全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2009年第 5期
重组 Ecoli胆固醇氧化酶的分离纯化及其酶学性质研究
钟学敏 张玲 孙艳 杨海麟 王武
(江南大学工业生物技术教育部重点实验室,无锡 214122)
摘 要: 对重组 Ecoli产生的胆固醇氧化酶采用 70%硫酸铵盐析、CM Sepharose FF离子层析、Phenyl Sepharose 6 Fast
疏水层析、Sephadex G75凝胶过滤, 得到的胆固醇氧化酶在 SDSPAGE上呈单一蛋白质条带, 酶的纯化倍数为 93, 收率为
21%。部分酶学性质表明: 酶的最适反应温度为 37 , 最适反应 pH75,热稳定范围在 40 以下,酶的 pH稳定范围为 6~ 9,分
子量分别为 50 kD和 52 kD。酶动力学参数 Km值及 Vm ax分别为 8 2 105 m o l/L和 0 21 mm ol/ ( Lm in)。
关键词: 胆固醇氧化酶 重组 E coli 分离纯化 酶学性质
Purification and Partial Characterization of Cholesterol
Oxidase from RecombinantE coli
Zhong Xuem in Zhang L ing Sun Yan YangH ailin W angW u
(T heK ey Laboratory of Industrial Biotechnology, M inistry of Education, J iangnan University, Wux i 214122)
Abstrac:t In th is paper, cho lestero l ox idase o f recom b inantE co liw as pur ified using 70% satu ration of amm on ium su lfate, CM
Sepharose FF chrom atography, Pheny l Sepharose 6 Fast and Sephadex G75 The pur ified enzym ew as show ed as a sing le band on SDS
po lyacrylam ide ge l electropho resisPart o f properties o f the enzym ew ere stud ied The optim a l temperature and optima l pH w ere 37
and 7 5, the temperatu re stability range w as lower than 40 and the pH stab ility range w as 6 ~ 9The m o lecular w e ight w as dete r
m ined as 50 kD and 52 kDThe Vm ax va lue was 8 2 105 mo l/L and the Km va lue w as 021 mm o l/( Lm in)
Key words: Cho lestero l ox idase Recom binantE coli Purification Charac terization
收稿日期: 20081008
基金项目:国家 863计划课题资助项目 ( 2006AA10Z305) ,工业生物技术教育部重点实验室基金资助项目 ( KL IKF200505 )
作者简介:钟学敏 ( 1985) ,男,硕士研究生,研究方向:酶工程技术与应用; Em ai:l azhongm in@ 126 com
通讯作者:王武 ( 1952) ,女,教授,博士生导师,研究方向:发酵工程、遗传工程; Em ai:l w angwu@ jingnan edu cn
胆固醇氧化酶 ( Cho lestero l ox idase EC 1136)
是胆固醇降解代谢过程中的关键酶, 依赖辅酶
FAD,能专一性地催化胆固醇转化为胆甾 4烯3酮
( 4cho lesterol3one) [ 1]。胆固醇氧化酶是种多功能
酶,目前,检测血清中胆固醇含量就应用了胆固醇氧
化酶 [ 2]。此外,胆固醇氧化酶可以用于食品中胆固
醇的去除 [ 3] ; 作为一种高效的生物杀虫剂, 能有效
抑制鳞翅目昆虫的生长繁殖 [ 4]。
产胆固醇氧化酶的微生物主要包括诺卡氏菌
属、链霉菌属、短杆菌属、假单胞菌属、裂殖菌属、链
霉菌、红球菌属、芽胞杆菌属和棒状杆菌属等。多数
微生物均需要胆固醇诱导才能产胆固醇氧化酶。胆
