全 文 ：综述与专论
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 12期
巴斯德毕赤酵母表达外源
蛋白的优化策略
樊英 1 李天保 1 杨秀生 1 王建华2 滕达2
( 1山东省海水养殖研究所 山东省海水养殖病害防治重点实验室,青岛 266002;
2中国农业科学院饲料研究所,北京 100081)
收稿日期: 20100624
作者简介:樊英,女,硕士,研实员,主要从事水产动物病害研究; Em ai:l fy_fy123@ 126 com
摘 要: 巴斯德毕赤酵母 (P ichia pastoris)表达系统已成为外源蛋白最理想的表达系统之一, 诸多的优点体现了其广泛
的研究价值和应用价值。综述了 Ppastor is表达外源蛋白时在载体选择与利用、外源基因改造、翻译后修饰及表达稳定性等方
面的优化策略, 以加速其应用。
关键词: 巴斯德毕赤酵母 外源蛋白 优化表达
Strategies for Expression Optim ization ofHeterologous
Proteins in Pichia pastoris
Fan Y ing
1 L iT ianbao1 Yang X iusheng1 W ang J ianhua2 Teng Da2
(Shandong ProvinceM ariculture Research Institute, Shandong Province K ey Laboratory forD isease Control of
M ariculture, Q ingdao 266002;
2
Feed R esearch Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, B eijing 100081)
Abstrac:t P ichia pastoris has been deve loped into one o f h ighly successful system s for expression of various hetero logous pro te ins,
m any advantages o fw hich revea lw ide va lues in resea rch and app lication. The artic le summ arized those factors and the ir optim iza tion
tha t influence express ion o f he tero logous prote ins in P ichia pastor is, inc lud ing the cho ice and utilization of vectors, mod ify ing hetero lo
gous genes, po sttranslational mod ification and expression stability, thus be ing ab le to accelerate its application.
Key words: P ichia pastoris H ete ro logous pro te ins Optim iza tion expression
在医药、饲料及科学研究中, P pastoris的广泛应
用使得外源蛋白表达产物的利用率大大增加,各种外
源蛋白的成功表达充分展示了 Ppastoris表达系统的
应用前景 [ 1- 3]。1970年, Ko ichi等描述了能够利用甲
醇作为唯一碳源的酵母菌种 Ppastoris; 随后, Phillips
Petroleum公司研究了一系列针对 Ppastoris进行高
密度连续培养的操作方案,不久, Ppastoris发展成为
一种普遍使用的外源蛋白真核表达系统。迄今,美
国 FDA已评价和批准了来自该系统的若干基因工
程产品,认为所批准产品是安全的, P pastoris表达
产物可用于实际生产及应用。与其它系统比较,该
