全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·综述与专论· 2008年第5期
收稿日期:2008-04-14
基金项目:淮海工学院引进人才科研启动基金项目(KK04017、KK01073)
作者简介:陈国强(1978-),男,硕士,助教,研究方向为植物基因工程与分子生物学;E-mail:chengq113@163.com
通讯作者:王萍(1957-),女,博士,教授,研究方向为植物基因工程与分子生物学
盐地碱蓬(Suaedasalsa)又名盐蓬、盐吸、碱吸、
海英菜、黄须菜、蓬子菜和盐蒿等,属藜科碱蓬属一
年生多汁草本盐生植物,普遍生于盐土或盐渍化土
壤、湖滨、河岸和沿海地带,是典型的盐碱地指示植
物。全株光滑无毛,生长初期为鲜红色,逐渐转为根
茎部红色,上部茎叶绿色。广泛分布于我国东北、内
蒙古、苏、浙、鲁、陕、晋、冀等地[1,2]。盐地碱蓬更是
在江苏沿海一线,从苏鲁交界的绣针河口到长江口
1000多公里的平原海岸淤滩上的优势物种 [3]。它
生物量大,富含多种营养及药用成分,是一种可做
饲料、医药、食品等的极好的野生植物资源,蕴涵着
巨大的生态、经济和社会效益[4~13]。
上世纪 90年代以来,对盐地碱蓬的研究主要
集中在对其营养成分组成的分析[3~9]、活性物质的
分离提取[10~13]、人工栽培[3]、组织培养[14~16]等方面。进
入 21世纪后,对盐地碱蓬的研究中心逐步转移到
分子水平。它抗逆性强,可耐寒、耐旱、耐涝、耐盐碱
等,尤以耐盐最为突出,因而是研究植物耐盐机制
的极好的基因库。
1 与氧化胁迫相关的基因
土壤中过高的盐浓度会造成植物渗透胁迫和
离子失衡,以及由此导致的次级伤害如氧化损伤
等。因此,植物耐盐能力的决定分子主要包括两部
分,一是可诱导盐适应的效应分子,包括调节离子
均衡、渗透保护物质合成、清除自由基、水分转运及
协调远距离反应的转导蛋白等;一是调控效应分子
的调节分子,主要是信号通路元件,位于效应分子
的上游,包括转录因子及信号级联系统中的激酶,
如依赖 Ca2+的蛋白激酶、蛋白磷酸化酶、肌醇激酶
等[17]。
Zhang等[18]最早构建了盐地碱蓬的 cDNA表达
文库。其后与清除活性氧毒害相关的基因首先被克
盐地碱蓬耐盐相关基因克隆研究进展
陈国强 王萍
(淮海工学院海洋学院,江苏省海洋生物技术重点实验室,连云港 222005)
摘 要: 盐地碱蓬是一种生长于盐碱地和海滨沙滩的盐生植物,富含氨基酸、维生素、矿物质等,极具开发价值。由
于其具有很强的耐盐性,人们日益重视其耐盐机理的研究。目前对其耐盐机理的研究已经进入到耐盐基因的克隆、结构
分析、功能研究等方面。综述了近年来盐地碱蓬与耐盐相关的基因克隆、结构及功能分析等方面的研究进展。
关键词: 盐地碱蓬 盐胁迫 基因克隆
ResearchonAdvancementofSaltTolerantGenesinSuaedasalsa
ChenGuoqiang WangPing
(OceanScienceColege,JiangsuKeyLaboratoryofMarineBiotechnology,HuaihaiInstituteof
Technology,Lianyugang222005)
Abstract: Asatypicalhalophytelivinginsalinaandseashore,Suaedasalsaposeseshighvalueinuse,asitisrich
inaminoacid,vitaminandmineral.Duetosignificantresistancetosalt,theresearchoncloning,structureanylasis,and
functionrelevanttosalttolerancehavebeenatractedmuchatentions.Inthisreview,researchongenecloning,structure
andfunctionanalysisofsalt-resistancegenesinSuaedasalsa,werediscused.
