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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY
BULLETIN 2010年第 10期
革胡子鲶 GH成熟肽在大肠杆菌中表达条件的优化
杨学明1, 2
何荆洲 2
张立 1
黄雄军 3
郭亚芬 2
蒋和生 2
( 1广西水产研究所,南宁 530021; 2广西大学动物科技学院,南宁 530005;
3贵港扬翔饲料有限公司,贵港 537100)


摘
要:
将携带革胡子鲶 (C larias laz era)生长激素 ( GH )成熟肽 cDNA序列的重组表达载体 pRSET
mGH转化入大肠杆
菌 E scherichia. co li BL21( DE3) pLysS中进行融合蛋白的表达。表达条件优化试验表明, 表达菌株接种 SOB培养基, 培养 2- 3
h后可用 IPTG进行融合蛋白诱导表达; IPTG最佳诱导浓度为 1. 5 mm o l/L,最佳诱导时间为 4 h。本试验构建的原核表达体系
为下一步革胡子鲶生长激素促生长制剂的研制奠定了基础。
关键词:
革胡子鲶
生长激素
原核表达
优化
Optim ization of Expression Conditions forMature Peptide of
Growth Hormone from Clarias lazera inEscherichia coli
YangXuem ing
1, 2
H e Jingzhou2
Zhang L i1
Huang X iong jun3
Guo Yafen2
J iangH esheng2
(
1
Guangx i Fisheries Institute, N anning 530021;
2
College of Animal Science and T echnology,
Guangx i University, N anning 530005;
3
Yangxiang F eedstuff Co. L td, Guigang 537100)


Abstrac:t
The recomb inant vector pRSET
mGH conta in ing cDNA of m ature peptide of g row th ho rm one ( mGH ) from C lar ias
laz era was successfu lly expressed in E. coli BL21( DE3) pLysS. Optim ization test for express ion condition showed that pRSETA
mGH /
BL21 should be firstly cultured in SOB m edium for 2- 3 h at 37
be fo re induc tion, then induced w ith IPTG to express mGH fus ion
prote in. The appropriate IPTG concen tra tion is 1. 5 mm o l/L, and the su itab le induc ing tim e is 4 h. This prokaryotic expression system
should provide g reat probabilities fo r fu rther research on b io techno log ical prepara tions of GH from C. laz era.
Key words:
Clarias lazera
Grow th hormone
P rokaryo tic expression
Optim ization
收稿日期: 2010
02
11
基金项目:广西自然科学基金项目 (桂科自 0542035)
作者简介:杨学明,男,博士,副研究员,研究方向:水产生物技术与遗传育种; E
m ai:l nnyxm@ s ina. com
通讯作者:蒋和生,男,博士,研究员,研究方向:动物遗传育种与生物技术; E
m ai:l hsj iang@ tom. com
鱼类生长激素 ( g row th hormone, GH )是由鱼脑
垂体腺分泌的一种单链多肽类激素, 具有促进个体
生长发育、调节新陈代谢和提高食物转化率等作用,
是一种环保型生长促进剂, 在水产养殖上具有广泛
的开发应用前景。目前, 多种鱼类的生长激素都已
在以大肠杆菌为宿主菌的原核表达系统中成功进行
了表达,而鲶形目鱼类仅有印度囊鳃鲶 (H eteropneu

