的提取分离及其热滞活性测定
逐渐增大 , 则冰晶核的含量逐渐减少。随着降温 ,
已融化部分立即重新结冰 , 放热峰曲线平滑 , 没
有冻结滞后的现象 , 可见 BSA 也没有热滞效应。
2 .5 无抗冻活性的蛋白组分的 DSC 热流曲线
层析分离出的一些蛋白组分的 DSC 热流曲线
与双蒸水和BSA 的 DSC 曲线相似 , 随着 Th 的升高 ,
再次冻结峰的面积逐渐增大 , 冰晶核的含量逐渐减
少。随着降温 , 已融化部分立即重新结冰 , 放热峰
曲线平滑 , 没有冻结滞后的现象 , 因此这些蛋白没
有热滞效应 , 不具抗冻活性 (图 3 (C))。
2 .6 新疆沙冬青抗冻蛋白的 DSC 热流曲线
层析分离出的其中一组蛋白组分的停留温度
(Th ) 取值分别为 : - 3.51℃, - 3.01℃, - 2.51℃,
-2.41℃ , - 2.31℃ , - 2.26℃, - 2.21℃ , - 2.16℃时,
融化部分又再次冻结的热流—温度曲线见图 3 (D)。
这一组分与其他组分明显不同。随着 Th 的
升高 , 部分熔融体系中融化量逐渐增大 , 则冰晶
核的含量逐渐减少。随着降温 , 已融化部分再次
结冰 , 当 Th = - 3.01℃时 , 放热峰曲线平滑 , 此时
体系中冰核含量仍然较多 , 当 Th 升至 - 2 .31℃ , -
2.26℃ , - 2. 21℃ , - 2.16℃时 , 放热峰曲线不再平
滑 , 而是逐渐出现冻结滞后的现象 , 可见 , 该蛋
白组分中含有表现热滞活性的抗冻蛋白。此时体
系中冰核含量较少 ( ≤5% ) , THA 也随着冰核含
量的减少而逐渐增大 , THA 与冰核含量呈现出
了一定的函数关系 ( 表 2 )。说明只有当体系内
冰晶核含量较少时 , AFPs 才能起到抑制冰晶生
长的作用。
表 2 AFPs 溶液的停留温度 (Th ) 、再次冻结起始温度 ( T0 )、
冰核含量 (Nuclei) 和热滞活性 ( THA)
Table 2 The hold temperature ( Th )、onset temperature (T0 ) 、
percent icenuclei and THA of AFPs solution
停留温度 再次冻结起始 热滞活性 冰核含量
Th ( ℃ ) 温度 T0 ?(℃ ) THA (℃ ) Nuclei ( % )
- 4 ?. 51 - 4 .55 0 .04 85 5. 71
- 4 ?. 01 - 4 .04 0 .03 79 5. 49
- 3 ?. 51 - 3 .55 0 .04 71 5. 12
- 3 ?. 01 - 3 .05 0 .04 58 G. 3
- 2 ?. 51 - 2 .68 0 .17 31 5. 06
- 2 ?. 46 - 2 .75 0 .29 16 5. 64
- 2 ?. 41 - 2 .76 0 .35 12 5. 54
- 2 ?. 36 - 2 .72 0 .36 8 5. 7
- 2 ?. 31 - 2 .67 0 .36 5 . 09
- 2 ?. 26 - 2 .68 0 .42 2 . 41
- 2 ?. 21 - 2 .62 0 .41 0 . 85
- 2 ?. 16 - 2 .62 0 .46 0 . 36
2 .7 SDS-PAGE 测定抗冻蛋白分子量
用 SDS-PAGE 检测经热滞活性测定后具有抗
冻活性的蛋白质组分 , 考马斯亮蓝染色显示表
明 , 具有抗冻活性的该组蛋白组成成分单一 , 分
子量约为 119 .24 kDa ( 图 4) 。
图 4 具有抗冻活性的蛋白组分的 SDS-PAGE 电泳考染图谱