系统在实现外源蛋白高效表达方面具有很多独特优
点 [ 4- 6 ]。迄今,已有 400多种外源蛋白在 P pastoris
中获得表达,表达产物广泛应用到实际生产中,并取
得了较好结果, 如日本囊对虾 (Marsup enaeus jap oni
cus)中的丝氨酸蛋白酶抑制剂 SKPI( shrimp Kun itz
type protease inh ibitor)在 Ppastoris中成功表达, 经
活性分析,重组的 SKPI能特异性地抑制胰蛋白酶的
水解活性 [ 7 ]。综述了外源蛋白在 Ppastoris中高效
表达的相关优化策略,其研究具有重要的理论和实
践意义, 依据分子生物学和基因工程技术使
P pastoris表达产物及基因工程产品在生产应用研
究中更加深入,拓展其市场开发潜力。
1 载体的选择与利用
载体是基因表达中不可或缺的条件, 一些基因
工程产品因为载体的不同最终的表达形式也不同。
如日本囊对虾 SKPI在 pGEX4T2和 pETH is中进
行原核表达时全部以包涵体形式存在,在毕赤酵母
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 12期
pPIC9K中则成功实现了分泌表达 [ 7 ]。Ppastoris表
达系统可选择的表达载体很多,如 pPIC9K、pPICZ、
pAO815、pPIC6C以及 pGAPZ等。
11 启动子的选择
选择合适的启动子可显著提高表达量。在P pas
toris表达系统中最常用的是醇氧化酶 1( alcoho l ox i
dase, AOX1)启动子,甲醇诱导性很强, 在其控制下
外源蛋白表达水平较高。马冬梅等 [ 8]在研究中利
用 pPICZA载体表达中华鲟 (A cip enser sinensis )半
胱氨酸蛋白酶抑制剂 ( cystatin) , 在 AOX1控制下重
组 cystatin表达量达 215 mg /L。抗对虾白斑综合症
病毒 ( wh ite spot syndrome v iru, WSSV )单链抗体
P1D3基因与酵母穿梭质粒 pPIC9K重组后电转化
入 Ppastoris GS115,在 AOX1调控下进行甲醇诱导
分泌, 表达量达 302 mg /L, 并为对虾被动免疫的深
入研究提供了新的抗体 [ 9 ] ,由此可见 AOX1启动子
的优越性。启动子 GAP ( g lyceraldehyde 3phos
phate)不需甲醇诱导,操作工艺简单, 在葡萄糖存在
下组成型表达水平较高, 但不宜表达对 P pastoris
有毒的蛋白。王伟等 [ 10]为获得具有生物活性的草
鱼生长激素, 选择载体 pGAPZ, 构建重组载体
pGAPZBGH后在 GAP启动子的调控下蛋白表
达量达 50 mg /L; 表达的生长激素具有生物活性,
能够与不同鱼来源的肝膜受体特异结合, 而且避
免了甲醇带来的风险。 Delro isse等 [ 11] 已将来源
Tribolium castaneum 的羧酸酯酶 ( carbosylesterase)
经不同启动子 GAP、AOX1在 P pastoris中表达。结
果表明, GAP控制下羧酸酯酶表达量达 80mg /L,是
AOX1控制下表达量 ( 40 mg /L )的两倍。AOX2启
动子利用甲醇较慢, 与 AOX1同源性达 97% , 在
AOX1无法使用的情况下也启动 AOX2来控制外源
蛋白表达; FLD1( form aldehyde dehydrogenase)、ICL1
( isocitrate lyase)等启动子各具特点, 目前应用尚
少 [ 1 2 ]。在同一试验中选择不同启动子得到的表达
结果往往不同,同时选用两个启动子进行目的蛋白
表达也不失为一种有效的方法 [ 13 ]。这些选择都为
获得大量的基因表达产物、为生产研究节约成本奠
定了基础。
12 信号肽的选择与改造
分泌表达是一种理想的应用表达方式, 信号
肽又是胞外分泌表达成功不可缺少的元件。酿酒
酵母 因子信号肽应用极为广泛, 鲑鱼降钙素前
