全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLO GY　BULL ETIN 2009年第 9期
绿色糖单孢菌 2木素过氧化物酶的发酵工艺研究
杨暖　丁梦璇　汪文静　谢响明　何晓青　赵国柱　李志茹
(北京林业大学生命科学与技术学院 , 北京 100083)
　　摘 　要 : 　本研究以一株中度耐热耐碱放线菌 ———绿色糖单孢菌 (Saccharom onospora virid is)为研究对象 ,用 16 L发酵罐
对该菌进行了木素过氧化物酶 ( lignin peroxidases, L iP)的诱导发酵 ,确定了最适的产酶工艺条件 :接种量为 10% , C /N为 1∶3,
搅拌速度为 250 r/m in,通气量为 5 L /m in,通过控制通气量和调整搅拌转速 ,使溶氧维持在 35%以上 ,此条件下绿色糖单孢菌
较摇瓶实验提前将近 24 h达到产酶高峰 ,酶活最高可达 0. 41 U /m l;同时在发酵罐中测定该菌株的生长曲线和代谢曲线以确
定其发酵代谢规律。
关键词 : 　放线菌 　绿色糖单孢菌 　木素过氧化物酶 　发酵
Studies of Fermentation Conditions of L ign in
Peroxidases from Saccha rom onospora viridis
Yang Nuan　D ing Mengxuan　W ang W enjing　Xie Xiangm ing　He Xiaoqing　Zhao Guozhu　L i Zhiru
( College of B iological Science and B iotechnology, B eijing Forestry University, B eijing 100083)
　　Abs trac t: 　 In a 16 L fermentor, p roduction conditions of L iP from Saccharom onospora virid is were investigated. The op timal oper2
ation conditions were determ ined as follows, fermentor agitation rate 250 r/m in, ventilation amount 5 L /m in, the seeded volume 10% ,
corresponding to C∶N ratio of 1∶3. The maximum enzyme activity could reach 0. 41 U /m l at 96 h while dissolution oxygen (DO) level
maintained higher than 35% by enhancing aeration and changing agitation rate. The growth curve and metabolism curve of this strain
was also determ ined in the fermentor.
Key wo rds: 　Actinomyces　Saccharom onospora virid is　L ignin Peroxidases　Fermentation
收稿日期 : 2009206209
基金项目 :国家自然科学基金项目 (30870028)
作者简介 :杨暖 ,男 ,硕士研究生 ,研究方向 :环境微生物 ; E2mail: yang0729@ sohu. com
