全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011年第 5期
pBV220 / hIL4优化表达及其包涵体复性研究
孙卫国 李邦印 张灵霞 李国利 熊志红 程小星
(解放军第 309医院结核病研究所,北京 100091 )
摘 要: 旨在对人白细胞介素4( hIL4)上、下游序列进行优化设计,提高在原核系统中的表达量, 并对表达的包涵体进
行复性研究提高复性率。利用 B ioSun的 RNA二级结构预测模块辅助设计 h IL4起始密码子 ( AUG )上、下游的序列, 使局部
二级结构的自由能满足高表达要求;根据 pBV220载体和原核系统的特点优化引物序列提高 hIL4原核表达量。优化 hIL4
包涵体复性条件和方法, 提高复性率和生物活性。结果显示, 成功构建了 pBV220 /hIL4高效表达载体, 原核表达的重组人 IL
4占细菌总蛋白的 35%以上, 明显高于优化前表达量; 经过复性研究 hIL4包涵体复性率可达到 15%以上, 生物活性鉴定发
现, 纯化的 hhIL4蛋白的比活等同或高于国外同类产品。影响原核表达的条件较多,对表达序列的优化设计可以大大提高蛋
白的表达量。针对人 IL4基因序列的优化设计提高了人 IL4基因的表达, 复性方法的改良提高了复性率和生物活性。
关键词: 人白细胞介素4 优化表达 包涵体 生物活性
Optim izing Expression and Inclusion Body Renature
Research of pBV220 / hIL4 inE . coli
SunW eiguo L iBangy in Zhang L ingxia L iGuoli X iong Zh ihong Cheng X iaox ing
(TuberculosisResearch Institute, The 309Hosp ital, PLA, B eijing 100091)
Abstrac:t The study w as to improve the expression quantity of hum an inter leuk in4 gene in E. co li by optim izing sequence des ign
and increase the renature ra tio of inc lusion body. Design up and downstream sequence of inte rleuk in4 start codon( AUG ) reg ion by an
cillary B ioSun soft to m ake free ene rgy o f RNA second structure content the dem and of h igh expression leve ls; reform prim er acco rd ing
to cha racte ristic of pBV220 vector and prokaryon expression system to eva luate expression leve;l upgrade the cond ition and procedure of
inc lusion body rena ture to im prove renature ratio and b io log ica l activ ity. Results show ed tha t after op tim izing design. The expressed hIL
4 was up to 35% of tota l bacter ia l pro tein w ith pBV220 /hIL4 vector expressed in E. coli. The rena ture ratio o f recom binant h IL4 in
clusion body has also exceeded 15% and bio log ica l activ ity o f purified recomb inant hIL4 was better than fo re ign congener when am en
d ing renature cond ition. It is important to optim ize design expressed sequence o f gene. The data show ed tha t the optim ized m ethods a
dopted in th is study eva luate rhIL4 expression lev el ev idently and improve its renature ratio and b io log ica l activ ity e fficien tly.