stes fossilis)、鲶 ( Silurus asotus )和湄公巨鲶 (Pangas

ianodon gigas)开展了相关研究 [ 1- 3]。
革胡子鲶 (C larias lazera )属鲶形目、胡鲶科、胡
鲶属鱼类,生长速度快,是我国一种重要的淡水养殖
鱼类。作者已克隆得到了革胡子鲶的 GH基因 [ 4 ] ,
并在大肠杆菌中表达了成熟肽融合蛋白,表达量高
达细菌沉淀蛋白总量的 36. 8% [ 5]。本研究在此基
础上,对其表达条件, 主要是 IPTG诱导浓度和诱导
时间进行了优化试验,目的是提高表达量和表达系
统的稳定性,为进一步开发革胡子鲶 GH相关的饲
料添加剂和生长激素制剂奠定基础。
1
材料与方法
1. 1
材料
大肠杆菌 BL21( DE3) pLysS及含革胡子鲶 GH
成熟肽 cDNA的重组表达质粒 pRSET
mGH为广西
大学动物遗传育种实验室保存。诱导剂 IPTG购自
宝生物 ( TaKaR a)大连生物工程有限公司。其它试
2010年第 10期 杨学明等:革胡子鲶 GH成熟肽在大肠杆菌中表达条件的优化
剂购自上海生工。
1. 2
方法
挑取含重组质粒 pRSET
mGH 的阳性单菌落
pRSET
mGH /BL21接种于 2 mL的 SOB液体培养基
中,培养基预加 50 mg /L的氨苄青霉素 ( Amp)和 35
mg /L的氯霉素 ( Chl), 37
摇床 ( 200 r/m in)活化过
夜;第二天将过夜培养的菌液稀释于 25 mL SOB培
养液中 (不含 Amp和 Ch l) , 37
摇床 ( 220 r/m in)剧
烈振荡培养至 OD600 = 0. 4 - 0. 6。然后分别进行
IPTG不同诱导时间、不同诱导浓度优化试验及表达
菌株 pRSET
mGH /BL21生长试验。
取菌液 1 mL, 12 000 r /m in离心 3 m in, 菌体沉
淀加 100
L中性 N aH2 PO4溶液 ( 20 mmol /L )振荡
重悬,在液氮和 42
水浴中反复冻融使细胞完全裂
解。12 000 r /m in离心 10 m in分别取沉淀和上清
液,上清加 100
L的 2
SDS
PAGE上样缓冲液;沉
淀先后加 100
L双蒸水和 100
L的 2
SDS
PAGE
上样缓冲液振荡重悬,样品放 - 20
保存。
取 5- 10
L的蛋白样品在沸水中煮 5 m in使
其完全变性,然后上样于 12% SDS
PAGE凝胶中电
泳。胶样在 B io
Rad GS
710光密度计上扫描, 拍照,
BandScan软件分析融合蛋白的表达。
2
结果
2. 1
IPTG诱导时间试验
将 IPTG的诱导时间分别设置为 0 h、1 h、2 h、3
h、4 h、5 h、6 h、7 h和 8 h共 9个组, 每组培养液中
加 IPTG使其终浓度达到 1 mmol /L, 连续培养。每
间隔 1 h重复取菌液 1mL离心制样。图 1为 pRSE

TA
mGH /BL21诱导 0- 8 h电泳检测的结果。
由图 1可以看出, 在分子标记 26 kD附近有一
条明显的蛋白谱带, 为目的融合蛋白 pRSET
mGH /
BL21的表达带。这条蛋白带主要存在于离心后的
菌体沉淀中,在上清中含量很少。
经 BandScan软件分析, 菌体沉淀中 1- 8 h融
合蛋白占总蛋白的比例分别是 19. 3%、25
7%、
25
3%、26. 7%、23. 5%、25. 8%、19. 3%和 20. 3%。
表明融合蛋白表达量基本上随诱导时间逐渐增加,
到 4 h达到最大, 为 26. 7%。然后浓度略微下降,
不再增加,说明 IPTG诱导的最佳时间是 4 h。
1- 9. 0- 8 h菌体沉淀; 10- 18.菌体上清; M.蛋白质分子量标准
图 1
IPTG诱导时间对 pR SETA
mGH /BL21
融合蛋白表达的影响
2. 2
IPTG诱导浓度试验
将 IPTG诱导浓度设为 0. 1、0. 3、0. 5、0. 8、1. 0、
1. 5和 2. 0mmo l/L 7个梯度对 pRSETA
mGH /BL21分
别进行诱导培养 4 h, 12% SDS
PAGE电泳分析,发现
在设定的不同 IPTG诱导浓度下都可以诱导 pRSETA