通讯作者 :谢响明 , Tel: 010262336074, E2mail: xiexiangm@bjfu. edu. cn　　木素过氧化物酶 ( lignin peroxidases, L iP)是1983年首次从白腐菌 [ 1 ]中发现的一种含有血红素的木素降解酶 ,具有广泛的底物范围及对底物氧化的高度非特异性 ,在木素和小分子污染物的生物降解过程中起着关键作用。因此 , L iP在充分利用自然资源、保护生态环境以及进行生物修复等方面具有十分重要的意义。目前国内外研究重点仍主要局限于白腐真菌(white rot fungi)来源的 L iP,但由于发酵周期长 ,培养及要求高 ,酶活力低 ,目前尚未达到工业化生产要求 [ 2 ]。而细菌、放线菌具有营养条件简单、不易污染、易培养等特点 ,所分泌的胞外 L iP在纸浆生物漂白等方面具有独特的优势和潜力 ,开始得到研究者 的关注 [ 3 ]。关于绿色糖单孢菌产生 L iP的研究在国内外只有零星报道 ,但有关于其发酵罐条件下发酵工艺的研究 ,国内尚无报道。本研究拟以摇瓶发酵条件为基础 ,对绿色糖单孢菌 L iP发酵罐条件下最佳产酶工艺进行研究探索 ,为开发一种在造纸、环保等领域有重要用途的新的木素处理酶制剂 ,以及进一步构建工程菌种 ,大规模工业化生产奠定基础。1　材料和方法111　材料11111　菌种 　菌株绿色糖单孢菌 ( Saccharom onos2pora virid is) Nonmura&Ohara 4. 1089购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心。11112　培养基 　斜面培养基 : 桑特斯培养基 ( S
2009年第 9期 杨暖等 :绿色糖单孢菌 2木素过氧化物酶的发酵工艺研究
TS) ,琼脂 2% ;种子培养基 :桑特斯培养基 ;液体发
酵培养基 :桑特斯培养基 ,麦草浆 1. 5%。
112　方法
11211　种子培养 　从新鲜斜面上取两环绿色糖单
孢菌 ,接种到 100 m l (250 m l的三角瓶 )种子培养基
中 , 45℃下摇床 120 r/m in振荡培养 3 d至对数生长
期 ,镜检无杂菌污染后 ,制成种子液。
11212　发酵罐放大培养产酶 　按一定接种量接入
种子发酵液 ,初始 pH8. 0,培养温度 45℃。发酵过
程中 pH值和 DO (溶氧 )值由 pH电极和溶氧电极
在线监测 ,研究不同的发酵工艺对产酶的影响。
11213　接种量对菌体产酶的影响 　分别加入不同
体积比例 ( 5%、10%、15% )种子液进行发酵 ,以期
探究接种量对菌体产酶的影响。
11214　发酵培养基中碳氮源比例对菌体产酶的影
响 　以葡萄糖为碳源 ,蛋白胨为氮源 ,其中葡萄糖与
蛋白胨的总含量为 2% ,配比分别按照 1∶1, 1∶2,
1∶3, 3∶1及 2∶1,其它培养发酵条件不变 ,比较不同
C /N条件下菌体产酶的情况。
11215　搅拌速度对酶活的影响 　设定发酵罐搅拌
速度分别为 150 、250和 350 r/m in,其它培养发酵条
件不变 ,以此探究不同搅拌速度对菌体发酵产酶的
影响。
11216　通气量对酶活的影响 　在 16 L发酵罐中 ,
采用最适产酶培养基 ,固定搅拌速度为 250 r/m in,
将通气量分别设定为 2. 5、5. 0和 7. 5 L /m in进行产
酶试验 ,分析发酵过程中不同通气量对产酶活性的
影响。
11217　溶氧 (DO)及 pH变化 　以最佳发酵工艺条
件为基础 ,在线测定发酵液中溶氧 (DO )及 pH值随
发酵进程发生的变化。
11218　绿色糖单孢菌生长曲线及菌液 660 nm处吸
光度的测定 　在发酵罐培养过程中 ,接种后每 6 h
取样 ,至发酵结束。以同条件下未接种培养液为空
白对照 ,培养时间为横坐标 ,菌液的 OD660吸光度值
为纵坐标绘制绿色糖单孢菌在发酵罐中的生长
曲线。