固醇是脂溶性物质,难溶于水, 大部分研究者利用表
面活性剂促进胆固醇的分散,但表面活性剂与胆固
醇和胆固醇氧化酶会形成乳化体系, 对分离纯化带
来很大的困难。本实验室成功构建一株大肠杆菌,
解除胆固醇的诱导作用。目前, 国内外对基因工程
菌所产胆固醇氧化酶的分离纯化研究较少, 因此,本
试验主要对重组 E coli胆固醇氧化酶的分离纯化及
部分酶学性质进行了研究。
1 材料与方法
11 材料
111 主要仪器和试剂 GR22G高速冷冻离心机
日本 H ITACH I; AKTA纯化系统 GE Healthcare; CM
Separose FF、Pheny l Sepharose 6 Fast、Sephadex G75
购自 Sigma公司;低分子量标准蛋白购自宝生生物
工程有限公司;其它试剂为化学分析纯。
112 菌种 重组 Eco li由本实验构建并保藏。
2009年第 5期 钟学敏等:重组 E coli胆固醇氧化酶的分离纯化及其酶学性质研究
12 方法
121 粗酶液的制备 在胰蛋白胨 16%,酵母提取物
1%,甘油 1%, KH2PO4 02%, K2HPO4 04%, Na2HPO4
12H2O 7%, (NH4 ) 2SO4 012%, NH4C l 002%, MgSO4
7H2O 01%、微量元素溶液,初始 pH 70的发酵条件下
培养 3 h,诱导 5 h,发酵液离心 ( 10 000 r/m in),收集菌
体,用 pH 70磷酸钾缓冲液 ( 001mol /L)溶解, 200W, 50
kHz破碎 15m in后得到粗酶液。
122 胆固醇氧化酶的分离纯化
1221 (NH4 ) 2 SO4盐析 将粗酶液置于冰水浴中,
在磁力搅拌下缓缓添加研磨过的 ( NH 4 ) 2SO4至不同饱
和度 ( 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、
90% ), 4 静置,离心 ( 8 000 r/m in, 10m in), 测定各饱
和度下上清液的酶活。
1222 透析脱盐 将沉淀溶于 pH 70的 01 mo l/L
磷酸钾缓冲液中,再用 001 mo l/L磷酸钾缓冲液 ( pH
70)透析脱盐,在 4 下透析,每隔 4 h更换透析液。
1223 CM Sepharose FF层析 用 pH 70的 001
mo l/L磷酸钾缓冲液平衡 CM Sepharose FF阳离子交
换层析柱 ( 16 20 cm ),将透析后的酶液经聚乙二
醇 20000充分浓缩,上样。然后利用磷酸钾起始缓冲
液洗脱一定时间,通过阶段洗脱方法将酶液洗脱 (洗
脱梯度分别为 01、03、05 mo l /L的 pH 70的 NaC l
磷酸缓冲液 ),洗脱流速为 2m l/m in,合并酶活性较高
的收集液,并用聚乙二醇 20000浓缩。
1224 Pheny l Sepharose 6 Fast疏水层析 在上
述浓缩酶液中加入固体硫酸铵至 2 mol /L, 冷冻离
心,将上清液加到用含 2 mol /L硫酸铵的缓冲液平
衡好的 Pheny l Sepharose 6 Fast疏水柱 ( 26 25
cm )中。分别用 1、05、02、0 mo l/L硫酸铵缓冲液
阶段洗脱,流速 4 m l/m in。合并酶活性较高的收集
液,用聚乙二醇 20000浓缩。
1225 Sephadex G75凝胶层析 Sephadex G75
凝胶柱 ( 10 30 cm )用 pH 70的 001mol /L磷酸
钾缓冲液平衡,流速为 05m l/m in。将浓缩的样品上
样后用相同缓冲液以相同的流速进行洗脱。
1226 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 采用不连续
垂直板状 SDSPAGE系统, 浓缩胶和分离胶浓度分
别为 5%和 12%。电泳结束,经剥胶、固定、染色、脱
色,对凝胶结果拍照分析。
123 酶活力的测定 3 m l溶液 A ( 4氨基安替比
林: 1 mmol /L;苯酚: 6 mmo l/L;叠氮钠: 02 g /L;过氧化
物酶: 5 000 U /L; 磷酸钾缓冲液: 25 mmo l/L, pH 75),
150 l溶液 B(胆固醇: 826 mg /m ;l Triton X100:体积
分数 426%; 异丙醇为溶剂 ) , 50 l酶液, 37 反应 5
m in,沸水浴 3m in,于 500 nm测吸光度。酶活 (U /m l)
= 16832 A500。
酶活力单位定义: 37 , 1 m in转化 1 mo l胆固
醇生成胆甾4烯3酮的酶量定义为 1个酶活单位
( U )。