mGH /BL21表达融合蛋白 (图 2)。从泳道 1到 7,对
应的融合蛋白表达量和诱导浓度分别为 23
1%
( 0. 1mmo l/L )、23. 7% ( 0. 3 mmo l/L )、20. 1% ( 0. 5
mmo l/L )、21. 2% ( 0. 8mmol /L)、23
9% ( 1
0 mmo l/L )、
27
6% ( 1. 5 mmo l/L )和 15. 1% ( 2. 0 mmo l/L )。说
明最佳诱导表达浓度是 1. 5 mmo l/L, 此浓度诱导 4
h后目的融合蛋白表达量达到最大, 占细菌沉淀总
蛋白的 27
6%。
1- 7. IPTG 诱导浓度依次为 0. 1、0. 3、0. 5、0. 8、1. 0、
1
5、2
0mm ol/L时细菌沉淀; M.蛋白质分子量标准
图 2
不同 IPTG诱导浓度对 pRSETA
mGH
融合蛋白表达的影响
2. 3
表达菌株生长试验
以未诱导为对照,从平板上挑取 pRSET
mGH /
BL21单菌落接种于 2 mL的 SOB液体培养基中 (含
50mg /L的 Amp和 35 mg /L的 Ch l) , 37
摇床 ( 200
r/m in)活化过夜后稀释于 25 mL的 SOB培养液中
183
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2010年第 10期
(不含抗生素 ), 37
, 220 r /m in继续培养, 每间隔 1
h取 1mL的菌液,在紫外分光光度计上测量 OD600
值,连续培养 10 h,制作细菌生长曲线。
结果 (图 3 )表明, pRSETA
mGH /BL21菌株在
SOB培养基中稀释培养 2- 3 h后, OD600 = 0. 4- 0. 6
时,细菌达到一定的浓度, 进入快速生长指数期。可
在这个阶段加入 IPTG进行诱导表达, 融合蛋白表
达量较大,能达到较好的诱导效果。
图 3
pRSETA
mGH /BL21的生长
3
讨论
原核表达中外源蛋白表达量的多少受到多种因
素的影响,其中与温度、诱导剂诱导时间和诱导浓度
的关系最为密切。本试验所用的原核表达菌株 E.
coli BL21( DE3)进行表达的最适温度是 37
[ 6]。因
此,本试验没有进行不同温度的表达试验。在 37

的固定温度下,进行了诱导浓度和诱导时间的研究。
从结果看, IPTG浓度对表达量的影响不大, IPTG诱
导时间对表达量的影响较大,随诱导时间增加,表达
量逐步增加,到 4 h达到最大,超过 4 h后,表达量反
而下降,可见诱导时间过长或过短都会影响蛋白量
的积累。另外,起始诱导时间也是影响原核表达的
重要因素之一。起始诱导将 pRSET
mGH的表达分
为两个阶段: 质粒生长阶段和融合蛋白表达阶段。
从细菌生长曲线可以看出, 本试验起始诱导时间为
2- 3 h。在细菌接种开始培养的 3 h内, 是质粒生
长阶段,这一阶段外源营养物质全部用于细菌生长。
菌液经几个小时培养后, OD 600值快速上升到 0. 4 -
0. 6,质粒的总拷贝数达到了一定的水平,这时再加
入 IPTG诱导, 外源营养物质主要用于融合蛋白表
达, 从而达到增加蛋白量的效果。否则,如果从一开
始就进行诱导,细菌浓度不够大, 吸收的营养物质一
方面要用于细菌自身的生长繁殖, 一方面要用于合
成蛋白质,二者相互竞争,蛋白表达量肯定不高。在
本试验不同表达条件下, 融合蛋白的表达量基本在
细胞总蛋白的 20%以上,可以说达到了很好的表达
效果。本研究所构建的原核表达优化体系为将来革
胡子鲶生长激素的产业化开发和应用奠定了基础。
参 考 文 献
[ 1] Anathy V, V enugopa lT, Koteesw aran R, et a.l C lon ing, sequen cing
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f ish(H e teropneustes fossilis) . J B iosc,i 2001, 26( 3 ): 315
324.
[ 2] 杜启艳,陈丽丽,南平,常重杰.鲶生长激素基因 cDNA的克隆和
原核表达.水产科学, 2007, 26 ( 4) : 195
199.
[ 3 ] Promdonkoy B, Warit S, Panyim S. Produ ct ion of a biologically act ive
grow th h orm one from g ian t cat fish (Pangasian od on g iga s) inE sche

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653.
[ 4] 杨学明,张立,黄光华,等.革胡子鲶生长激素基因克隆与序列同
源分析.西南农业学报, 2008, 21 ( 2) : 87
92.
[ 5] 杨学明,何荆洲,张立,等.革胡子鲶生长激素成熟肽 cDNA克隆
及其在大肠杆菌中的表达. 安徽农业科学, 2008, 36 ( 35 ):
15381
15383.
[ 6] 卢圣栋.现代分子生物学实验技术 (第 2版 ) [M ]. 北京:中国协
和医科大学出版社, 1999.
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