体多肽 ( sCTG ly )利用 信号肽实现在 Ppastoris
中的分泌表达, 重组菌株表达量达 10 mg /L 以
上 [ 1 5 ]。 PHO1( acid phosphatase)信号肽包含 K ex2
酶切位点, 在它引导下外源蛋白表达量同样可大
幅度提高 [ 1 6 ]。菊糖酶信号肽 [ 1 7 ]、大鼠生长激素
信号肽 [ 1 8 ]等都可有效促进目的蛋白的分泌表达。
不同的信号肽导致不同的分泌效率。A kira等 [ 14]
利用酿酒酵母 ( Saccharomyces cerevisiae ) 信号肽、
目的基因本身信号肽、P pastoris PHO1信号肽在
AOX1启动子控制下表达人中期因子 human m id
k ine,表达量分别为 28、15和 02 mg /L, 信号肽
占绝对优势。实际研究中可根据应用情况选择不
同的信号肽,构建不同效率的重组表达载体,可提
高生产效益。
众多研究表明, 适当改造信号肽能显著提高外
源蛋白的分泌率。 Sag iya等 [ 1 9 ]通过突变技术提高
信号肽 N末端正电荷和中间 H区域的疏水性,使金
枪鱼生长激素表达量比未改造对照增加 10倍, 达
240 mg /L。王晖等 [ 20 ]在表达载体分泌信号序列和
目的蛋白 N端之间插入糖基化位点 (NTTEEGEPK )
和肠激酶识别位点 ( DDDDK )的间隔肽,蛋白表达水
平与不含间隔肽时相比提高了 4倍和 9倍。熊爱生
等 [ 21 ]在 pPIC9K的酿酒酵母天然信号肽 factorN
端插入 P pastorisAOX1 N端的 A、I、P,在信号肽与
Kex2酶切位点之间插入 EEAEAEAEPK, 使植酸酶
表达量提高 8倍, 达 120 mg /L。蒋燕明等 [ 22 ]除去
了 pPIC9K信号肽末端的 Xho I酶切位点, 但本身氨
基酸序列未变,保证了信号肽的完整;在多克隆位点
处添加了此切点,再加一个多聚组氨酸纯化标签,构
建了一种新型的多拷贝毕赤酵母表达载体, 使表达
的重组蛋白更易纯化, 表达量更高。P pastoris操作
手册中还指出,在 K ex2切割位点后设计 EA重复序
列能促进信号肽的切割。
13 载体选择标记、整合位点和方式
选择标记与拷贝数及外源蛋白的产生方式有密
切关系,不同载体的选择标记不同, 如 pPIC9K的选
择标记是 H IS4、kanr, 构成多拷贝表达载体,外源蛋
白实现分泌表达; pAO815的选择标记则是 H IS4, 构
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2010年第 12期 樊英等:巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的优化策略
成多拷贝表达载体,外源蛋白实现胞内表达。表达
载体的选择标记一般有两种:第一,对应于营养缺陷
型受体的野生型基因, 如 H IS4、SUC2、ARG4、URA3
等是常见的筛选标记;第二, 抗性基因, 如 K anr基因
( G418筛选 )和 b ler基因 ( Zeoc in筛选 )等,常用于筛
选多拷贝菌株。
整合位点和整合方式是密切影响表达的另一重
要因素。P pastoris表达载体整合位点很多, 其中
AOX1位点是比较适合且常用的整合位点。整合方
式有两种,一是单交换,线性化质粒整合入染色体,
aox1基因保留,转化子为Mu t+型;二是双交换,外源
基因替换了染色体上 aox1基因,转化子为 Muts型,
且相对稳定。
2 外源基因优化改造
21 密码子优化
基因序列中的每一种氨基酸有一种或几种同
义密码子, 编码多样性使之在不同生物体中的使
用频率不同, 蛋白表达水平不一样。外源基因序
列与表达宿主的同源性关系密切, 在不改变外源
蛋白氨基酸编码序列的情况下选择宿主喜好的密
码子,能增加 mRNA稳定性和转录效率, 从而提高
表达量。目前密码子优化策略已被广泛应用。已
有的研究中利用载体 pPIC9K,选择 P pastor is喜爱
密码子对 1, 31, 4葡聚糖酶基因进行优化改造