Key words: Human inter leuk in4 Optim iz ing expression Inclusion body B io log ica l activ ity
收稿日期: 20101112
基金项目:国家传染病重大专项 ( 2008ZX10003012 )
作者简介:孙卫国,男,博士,助理研究员,研究方向:生物工程; Em ai:l sunwg2009@ 163. com
通讯作者:程小星,男,博士,研究方向:传染病免疫保护机制; Em ai:l xc36 cn@ yahoo. com. cn
人白细胞介素4( human interleukin4, hIL4)是
由 T辅助细胞分泌产生的一种淋巴因子, 促进 T细
胞增殖并分化成效应 T 细胞,强化 B细胞的抗原提
呈能力,调节造血干细胞的增殖及分化,使树突状细
胞定向分化为抗原提呈细胞 [ 1]。目前发现 hIL4是
哮喘病人治疗的潜在的靶分子 [ 2] , 并在牛皮癣治疗
上可能获得较好的效果 [ 3] , hIL4在包括肿瘤、免疫
缺陷等疾病的免疫治疗方面具有巨大的开发和应用
价值。目前利用原核表达系统生产细胞因子已成为
常规手段,对于人 IL4的表达也已有诸多报道, 但
表达量、复性率和生物活性都很低。根据原核表达
系统以及载体 pBV 220的表达特点, 同时利用 B io
Sun的 RNA二级结构预测模块辅助设计起始密码
子 (AUG )上、下游的序列, 通过同义密码子置换使
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 5期
局部二级结构的自由能满足高表达来选择局部序
列,以提高基因表达时的翻译水平, 经过序列优化
后, hIL4表达量可占菌体总蛋白的 40%左右。对
表达的包涵体复性条件和方法进行了研究, 尝试不
同的包涵体复性方法,选择了一种适合 hIL4的复性
方法使复性率达到 15%以上。蛋白纯化后经生物活
性鉴定发现,复性的重组 hIL4生物比活性达到 5
10
6
U /mg以上,等同或者优于国外的同类产品。
1 材料与方法
11 材料
111 质粒和菌株 载体 pBV220、pGEM T /hIL
4、大肠杆菌 DH5由本室保存。
112 主要试剂 PCR试剂、反转录酶、限制性内
切酶、T4噬菌体 DNA 连接酶均为 Promega公司产
品; DNAM arker、低分子量蛋白质 Marker购自天为
试剂公司;纯化 PCR产物试剂盒, 高纯度质粒抽提
试剂盒购自 Omega公司; SP Sepharose Fastflow购自
Pharmacia公司; MTT购自 Sigma公司; 人 IL24标准
品购自 G ibco( 5 106 U /mg) ,其他生化试剂均为国
产分析纯。
12 方法
121 PCR引物的设计与载体的选择 根据 B io
Sun软件的 RNA二级结构预测模块中的随机堆积
方法 ( RS) ,设计 hIL4起始密码子 ( ATG )上下游序
列和 hIL4下游序列使 FIRST和 SECOND的二级结
构,并分别获得相应的自由能数据 GFIR ST和 GSECOND
满足 GFIR ST - 40 (K ca l/mo l)和 - 1721 GSECOND
- 1138( kcal/mol) [ 4] ;选择从 SD到 ATG的局部
序列为 AATTA; 3端的 3个密码子 (包括 TAA )必须
是大肠杆菌的优势密码。设计的常规引物: 上游 5
GGAATTCATGCACAAGTGCGATATCACCT3, 下游
5CGGGATCCTCAGCTCGAACACTTTGAATATTTC
TCTCTCATGATC3; 优化引物: 上游 5GGAATTC
AATTATATGCACAAGTGCGACATCACCTTGCAG
GAG3, 下游 5CGGGATCCTTAGCTGGAGCACTTT
GAATATTTCTCACGCATGATC3。
122 hIL4基因的克隆和转化 以实验室保存
的质粒 pGEM ThIL4为模板, 分别以常规引物和
优化引物进行 PCR扩增得到 hIL4序列和优化序
列,两端分别含有 E coR和 BamH核酸酶切位点。
PCR扩增程序为 95 40 s, 57 30 s, 72 30 s,共 29
个循环。特异扩增条带 1%琼脂糖电泳初步鉴定。
回收 PCR片段以 EcoR和 BamH 核酸酶进行双
酶切与同样双酶切的质粒载体 pBV220在 T4 DNA
连接酶作用下连接,连接产物转化感受态大肠杆菌
DH5后挑选阳性转化子进行测序, 测序结果同预
期结果完全一致。将携带有 hIL4优化序列的载体
pBV220命名为 pBV220 /hIL4。
123 hIL4基因的原核表达 将分别携带 hIL4
常规序列和优化后序列的载体 pBV 220转化大肠杆
菌 DH5,取表达的宿主菌接种氨苄青霉素抗性的
LB培养基, 37 振摇培养,当菌液 OD600达 04时,立
即移至 42 ,热诱导 5 h后,离心收集细菌,按110将
菌体溶于 1 PBS缓冲液中,分别取两种表达菌体进