取定量培养液在 3 000 r/min条件下离心 10 min,
倾去清液 ,用蒸馏水洗涤菌丝体 2次 ,于 105℃下烘
干至恒重 ,测定绿色糖单孢菌在发酵罐中不同发酵
时期菌体浓度。
11219　绿色糖单孢菌胞外蛋白表达及产 L iP的时
程分析 　在发酵罐培养过程中 ,接种后每 6 h取样 ,
至发酵结束。测定 L iP酶活性以及蛋白含量 ,分析
酶活及总蛋白量随时间的变化规律及最大产酶高
峰。以培养时间为横坐标 ,粗酶液中木素过氧化物
酶活性和总蛋白量为纵坐标绘制绿色糖单孢菌木素
过氧化物酶及总蛋白在发酵罐中的生产曲线。
112110　木素过氧化物酶活性的测定 　将发酵完毕
的液体发酵培养基在 4℃下 8 000 g离心 20 m in,除
去菌体 ,上清液即为粗酶液待测酶活。按 Tuncer[ 4 ]
方法以 2, 42二氯苯酚 (2, 42DCP, 16 mM )为底物 ,在
1. 0 m l反应液中 ,依次加入磷酸缓冲液 ( 0. 1 M ,
pH7. 0)、42氨基替比林 ( 16 mM )和样品各 0. 2 m l,
混匀后 45℃预热 1 m in,迅速加入 0. 2 m l H2O2
(30% )启动反应 ,检测反应体系 1 m in内在 510 nm
波长光吸收的变化值。
酶活单位定义 :在上述条件下 ,每分钟增加一个
单位的吸光值所需要的酶量为 1 个酶活力单位
(U)。
112111　蛋白质含量测定 　采用 B radford 检测法
[ 5 ]
,以牛血清白蛋白作为标准 ,测定胞外蛋白浓度
变化。
2　结果与分析
211　发酵过程中接种量对菌体产酶的影响
在其他培养条件相同的情况下 ,加入不同比例
种子液进行发酵 ,结果如图 1所示。当接入菌液量
为培养基加入量的 10%时 ,菌体产酶量最高。接种
量为 5%时 ,由于发酵培养基中菌体浓度过低 ,因而
图 1　接种量对绿色糖单饱菌产酶的
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 9期
不利于菌体的大量繁殖 ,进而影响其产酶能力 ;相
反 ,接种量为 15%时 ,菌体大量繁殖 ,导致培养基中
氧气含量及营养物质迅速下降 ,菌体生长受到限制 ,
也不利于其产酶。
212　发酵培养基中碳氮源比例对菌体产酶的影响
碳氮比的大小不仅直接影响培养基的 pH值 ,
导致代谢途径和代谢产物发生变化 ,严重影响菌体
的生长和产酶 ,同时也容易造成原料的浪费。以不
同的碳氮比例进行发酵 ,结果表明 (图 2) ,在碳氮比
为 1∶3时 ,菌体的产酶量最高 ,比未优化前 (C /N为
1)相对酶活性高出近 70% ,说明该菌产酶与碳营养
的限制有关。
图 2　培养基中 C /N对绿色糖单饱菌产酶的影响
213　搅拌速度对酶活的影响
图 3所示为搅拌转速低于 160 r/m in时 ,菌液
溶氧性相对较低 ,致使菌体生长较差 ,相对搅拌转
速 250 r/m in条件下菌体延迟 16 h进入稳定期 ,严
重影响产酶时间。转速高于 340 r /m in时 ,菌体生
长相对较快 ,但同样会对菌丝体造成过大的剪切
力 ,也不利于产酶。故选择 250 r/m in为最适搅拌
转速 ,很好地改善发酵体系的溶氧情况 ,减少了不
图 3　搅拌速度对绿色糖单孢菌体产木素过氧化物酶的影响
必要的动力消耗及过多的强机械搅拌 ,从而避免了
过量的氧和剪切作用对菌体生长和酶活力产生不良
影响。
214　通气量对酶活的影响
发酵过程中 ,不同通气量对产酶影响的结果如
图 4所示 ,通气量为 2. 5 L /m in时 ,培养基中溶氧情
况相对较差 ,菌体生长缓慢 ,导致产酶时间延迟 ,酶
活性相对较低 ;当通气量增大到 5 L /m in,发酵罐内
溶氧值可维持在 35%以上 ,菌体生长较快较旺盛 ,