M . 标准蛋白 ; 样品 . 具有热滞活性的蛋白质
Fig . 4 SDS-PAGE of AFP from Ammopiptanthus nanus
M: PRO-STAINTM MarkerⅠ; Sample: the AFP from Ammopiptanthus nanus
3 讨论
低温可以引起植物细胞出现结冰的现象 , 从
而破坏细胞结构。有研究认为 , 抗冻蛋白是一种
复杂而高效的生物活性物质 , 能够降低溶液的冰
点 , 降低冰晶的形成速率 , 使结冰伤害降低到最
小程度 ( 费云标等 , 1992) , 保护细胞结构。新
疆沙冬青在零下 29 .3℃的条件下 , 仍然能正常
越冬保持常绿。鉴于前人对植物抗冻蛋白的研究
(Deborah 等 , 2005; 费云标等 , 2000; Huang等 ,
1995; Griffith 等 , 1992 ) , 我们推断 , 新疆沙冬
青也应该具有类似的抗冻活性物质。
热滞活性是判断抗冻蛋白的重要指标 , 抗冻
蛋白的活性取决于热滞活性的大小 ( 魏令波等 ,
1999) 。通过测定冬季分离出的新疆沙冬青叶片
蛋白组分 , 结果表明 , 当蛋白浓度为 20 mg?mL
时 , 其热滞活性 ( THA) 为 0.46℃。此时冰晶核
含量仅有 0.36% , 表明这组蛋白对植物细胞中
冰晶的生长起到了一定的抑制作用 , 降低了植物
的冰点 , 使新疆沙冬青在严冬季节免遭冰晶的伤
害 , 起到了抗冻保护作用。因此判断 , 此洗脱峰
452 云 南 植 物 研 究 29 卷
中的蛋白组分是 AFPs。经 SDS-PAGE 电泳纯度检
测 , 该 AFP 组分单一 , 其分子量为 119 .24 kDa。
经比较发现 , 本研究中的新疆沙冬青叶片抗
冻蛋白的热滞活性远远低于鱼 ( 0 . 5～1 .5℃ ) 和
昆虫 (3～6℃ ) ( 卢存福等 , 1998 ) 抗冻蛋白的
热滞活性 , 与同一属的蒙古沙冬青 ( 抗冻蛋白蛋
白浓度 20 mg?mL 时 , THA 为 0 .9℃ ) ( 魏令波等 ,
1999) 相比 , 热滞活性也较低。分析可能的原因
有两点 : 其一 , 植物在迁地保护的过程中 , 由于
生境的变化和有意识或无意识的人工选择 , 在表
型、抗性和生活史等方面会发生可以遗传的改变
(康明等 , 2005) 。本次研究材料取自吐鲁番沙漠
植物园长时间迁地保护条件下 ( 海拔 - 95～ - 76
m, 冬季平均最低气温零下 9 .5℃ , 极端低温零
下 28℃ ) 的新疆沙冬青 , 蛋白在表达过程中其
抗冻蛋白的某些特性可能发生了变化 , 导致了热
滞值的相对偏低 ; 其二 , 在第三纪早期 , 沙冬青
分布于古地中海沿岸 , 是第三纪的古热带气候条
件下孕育发展起来的喜温嗜湿类群 , 经历了地质
历史的变迁和伴随而来的气候由潮湿温热到现在
的干旱寒冷 , 不仅从形态上发生适应性的演化 ,
其遗传特性方面也随之相适应 , 在长期的演化中
获得了抗旱抗寒的特性 ( 刘果厚 , 1998; 刘玉红
等 , 1996) 。本次测定的新疆沙冬青抗冻蛋白的
热滞活性低于蒙古沙冬青 , 说明新疆沙冬青的抗
冻性比蒙古沙冬青弱 , 在进化过程中蒙古沙冬青
更具有对低温逆境的适应能力。因而低的 THA
表明了新疆沙冬青相对的原始性。这一点与前人
对两种沙冬青的核型及酯酶同工酶的研究结果相
吻合 ( 魏岩和石庆华 , 1995; 刘玉红等 , 1996 )。
〔参 考 文 献〕
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