行 14% SDSPAGE电泳,分析 hIL4常规序列和优化
后序列克隆入载体 pBV220后原核表达差异。
124 pBV 220 /hIL4表达条件的优化 取携带
hIL4优化后序列的载体 pBV 220 /hIL4表达的宿
主菌接种氨苄青霉素抗性的 LB培养基, 37 振摇
培养,当菌液 OD 600达 04时, 立即移至 42 , 分别
热诱导 3、4、5、6和 7 h后, 离心收集细菌, 按 110
将菌体溶于 1 PBS缓冲液中,分别取不同诱导时
间菌体进行 14% SDSPAGE电泳, 分析 pBV220 /
hIL4最佳诱导时间。
125 重组 hIL4包涵体复性研究 包涵体的复
性是个不断摸索尝试的过程, 还没有一种复性程序
适合所有蛋白质, 特定的蛋白质复性必须反复试验
才能获得最佳复性率。稀释和透析是目前最常用的
方法,透析的完成依赖扩散作用,需要较长的时间,
同时蛋白质在中等浓度变性剂下作用时间过长, 易
造成蛋白质聚集。稀释是将变性蛋白质溶液直接加
入复性缓冲液中,因而是一种更简单和快速的方法。
实践中,一种蛋白质通过透析方法易获得较高的复
性产率,而另一种蛋白质则只能采用稀释方法。对
hIL4包涵体的复性, 摸索不同的条件和方法获得
最佳条件,其复性率可达到 15% - 20%左右。
沉淀菌体以 100 g /L 悬浮于超声缓冲液中
( 25 mmo l/L TrisHC ,l 05 mmo l/L EDTA, pH80 ),
在冰浴下超声破菌, 13 000 r /m in, 15m in离心收集
沉淀。沉淀先后用不同浓度的 Triton X100和
206
2011年第 5期 孙卫国等: pBV220 /hIL4优化表达及其包涵体复性研究
3 mol /L盐酸胍交替洗涤。洗涤后的包涵体用
6 mol /L盐酸胍, 10 mmo l /L 巯基乙醇的 TE缓冲
液变性溶解, 高速离心取上清。上清液以 1100比
例和 5mL /h的速度滴加稀释到 pH80的复性液中
( 25mmo lT risHC;l 01 mmo lN aC ,l 05 mmo l EDTA
1 mol的盐酸胍, pH80, 01 mmo l GSSG, 02 mmol
GSH ) 4 放置 24 h左右,高速离心除去沉淀。
126 重组 hIL4纯化和生物活性鉴定 h IL4的
等电点在 104左右, 采用 SP阳离子交换层析对复
性后的 rh IL4进行提纯。上清液以 50 mmol Tris
HC ,l pH78的缓冲液透析后, 13 000 r /m in 20 m in。
将复性液上样,流速 30 mL /m in,待穿过峰过后, TE
缓冲液 pH78平衡色谱柱。N aC l梯度洗脱,分步收
集各洗脱峰, 06 molN aC l附近应为目的峰, 取目的
峰样品 14% SDSPAGE电泳检测纯度。采用 BCA
法测定样品蛋白的含量, 采用人外周血分离淋巴细
胞,通过3H TdR掺入法测定生物活性, 用 GIBCO产
品作为阳性参照。
2 结果
21 h IL4基因序列和优化序列的钓取
以保存的质粒 pGEM ThIL4为模板,分别以常
规引物和优化设计后的引物进行 PCR扩增得到 hIL
4基因序列和优化序列,扩增后的 hIL4基因序列和
优化序列经 1%琼脂糖电泳结果 (图 1)显示, 在分子
量约为 360 bp处均有明显特异的条带。回收 PCR片
段经过双酶切后克隆至表达质粒载体 pBV220中, 转
化感受态大肠杆菌 DH5后选择测序正确的克隆进
行保存。
M. DL2000M arker; 1. h IL4基因 PCR产物;
2. h IL4基因优化序列 PCR产物
图 1 hIL4基因及其优化序列 PCR产物琼脂糖电泳
22 hIL4基因序列和优化序列的表达差异
将分别携带有 hIL4基因常规序列和优化后序
列的载体 pBV220宿主菌大肠杆菌 DH5,接种氨苄
青霉素抗性的 LB培养基,菌液 OD600达 04时,立即
移至 42 进行热诱导 5 h后, 分别取两种表达菌体
全蛋白进行 14% SDSPAGE电泳 (图 2), 发现优化
后的 hIL4基因序列进行热诱导后表达量明显高于
优化前的序列,经扫描软件分析优化后序列进行热
诱导后, 表达的 rhIL4占菌体总蛋白的 35%以上,
比优化前大约高 10%左右。
M.低分子量蛋白 M arker; 1. pBV220 /hIL4优化序列未诱
导; 2. pBV220 /h IL4优化序列诱导全菌体; 3. pBV220 /hIL4
常规序列未诱导; 4. pBV220 /h IL4常规序列诱导全菌体
图 2 hIL4基因及其优化序列诱导后的全菌体
蛋白 SDSPAGE分析
23 pBV220 /hIL4原核热诱导表达形式分析
取热诱导表达后的菌液离心收集沉淀细菌, 按
110将菌体溶于 1 PBS缓冲液中, 冰浴下超声破
碎,高速离心分别收集上清和沉淀, 14% SDSPAGE
电泳分析目的蛋白的表达形式,结果 (图 3)显示, 原