124 蛋白质浓度测定 采用 B radford检测法, 见
参考文献 [ 6]。
125 分子量的测定 分别采用 SDSPAGE和 Sepha
dex G75凝胶过滤层析两种不同的分子质量测定体
系。前者根据已知分子量的标准蛋白质在 SDSPAGE
中的相对迁移率 Rf,计算分子量。后者利用标准蛋白
的洗脱体积作横坐标,其分子量对数值为纵坐标,做标
准曲线。标准蛋白分别为:核糖核酸酶 ( 137 kD)、牛
胰蛋白酶 ( 233 kD)、卵白蛋白 ( 43 kD )、牛血清白蛋白
( 67 kD)、葡萄糖苷酶 ( 135 kD),根据胆固醇氧化酶
的洗脱体积,计算分子量。
126 酶的最适 pH及酸碱稳定性 酶液在温度
37 ,将酶反应体系的 pH分别调至 5、55、6、65、
7、75、8、85测定酶活,以最高点酶活为 100%; 将
酶液分别在 pH 3、4、5、6、7、8、9、10下处理 24 h, 测
定酶活,以未经处理的酶液酶活为 100%。
127 酶的最适反应温度及热稳定性 酶液在 pH
70,将酶反应体系的温度分别调至 25 、37 、40 、
45 、50 、55 、60 、65 测定酶活,以最高点酶活
为 100%;将酶液分别在 30 、40 、50 、60 下保温
一定时间,快速冷却至室温,测定酶活,以未经处理的
酶液酶活为 100%。
128 动力学参数的测定 用 pH 70的磷酸钾缓
冲液配制不同浓度的胆固醇底物溶液, 0025、005、
0075、01、0125、015、0175、02 mol /L,于 37
pH 75条件下测定胆固醇氧化酶水解胆固醇的反应
初速度。
2 结果与讨论
21 胆固醇氧化酶分离
211 (NH4 ) 2SO4盐析 采用不同浓度的 (NH4 ) 2SO4
65
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2009年第 5期
沉淀粗酶液中的胆固醇氧化酶,测定上清液中残留胆
固醇氧化酶活力,以未加 (NH4 ) 2SO4的酶液的酶活为
100%,测定结果见表 1。结果表明胆固醇氧化酶在
70%、80%、90% 沉淀比较完全, 考虑到高浓度的
(NH4 ) 2 SO4对酶活有影响,选用 70%的 ( NH4 ) 2 SO4对
粗酶液进行盐析。
表 1 不同浓度的硫酸铵沉淀后上清液中
残留的胆固醇氧化酶酶活
( NH 4 ) 2 SO4 浓度 (% ) 0 20 40 60 70 80 90
上清液残留酶活 (% ) 100 90 72 45 16 10 9
212 透析除盐 硫酸铵沉淀后的酶蛋白引入了大
量的盐离子,在进一步提纯之前需要除盐, 即降低离
子强度。将盐析后的沉淀溶于缓冲液中,透析至完全
除去 ( NH 4 ) 2SO4为止 (用 BaC l2溶液检查 SO4 2 ), 得
到胆固醇氧化酶酶液。
213 CM Sepharose FF离子层析 文献 [ 7]报道胆
固醇氧化酶等电点为 85, 因此选用阳离子交换柱
CM Sepharose FF。按方法所述,将透析后的胆固醇
氧化酶粗酶液进行离子层析阶段洗脱 (图 1)。
图 1 CM Sepharose FF离子层析洗脱曲线
由图 1可以看见, 洗脱曲线呈现 3个蛋白洗脱
峰,第一个峰被检测有酶活, 而且峰型较大, 说明胆
固醇氧化酶的等电点大于 7, 被吸附在离子柱上首
先被洗脱下来;而且在第一个梯度洗下来的还有一
些杂蛋白,还需进一步分离。其他两峰经检测无酶
活,均是杂蛋白, 无需进一步处理。
214 Pheny l Sepharose 6 Fast疏水层析 按方法所
述将离子层析后收集的酶液浓缩后进行疏水层析,洗
脱图谱见图 2。由图 2可知整个分离过程主要出现有
4个蛋白洗脱峰,首先被洗脱的是疏水性较弱的杂蛋
白,胆固醇氧化酶疏水性较强,在 02mo l/L硫酸铵浓
度梯度时被洗脱,最后被洗脱的是疏水性很强的杂蛋
白。通过分离说明经过离子层析后的酶液还含有大
量杂蛋白,采用分辨率高的疏水层析能够除去大量杂
蛋白。有酶活的第三个峰峰型较为细长,有可能分离
得到纯酶。用 SDSPAGE检验纯度 (图 5) ,发现还有
一种杂蛋白,分子量与胆固醇氧化酶相差较大, 所以
采用凝胶过滤进一步分离。
图 2 Phenyl Sepharose 6 Fast疏水层析洗脱曲线
215 Sephadex G75凝胶过滤 凝胶过滤是根据蛋
白质分子量不同而达到分离效果。据文献报道 [ 8],胆
固醇氧化酶的分子量范围一般在 30~ 60 kD,而 Sepha
dex G75的分离范围是 03~ 80 kD,故采用 Sephadex
G75分离纯化胆固醇氧化酶 (图 3)。
图 3 Sephadex G75凝胶过滤图谱