Keywords: Suaedasalsa Salt-resistance Genecloning
2008年第5期
隆,主要有谷胱甘肽转移酶基因(GST)[19]、抗坏血酸
过氧化物酶基因 (APX)[20]、两个过氧化氢酶基因
(CAT)[21]、过氧还蛋白Q基因(SsPrxQ)[22]等。Northern
杂交表明,受盐胁迫的影响,与清除活性氧自由基
有关的关键酶基因的表达量大大增加,相应的酶活
测定也显示各自的酶活都有显著提高。说明可清除
氧自由基的抗氧化酶类的表达,能起到缓解盐胁迫
的作用。将盐地碱蓬谷胱甘肽转移酶基因(GST)通
过农杆菌介导法转移到模式植物拟南芥后,获得的
转基因拟南芥在盐胁迫条件下,其生物量较野生型
拟南芥高,谷胱甘肽含量则明显提高[23]。说明过量表
达 GST基因可提高转基因植株在盐胁迫条件下生
长。谷胱甘肽转移酶除了能提高植物耐盐性外,还
参与其他胁迫的调节。将盐地碱蓬 GST单基因和
GST+CAT1(catalase1)双基因通过农杆菌介导法导
入低温敏感型水稻 (OryzasafivaL.)品种中花 11
号,并对 T4代转基因水稻幼苗的抗低温特性进行
了分析,结果发现低温处理后,转基因植株的 GST
和 CAT活性都比对照组高,光合系统 I(PSI)最大
光化学效率也高于非转基因对照,而细胞膜透性则
低于对照组。说明转基因水稻幼苗谷胱甘肽转移酶
和过氧化氢酶的表达提高了植物对低温胁迫的抗
性[24]。而含有源自盐地碱蓬 SsPrxQ(过氧还蛋白 Q)
基因的拟南芥在低温及盐胁迫条件下,植株的生长
状况明显优于对照组[25]。说明过氧还蛋白的介入也
提高了植株对胁迫的耐受性。
2 与渗透平衡相关的基因
植物细胞在盐、干旱等非生物胁迫下,可积累
不同种类的小分子渗透调节物质,维持渗透平衡,
保护大分子物质及蛋白质的完整性及内环境的稳
定。分离与鉴定其合成相关基因并对其进行遗传操
作可提高植物对高盐的耐受能力。因此,除了与盐
适应有关的清除氧自由基的抗氧化酶基因陆续从
盐地碱蓬中被克隆外,许多渗透调节物质合成基因
也逐步从盐地碱蓬中分离。王萍萍等[26,27]从盐地碱
蓬中分别克隆了肌醇-1-磷酸合成酶基因(INPS)和
△1-二氢吡咯-5-羧酸合成酶基因(SsP5CS)。这 2个
基因的表达产物分别是肌醇合成和脯氨酸合成中
的关键酶。序列分析表明,两者分别与已报道的荒
漠草木植物冰叶日中花(Mesembryanthemumcrystal
inum)的 INPS基因及 P5CS基因同源性最高。盐胁
迫时,两者在叶中的转录水平明显增加,相比对照
组,脯氨酸含量也显著增加,其渗透调节能力也逐
渐增强。因此,可以推测这两个合成酶在保护盐地
碱蓬不受盐胁迫伤害中起到重要作用。王三红等[28]
则根据辽宁碱蓬(Suaedaliaotungensis)甜菜碱合成
关键酶、甜菜碱醛脱氢酶(BADH)和胆碱单加氧酶
(CMO)序列设计引物,克隆了盐地碱蓬的甜菜碱醛
脱氢酶基因 SsBADH和 SsCMO。分别与辽宁碱蓬的
这 2个基因进行比对,发现前者的序列一致,后者
的同源性高达 99%,推导的氨基酸序列则完全相
同。构建的植物表达载体中,SsBADH和 SsCMO基
因通过口蹄疫病毒 FMDV的 2A序列融合在一起。
通过农杆菌介导将融合基因转导烟草中,转基因烟
草比对照表现出较强的耐盐性。
3 与离子平衡相关的基因
植物要适应盐害,除了要建立盐胁迫下的渗透
平衡外,还须建立合适的离子平衡。Na+离子是造成
盐害的主要离子,为了降低胞质内的 Na+离子浓
度,盐生植物采取的策略主要是质膜外排和液泡区
隔化。而 Na+离子的液泡区隔化有赖于液泡膜 Na+/
H+反向转运蛋白的活性。现已有液泡膜 Na+/H+反向
转运蛋白基因(SsNHX1)[29]、液泡膜 H+-ATPaseB亚
基基因[30]、液泡膜 H+-ATPaseH亚基基因[31]等从盐
地碱蓬中克隆。研究表明盐地碱蓬液泡膜 Na+/H+反
向转运蛋白基因的开放阅读框有 1665bp,编码 553
个氨基酸,氨基酸序列与水稻中的 AtNHX1和
OsNHX1有很高的同源性,其中含有 3个糖基化位
点,12个与预期相符的跨膜片段以及 1个 Na+离子
竞争性抑制剂利尿药阿米洛利的结合结构域
(amiloride-bindingdomain)。液泡膜 H+-ATPaseB亚
基基因的开放阅读框有 1470bp,编码 489个氨基
酸,其中含有一个保守的 ATP结合位点。液泡膜 H+
-ATPaseH亚基基因的开放阅读框为 1398bp,编码
465个氨基酸残基。在盐胁迫条件下,液泡膜 H+-