核表达的重组 hIL4绝大部分以包涵体的形式存在
超声后的沉淀中。
24 pBV220 /hIL4表达条件的优化
pBV220载体是热启动子载体, 在温度 42 时
开始表达重组蛋白。热诱导可以避免因为添加诱导
剂带来的污染和成本的提高。热诱导表达重组蛋白
在达到饱和前与诱导时间成正向关系。将含有
pBV220 /hIL4的宿主菌振摇培养至 OD600为 04
207
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 5期
时, 42 条件下分别热诱导 3、4、5、6和 7 h, 取诱导
后的全菌体 14% SDSPAGE电泳 (图 4)发现, 热诱
导 4 h后表达量达到饱和,表达的 hIL4占全菌体总
蛋白比例最高。
M.低分子量蛋白 M ark er; 1.未诱导 pBV220 /hIL4全菌
体; 2.诱导 pBV220 /h IL4全菌体; 3. pBV220 /h IL4超声
后的上清; 4. pBV220 /h IL4超声后的沉淀
图 3 pBV220 / hIL4原核表达形式 SDSPAGE分析
M.低分子量蛋白 M ark er; 1- 5. pBV220 /hIL4热诱导
3、4、5、6和 7 h全菌体
图 4 pBV220 /hIL4不同诱导时间原核
表达差别 SDSPAGE分析
25 重组 hIL4纯化和生物活性鉴定
重组 hIL4包涵体经过复性, 4 条件下采用
SPSepharose Fastflow阳离子交换柱对复性后的 rhIL
4进行纯化。 hIL4等电点在 104左右, 在缓冲液
体系的 pH为 78的条件下上样和洗脱目的蛋白,
当洗脱缓冲液 NaC l浓度为 06 mo l时出现目的峰,
14% SDSPAGE电泳 (图 5)检测发现, 洗脱的目的
蛋白 h IL4纯度可达到 95%以上。水透析后干冰保
存。对纯化的重组 hIL4进行生物活性鉴定, 复性
后的 hIL4比活性约为 5 106 U /mg蛋白以上, 等
同或优于国外同类产品。
M.低分子量蛋白 M arker; 1.纯化的 h IL4
图 5 阳离子层析纯化 hIL4的 SD SPAGE分析
3 讨论
原核基因工程方法生产重组蛋白的关键是高表
达、易纯化和强的生物活性。高表达是原核表达技
术的基础。利用原核表达系统表达真核基因时, 进
行表达的优化设计是十分必要的。外源基因在原核
表达系统中表达量受到的影响因素很多,包括启动
子强度、SD序列和转录终止序列、SD序列到 ATG
之间的距离、密码子的使用频率、表达产物的毒性和
空间结构以及表达载体等。本研究根据原核表达特
性对表达的 IL4基因序列进行优化, 首先根据 B io
Sun的 RNA二级结构预测模块辅助设计起始密码
子 (AUG )上、下游的序列, 通过同义密码子置换使
局部二级结构的自由能满足高表达要求,其次设计
的 SD序列到 ATG之间的序列为 AATTA。研究表
明, AUG前的 3个核苷酶以 UAU和 CUU组合为最
佳, 一定要避免 AGG、UUC和 UCA [ 5 ]。最后采用原
核喜好的终止密码子 UAA。经过序列优化后, hIL4
表达量可占菌体总蛋白的 40%左右。
原核系统表达真核基因往往以包涵体的形式存
在, 包涵体复性方法的探寻决定复性率和重组蛋白
的生物活性的高低。一种包涵体一般都有其特定的
(下转第 222页 )
208
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 5期
[ 18 ] Gab allo A, Zanott iF, Papa S. S tructu res and in teractions of p roteins
involved in the coupl ing function of th e protonmot ive F1 F0ATP
syn thase. C urren t Protein and Pep tid e Science, 2002, 3 ( 4 ) :
451460.
[ 19 ] D icksonVK, S ilvester JA, Fearn ley IM, et a.l On th e s tru cture of the
s tator of the m itochondrial ATP syn th ase. The EMBO Journa,l
2006, 25( 12) : 29112918.
[ 20 ] Ferea T, Con treras ET, Oung T, et a.l Characterization of the c it1
gene fromN eurospora crassa encod ing them itochond rial form of cit
rate syn thase. M olecu lar and GeneralG enetics, 1994, 242( 1 ) : 105
110.