产酶高峰期也有所提前 ,酶活力提高 ;当通气量继续
增大到 7. 5 L /m in时 ,菌体产酶状况均无明显改善 ,
但发酵罐中泡沫很多。所以综合考虑 ,通气量选取
5 L /m in较为合适 ,此条件下 ,发酵罐内的溶氧值能
维持在 35%以上水平 ,既不会因通气量过低使溶氧
值迅速下降 ,对菌体的生长造成影响 ,使菌体代谢积
累 ,抑制酶的合成 ,又不会因通气量过高使发酵罐产
生过多泡沫。
图 4　通气量对绿色糖单孢菌体产木素过氧化物酶的影响
215　发酵过程中溶氧及 pH变化
由图 5可以看出 ,最适发酵条件下 ,由于绿色糖
单孢菌为好氧微生物 ,在生长过程消耗大量氧气 ,致
使发酵过程中溶氧参数 (DO )从培养开始一段时间
后持续明显下降。但适当的搅拌速度和进气量使
DO都保持在 35%以上 ,这基本保障了该菌株在好
氧性发酵产酶过程中细胞的快速生长繁殖以及酶产
品合成等菌体代谢活动对溶氧的需求。
发酵过程中发酵液 pH值变化大概可以分成 3
个阶段。在第一阶段可以看到 pH在逐渐降低 ,其
原因可能是由菌体生长过程中对氮源的消耗造成 ;
随着发酵时间的增加 ,菌体进行初级代谢、次级代
谢 ,胞外蛋白质迅速增加 ,导致 pH也逐渐上升 ;而
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在产酶末期 , pH及产酶量不再增加 ,延长产酶时间
可以发现 ,由于氮源的耗尽 ,菌体的死亡、自溶 ,大量
碱性物质的释放又导致 pH再次上升。
图 5　发酵过程溶氧及 pH值变化
216　发酵罐中绿色糖单孢菌菌体生长曲线及 OD660值
图 6结果显示 ,绿色糖单孢菌在发酵罐中经历
了大约 6 h的迟缓期后 ,很快进入对数生长期。但
随着菌体生长、营养物质消耗、代谢产物积累和
pH 等环境的变化 ,菌的生长速率逐渐降低 ,发酵
66 h后菌体进入稳定期 ,此时菌体浓度达到 19. 08
g /L。由图同时可以看出 ,菌液吸光值随时间的变
化趋势与菌液浓度一致 ,说明菌液浓度与吸光度
值存在一定的正相关关系。因此 ,可用菌液吸光
值替代绿色糖单孢菌的生长曲线 ,根据吸光度值
的变化判断菌液所处发酵阶段 ,准确掌握发酵时
间 ,此方法即简便又可减少人为误差 ,对大规模生
产意义重大。
图 6　菌体生长曲线及 OD660值
217　发酵罐中绿色糖单孢菌胞外蛋白表达及产 L iP
的时程分析
L iP是胞外酶 ,随着该酶的合成与分泌 ,酶液中
蛋白质浓度也随着酶活力的提高而增大。由蛋白质
浓度和酶活变化 (图 7)可知 ,绿色糖单孢菌在产 L iP
前分泌一些杂蛋白 ,产酶初期 ,该菌分泌的蛋白质
中 , L iP蛋白较少 ,比活力低 ,随着产酶时间的延长
其分泌的杂蛋白量逐渐减少 , L iP活性及胞外蛋白
质迅速增加。发酵开始后第 4天即达到最高峰 , 酶
活力达 0. 41 U / m l时 ,比活力提高到 1. 74 U / mg。
此后产酶量不再增加 ,趋于平稳并有下降趋势。延
长发酵时间到第 5天 ,比活力降低 ,原因可能是此时
处于产酶末期 ,菌体细胞自溶使更多的杂蛋白释放
出来 ,从而使比活力在产酶末期随着产酶时间的延
长而下降。
图 7　发酵罐条件下木素过氧化物酶
及蛋白表达量的时程分析
3　讨论
在该菌发酵过程中 ,对菌体生长及产酶时程分
析后初步断定绿色糖单孢菌株最佳产 L iP时间约为
培养后 96 h,并以此作为后期分离纯化 L iP的培养
时间。同时发现 ,该菌产酶时间与菌体生长时期不
同步 ,酶的产生要滞后于菌体增殖 ,属于滞后合成
型 ,即酶是在菌体繁殖期后才开始大量积累 ,且酶产
量与菌数是正相关 ,因此推测该菌株在次级代谢阶
段产生 L iP降解木质素 ,这与真菌产 L iP相同 ,而与
细菌类产酶情况不同。文献中报道细菌来源的木质