102个碱基, 重组蛋白酶在 GS115中实现分泌表
达, 7 L发酵罐水平上表达量达 250 mg /L, 比未优
化基因提高 50多倍 [ 23]。
22 调整 GC /AT含量
密码子优化改造的同时还需要调整 GC /AT含
量, GC /AT含量高致使表达时发生错误配对, 影响
表达量;高含量 AT既不利于表达, 还易发生转录提
前终止,特定的 AT高含量区可作为转录终止信号,
这也是目的基因特性的表现方式, 通常认为 AT含
量在 30% - 55%较适宜;同时进行密码子和 GC /AT
比例优化可有效提高外源蛋白表达量。如 Ak io
等 [ 24 ]将编码马铃薯 葡聚糖磷酸化酶基因 ( g lu
can phosphorylase)的 AT含量从 57%调整到 44% ,
同时去除其中易造成转录终止的 AT区域, 使 GP表
达量达到 100 mg /L。
23 优化基因 5 UTR组成及末端序列
提高表达量要尽量维持外源基因 mRNA 5
UTR和 AOX1 mRNA 5 UTR的一致性, 在 5 UTR
序列中避免出现 AUG, 且 AUG周围 mRNA二级结
构应具有相对自由度,减少或消除 DNA序列二级结
构和内含子剪接序列。外源基因的 N末端序列在
酶结构及性质研究中起重要作用, 利用分子生物学
技术改造 N 末端序列不仅可提高表达量还可提高
酶稳定性,拓宽应用范围。杨浩萌等 [ 25]通过 N端序
列改造构建了耐热高比活融合木聚糖酶 TB, 大肠杆
菌 BL21和毕赤酵母 GS115表达均显示 TB热稳定
性明显高于亲本 Strep tomyces o livaceovirid is木聚糖酶
XYNB,提高了 6倍。通过改变 N端序列 Q6E、T28E
增加了融合酶 TB的电负性,使 AA互作氢键发生改
变, 通过改变 G22P、S31P、N10H、N11D提高了 TB
疏水性,从而提高了 TB稳定性。
24 基因剂量
基因剂量 (即拷贝数 )直接影响外源蛋白的表
达量及表达效果。提高外源基因拷贝数获得重组子
的方法较多 [ 2 6 ] , 利用重复转化方法 [ 27 ]将第一次转
化筛选的已整合中性内切型纤维素酶基因 eg1的重
组子作为受体菌株制备感受态, 进行二次转化, 使
EG1表达水平提高了 34倍, 达 88 mg /mL; 将目的
基因进行多聚化, 转化表达载体 pAO815,结果胰岛
素目的基因从 1个增加到 11个拷贝时, 表达量从
19mg /L增加到 250 mg /L, 剂量效应显著 [ 28] ; 串联
方式增加基因剂量同样可以取得成功表达的结
果 [ 29] ; 套嵌 PCR ( overlap ex tension PCR)已是获得多
拷贝的又一途径, 在实际试验中利用该技术引入重
复序列亦能有效提高基因表达量;但也有反例,只有
单拷贝基因时外源蛋白才能高效表达 [ 3 0 ] , 这种结
果影响因素很多,如 mRNA翻译、蛋白折叠、分泌负
反馈效应等。
25 基因融合
融合表达是当前基因工程生产中普遍采用的技
术, 要充分了解目的基因的特性, 选择利于融合也利
于表达的外源基因和穿梭制粒载体, 获得的基因工
程产品也具有预测中的双重功效。韩建山等 [ 31]利
用该技术表达的重组蛋白既实现了对鳌虾的促生长
作用, 又实现了抗WSSV感染的保护效果。他将鲤
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 12期
鱼生长激素 ( Grow th ho rmone, GH )和 WSSV的囊膜
蛋白 VP28两种基因先后融合到表达载体 pPIC6c
中,分泌表达成功,进行蛋白生物功能测试也证明其
具有双重功能。
3 翻译后修饰
Ppastoris表达系统具有很高的翻译后修饰作
用,外源蛋白经过蛋白折叠、二硫键形成和 O、N糖
基化等翻译后修饰作用而成为成熟蛋白。杨毅
等 [ 3 ]利用 P pastoris表达抗对虾白斑综合症病毒单
链抗体 P1D3基因, 分泌表达的抗体基因经过系统
修饰折叠不但提高了表达量还具有了更高的生物活