ATPaseB亚基、H亚基和 c亚基基因的协同表达可
增加 H+-ATPase数量,同时提高液泡膜 H+-ATPase
活性,为盐地碱蓬叶片 Na+离子的液泡区隔化提供
动力,最终提高了植株的耐盐性。
将盐地碱蓬 SsNHX1基因和拟南芥液泡膜焦
陈国强等:盐地碱蓬耐盐相关基因克隆研究进展 19
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第5期
磷酸酶(H+-PPase)基因(AVP1)同时转入拟南芥中
进行表达,结果发现在正常生长条件下,转基因植
株与野生型植株的生长无明显差异[17]。在盐胁迫条
件下,两者的生长都受到一定程度的限制,前者的
生长明显优于后者。外源基因的表达可提高种子萌
发率,增加鲜重和干重,维持较高的细胞质 K+/Na+
比和较大的净光合速率,增加了脯氨酸含量,降低
渗透势。进一步证实离子区隔化在植物抗盐方面的
重要作用。赵淑青[32]利用农杆菌介导法将盐地碱蓬
SsNHX1基因导入番茄。低盐条件下,转基因植株和
野生型的相比,长势没有差异;但高盐条件下,转基
因株系长势明显好于野生型植株,且干重、鲜重在
不同盐浓度下都高于野生型植株。同时转基因植株
细胞质中的 K+/Na+比较高,可积累更多的有机渗
透保护物质,如脯氨酸含量和可溶性糖等,叶绿素
的含量也均高于野生型。表明了盐胁迫下转基因番
茄可能利用 Na+区隔化进入液泡的策略,降低胞质
Na+含量,维持较高的 K+含量,并保持较高的 K+/
Na+比,减小 Na+对膜的损伤,使植株免受过多的伤
害,提高了自身的耐盐能力。
有研究表明在盐胁迫时与除了 Na+/H+反向转
运蛋白参与离子运输外,高亲和 K+转运载体(high-
afinityKtransporter,HKT)类蛋白也参与了离子运
输。邵群等[33]从盐地碱蓬中克隆了一种主要存在于
质膜上的高亲和 K+转运载体基因(HKT1)。在 K+饥
饿及盐胁迫条件下,HKT1基因的表达量明显增加,
表明 SsHKT1基因在盐地碱蓬的 K+吸收特别是高
盐条件下 K+营养中有重要作用。
4 与胁迫信号转导相关的基因
受到盐胁迫后,植物的许多抗性蛋白质会表
达,如上述提到的调节离子均衡、渗透保护物质合
成、清除自由基、水分转运等的效应分子。除此之
外,在信号传导及基因表达过程中起调节作用的蛋
白质基因也会表达,相关的信号转导通路包括 SOS
(saltoversensitive)信号通路、蛋白激酶通路、磷脂
酶通路、ABA依赖通路等[17]。盐地碱蓬在信号转导
方面的研究较少,目前已分离出一个参与蛋白激酶
途径的基因,它是MAP激酶激酶基因(SsMAPKK)[34]。
在低温、干旱及高盐胁迫下,转录水平均有升高,且
其表达不依赖 ABA。另外,在盐地碱蓬中与 ABA合
成有关的关键酶-9-顺式-环氧类胡萝卜素二加氧酶
的编码基因(NCED1)也已被克隆[35]。研究表明盐、
甘露醇和高温均可诱导此基因的表达。值得注意的
是,转入 SsNCED1基因的拟南芥对盐、干旱等胁迫
的耐受性并没有增加,转基因植株种子的萌发也没
有延迟。虽然杂交试验表明,外源基因已经整合到
宿主基因组中,并在转录水平上能检测到,但种苗
和种子 ABA的含量并未增加,说明在蛋白水平上
转基因植株与对照组没有差异,推测外源基因可能
在翻译水平上被沉默了。
5 展望
作为盐碱地上的先锋植物,盐地碱蓬是育种工
作的一个利用潜力巨大的基因库。因为,它抗逆性
强,特别是在抗盐抗旱方面。目前,已从盐地碱蓬中
克隆了多个与耐盐有关的基因(表 1)。由于它含有
众多的抗盐相关基因,因此,可采用基因工程的方
式将其导入到其他植物中去,以提高后者的抗盐能
力。对于开发盐碱地及发展沿海滩涂农业具有十分
重要的作用。
目前已有部分源自盐地碱蓬的抗盐基因导入
到拟南芥[17,23,25,35]、水稻[24]、番茄[32]中,且多数都表现
出预期的抗盐、抗旱、抗寒等特性。但这些进展都只
停留在实验室阶段,导入的外源基因在宿主基因组
中如何整合、表达和调控也都缺乏有效的了解。至
于外源基因的表达与转基因植株的抗逆性两者间
的关系也需要进一步探索。要解决上述问题,就需
表 1 盐地碱蓬已克隆的部分耐盐相关基因
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2008年第5期
要真正弄清植物抗逆境的复杂机理及相关基因的
表达调控机制,这样才能有的放矢,采用合适的目
的基因进行植物基因工程,并顺从基因本身的调控
机制发挥其抗逆境的作用。
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