素降解酶合成时间是在细菌生长的对数期稳定期 ,
降解木质素发生在初级代谢阶段。对于酶产生机理
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和合成机制还需要进一步的研究。
本研究中 ,以前期摇瓶培养条件为基础 ,进行了
该菌产木素过氧化物酶发酵培养由摇瓶到 16 L发
酵罐的放大。结果表明 ,在发酵罐条件下 ,多种因素
均对微生物的生长繁殖及代谢产物积累产生重要影
响 ,其中以菌体浓度的影响较为明显 ,菌体的添加量
大小直接影响菌体浓度的大小 ,进而对发酵产物得
率产生重要影响。在适当的比生长率下 ,发酵产物
得率与菌体浓度正相关 ,但当菌体浓度过高时 ,则可
能导致营养物质消耗过快 ,有毒物质积累等不利条
件 ,从而改变代谢途径 ,引起发酵产物的减少。因
此 ,在发酵中 ,最适菌体浓度既能保证产物的生产率
维持在最大值 ,也不会因菌体浓度过高使需氧大于
供氧。培养基中 C /N比例也是发酵产酶的影响因
素之一 ,它不仅直接影响培养基的 pH值 ,导致代谢
途径和代谢产物发生变化 ,也容易造成原料的浪费。
在水中氧的溶解度很小 ,这就决定了溶氧量也成为
发酵过程的限制性因素 ,尤其在微生物的对数生长
期 ,需氧量大 ,溶氧浓度急剧下降 ,如果下降到临界
浓度以下 ,会对菌体的生长以及代谢产物的形成产
生抑制作用。因此必须通过控制发酵罐搅拌速度和
通气量来改善供氧条件 ,以利于菌体较好的生长和
酶产量的提高。
本研究通过多次上罐发酵试验 ,初步探究了该
菌最佳发酵工艺 ,旨在为木素过氧化物酶的规模化
生产探索条件 ,同时为进一步提高产酶和降低生产
成本奠定一定基础 ,也为后期研究酶的纯化提供充
足材料。
参 考 文 献
1　 Glenn JK, Morgan MA, Mayfield MB, et al. B iochem B iophys Res
Commun, 1983, 114: 1077～1083.
2　 Mohamed SA, Sam i S, A li G. B iotechnology Letters, 1999 , 21: 849
～853.
3　 George PC, Susan KK, TawnyaMB. Compost Sci & U t, 2000, 8 (1) :
6～11.
4　 TuncerM, Kuru A, L sikli M, et al. Journal of App lied M icrobiolo2
gy, 2004, 97: 783～791.
5　汪家政 ,范明 ,蛋白质技术手册 [M ]. 北京 :科学出版社 , 2000,
42～46.
乳酸菌与乳品发酵剂
孟祥晨 　杜鹏 　李艾黎 　等编著
97827203202519223　　  78. 00　　　　　2009年 8月出版
内容简介 :乳酸菌是广泛应用于食品、医药和饲料等行业的一类重要工业微生物 ,它可以作为细胞工厂
生产某些有价值的产物或产品 ,亦是开发生物质能源的重要菌种。乳品发酵剂是乳酸菌在乳制品中成功应
用的一个实例 ,是生产优良发酵乳制品的关键。本书首先围绕乳酸菌的遗传、代谢和应用等方面分别阐述了
组成乳酸菌的主要菌属 ,乳酸菌的代谢、遗传、噬菌体 ,以及乳酸菌的有益作用 ,还总结了乳酸菌的安全性以
及相关的法规规定。其次 ,阐述了乳品发酵剂的历史、分类和生产 ,着重介绍了发酵剂在酸奶生产和干酪成
熟中的作用 ,以及乳酸菌在非乳食品中的应用。最后 ,作者根据国内外的研发状况 ,论述了乳酸菌的基础研
究趋势和应用前景。
本书可供从事乳品科学、微生物等领域研究的科研技术人员参考 ,也可作为相关学科的研究生教材。
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