[ 21 ] M aidenMCJ, DavisEO, B aldw in SA, et a.lM amm alian and bacteri
al sugar tran sport p roteins are hom ologou s. Natu re, 1987, 325
( 6105 ): 641643.
[ 22 ] H enderson PJF. Sugar transport proteins. Curren tOp in ion in Stru c
turalB iolo logy, 1991, 1 ( 4) : 590601.
[ 23 ] Pao SS, Pau lsen IT, S aier Jr MH. M ajor facil itator sup erfam ily. M i
crob io logy andM olecu lar B iology Review s, 1998, 62( 1 ) : 134.
[ 24 ] Andre B. An overview ofm emb rane tran sport protein s in Saccharo
m yce s cerevisia e. Yeast, 1995, 11 ( 16) : 15751611.
[ 25 ] Nou ran iA, W esolow sk iLouvelM, Delaveau T, et a.l M u litp le drug
res istan ce ph enom enon in the yeast Saccharomyces cerevisia e: in
vo lvem en t of tw o hexose transporters. M olecu lar andC ellu lar B iolol
ogy, 1997, 17 ( 9) : 54535460.
[ 26] W ieczorke R, K ram pe S, W eiersta llT, et a.l Con current knockout
of at least 20 tran sporter gen es is requ ired to b lock uptake of hexo
ses in Saccharom yces cerevisia e. FEBS Letters, 1999, 464 ( 3 ):
123128.
[ 27] K iang JG, TsokosGC. H eat shock protein 70 kDa: m olecu lar b iolo
gy, b ioch em istry, and phys iology. Pharm acology & Therapeu tics,
1998, 80( 2 ): 183201.
[ 28] Shan er L, Morano KA. A ll in the fam ily: atypicalH sp70 chaperones
are con servedm odu lators ofH sp70 activity. C ellS tress and Chaper
ones, 2007, 12( 1) : 18.
[ 29 ] P lesofskyV ig N, Bramb l R. Characterization of an 88kDa heat
shock protein ofN eurospora cra ssa th at in teracts w ith H sp30. The
Journal ofB iologicalC hem istry, 1998, 273( 18 ): 1133511341.
[ 30] Bork P, Sand er C, Valencia A. An ATPase doma in comm on to p ro
k aryotic cel l cycle proteins, sugar k inases, act in, and hsp70 heat
shock proteins. Proceedings of the NationalA cadem y of S ciences of
the Un ited S tates ofAm erica, 1992, 89( 16 ) : 72907294.
[ 31] M cK eegan KS, BorgesW alm s ley M I, Walm sley AR. M icrob ial and
viral drug resistance m ech an ism s. Trend s inM icrob iology, 2002, 10
( 10) : S8S14.
(责任编辑 马鑫 )
(上接第 208页 )
复性途径。对表达的 h IL4包涵体复性条件和方法
进行研究,尝试稀释复性和透析复性等方法,发现稀
释复性更适合 hIL4包涵体, 经过复性后, hIL4复
性率可达到 15%以上。蛋白纯化后经生物活性鉴
定发现,复性的重组 hIL4生物比活性可达到 5
10
6
U /mg以上, 等同或者优于国外的同类产品。
参 考 文 献
[ 1 ] Yodota T, Otsuka T, Mosm ann T, et a.l Isolat ion and characterizat ion
of a hum an in terleuk in cDNA clon e, hom ologous to m ou se Bcell
st im ulatory factor 1, that expresses Bcell and Tcell st imu latory ac
t iv it ies. Proc NatlA cad SciUSA, 1986, 83( 16 ): 58945898.
[ 2] Rook GAW, H ernandezPando R, Dhed a K, et a.l IL4 in tub erculo
sis: im p lications for vaccine d es ign. Trends Immuno,l 2004, 25( 9 ):
483488.
[ 3] M art in R. In terleuk in 4 treatm ent of psorias is: are p leiotrop ic cyto
k in es su itab le therap ies for autoimmune d iseases?. T rends in Phar
m acological Sciences, 2003, 24( 12) : 613616.
[ 4] 查磊,应晓敏,曹源,等. B ioSun20:一个综合性的辅助分子生物
学实验设计软件.军事医学科学院院刊, 2006, 30( 5 ) : 461464.
[ 5] 黄欣,赵忠良,曹雪涛.人白细胞介素 4在大肠杆菌中的优化表
达.中国免疫学杂志 1999, 15 ( 9) : 405407.
(责任编辑 马鑫 )
222