性。李英华等 [ 32]同样利用了毕赤酵母的翻译后加
工修饰功能表达鲤鱼生长激素,结果表达产物具有
相应的免疫活性并以可溶状态存在胞内; 获得的酵
母工程菌投喂罗非鱼试验证明其具有明显的促生长
作用。
Ppastoris表达系统可在外源蛋白天冬酰胺残
基实现 N糖基化, 也可以在苏氨酸和 /或丝氨酸残
基实现 O糖基化, 产生高甘露糖型糖链的糖蛋白。
毕赤酵母 N糖基化改造已取得了重大进展 [ 33] , 定
点突变技术及去糖基化酶 endoglycisidase的利用亦
可降低外源蛋白的糖基化程度, 提高利用效率。黎
刚等 [ 34 ]利用组合基因文库来改造 P pastorisN糖基
化路径,产生了同哺乳动物 N糖基化蛋白质一样的
N连寡糖, 促进了蛋白功能研究, 更加提高了
Ppastoris表达系统的可利用性。
外源蛋白在 P pastoris中成功表达后信号肽加
工技术十分关键。酵母表达基因工程产物的一个问
题就是信号肽切除、加工不完全,表达产物中则出现
多特异条带现象。研究报道, Singh等 [ 35 ]通过启动
子和目的基因连接处寡核苷酸定向缺失诱变, 释放
含有天然 N端的成熟目的蛋白, 有效消除了因酵母
菌自我调节机制失效、二氨基肽酶活力不足以除去
氨基端 4个氨基酸而导致的信号肽切割不完全现
象。N iko lay等 [ 36]证实外源蛋白 N端保留若干氨基
酸影响表达, 在表达蛋白酶抑制子 ( Equ istatin, E I)
时去除 P pastoris表达载体 pPIC9K常用的多克隆
位点 MCS序列 ( TACGTAGAATTC) , 结果 E I表达量
在密码子优化基础上又提高了 4- 10倍,达 166 g /
L,然而, MCS序列对外源蛋白在 P pastoris表达的
影响机制有待于进一步研究。
4 表达产物稳定性提高措施
表达产物稳定性直接影响到其保质期、成本和
商业价值。提高外源蛋白稳定性的方法包括: ( 1)
使用蛋白酶缺陷型菌株, 如 SMD1168 ( his4 pep4 ),
缺失蛋白酶 A基因, 可有效抑制目的蛋白降解。蒋
思婧等 [ 3 7 ]分别利用 GS115、KM71、SMD1168表达枯
草芽孢杆菌寡糖1, 6葡萄糖苷酶基因, 酶活分别为
2233、034和 1235 U /mL, 显然 GS115是合适的
受体菌株,故可因试验需要选择合适的宿主菌株。
( 2)表达过程中使用蛋白酶抑制剂 ( PM SF或 Pepsta
tin)或添加酪蛋白水解物减少目的蛋白的损失。
Woo等 [ 38]在培养基中添加 1%酪蛋白水解物和 1-
3mmol /L PM SF, 使细胞免疫毒素 G4 S表达量达 35
mg /L,还可依试验要求添加一些金属离子或化学试
剂, 增加酶稳定性。 ( 3)设计引物时增加保护碱基。
曾昭醇等 [ 39 ]在 Ppastoris中利用 pPIC9K表达血管
生成抑制剂 A rresten时,所设计引物中增加了 6个
碱基 ACCCCA,显著降低了蛋白酶对产物的降解。
( 4)优化 P pastoris发酵条件 (溶氧量、pH、温度、时
间、甲醇浓度 )充分发挥高密度发酵的优势,既可提
高蛋白表达水平, 又可提高稳定性 [ 40 ]。易巧等 [ 41 ]
通过三因素 (发酵液起始 pH值、甲醇诱导浓度、诱导
时间 )对三突变体人白细胞介素2(M vhIL2)发酵条
件进行研究,从 3个不同水平上进行正交试验, 最终
使目的产物达到菌体总蛋白的 30%以上, 为其进一
步上发酵罐, 大量生产重组人白细胞介素2奠定了
基础。
5 结语
综上, P pastoris表达影响因素很多,错综复杂,
既有共性又有各自特点, 基因研究应用中其技术还
不完全,随着分子生物学技术、发酵技术、高密度培
养技术的推陈出新,借鉴其它领域的优势成就,可进
一步提高基因工程产品的应用, 尤其是水产养殖应
用中的毕赤酵母工程菌的广阔前景, 更为微生态制
剂、饲料添加剂的生产奠定良好的基础。
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