从图 3可以看出,经疏水层析后的活性组分再
经过 Sephadex G75凝胶过滤, 出现两蛋白质峰, 第
一个峰被检测有酶活,是活性峰, 第二个峰为杂蛋白
峰。收集活性部分, 用 SDSPAGE检验纯度 (见图
5),由图可知胆固醇氧化酶得到很好分离, 在电泳
图谱上显现单一的条带。
216 分离纯化结果 分别测定重组 E coli所产
胆固醇氧化酶经硫酸铵盐析、DEAE Separose FF离
66
2009年第 5期 钟学敏等:重组 E coli胆固醇氧化酶的分离纯化及其酶学性质研究
子层析、Pheny l Sepharose 6 Fast疏水层析、Sephadex
G75凝胶过滤分离纯化后所收集组分的酶活力、蛋
白质含量、纯化倍数, 结果如表 2所示。
表 2 胆固醇氧化酶的纯化结果
纯化步骤
总蛋白
( mg)
总酶活
(U )
比酶活
( U /m g)
纯化
倍数
收率
(% )
粗酶液 12200 3100 025 1 100
硫酸铵盐析 736 2356 32 128 76
DEAE Separose FF层析 127 1240 975 39 40
Ph eny lS epharose 6 Fast层析 543 870 195 78 28
Seph arose G75凝胶过滤 279 651 233 93 21
22 酶的分子量测定
Sephadex G75层析和 SDSPAGE测定的胆固醇
氧化酶纯化酶的分子质量分别为 52 kD和 50 kD,两种
方法测得的 M r相近,说明该酶由一条肽链组成 (图
5)。资料显示,不同来源的胆固醇氧化酶的M r有较大
差异,而且肽链数也不同。K iniyasu Isobe[ 9]筛选一株
能产胆固醇氧化酶的变型菌 Proteobacterium Y134的
分子量为 115 kD,含肽链两条。王龙刚 [ 7]报道短杆菌
所产的胆固醇氧化酶的分子量为 55 kD, 含有一条肽
链。本研究中重组 Ecoli的构建基因来源于短杆菌,
而且被切除信号肽,所以分子量小于 55 kD。
23 最适反应 pH及酸碱稳定性
胆固醇氧化酶的最适反应 pH及酸碱稳定性如
图 6、7所示。胆固醇氧化酶的最适反应 pH为 75,
该酶在 pH6~ 9范围内较稳定, pH 小于 6或大于 9
酶活迅速下降。酶在酸性条件下稳定性较差, pH为
3时酶活仅剩 20%。
24 最适反应温度及热稳定性
实验结果 (图 8,图 9)表明, 胆固醇氧化酶的
图 4 分子量标准曲线
1.低分子量标准蛋白; 2.粗酶液; 3. 盐析后的酶液; 4.离子交换后的
酶液; 5.疏水层析后的酶液. 6凝胶层析后的酶液
图 5 分离纯化后胆固醇氧化酶 SDSPAGE结果
图 6 胆固醇氧化酶的最适反应 pH
图 7 胆固醇氧化酶的 pH稳定性
最适反应温度为 37 , 在 37~ 40 范围内活力最
大, 反应速度最快。此酶对温度较为敏感,当反应温
度超过 40 时, 其反应速度就有大幅度下降, 这可
能是由于温度升高,部分酶蛋白变性,从而导致其活
性降低。胆固醇氧化酶的热稳定温度为 30 , 在此
67
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2009年第 5期
温度下保温 2 h, 酶活力保留 95% ;在 40 下, 保温
2 h后残留酶活 56%; 温度越高,胆固醇氧化酶就越
不稳定,胆固醇氧化酶在 50 保温 2 h酶几乎失活,
而在 60 时保温 80m in,酶活即完全损失。
图 8 胆固醇氧化酶的最适反应温度
图 9 胆固醇氧化酶的热稳定性
25 酶的动力学参数
依据 L inew eaverBurk法,分别以 1/ [ s]和 1/v为
横纵坐标作图 (图 9)。由此得到该酶的米氏方程: 1 /v
= 038661/ [ s] + 46656, R2 = 09996,该纯酶对胆固醇
的 Km和 Vmax分别为 82 10- 5 mo l/L和 021mmol/
( Lm in)。不同来源的胆固醇氧化酶对胆固醇的亲和
程度不同,但胆固醇氧化酶的 Km值一般在 10- 4 ~ 10- 5
mol/L之间。如 Tabatabae iYazdia[ 10]报道来源于链霉
菌的胆固醇氧化酶的 Km值 706 10- 5 mol/L。而
Kmi iyasu Isobe报道 Proteobacterium Y134产胆固醇氧
化酶的 Km值为 65 10- 5 mo l/L。本研究显示重组 E
coli所产的胆固醇氧化酶的动力学参数与其他菌
相近。
图 10 Linew eaverBurk图
3 结论
通过对重组 E coli产生的胆固醇氧化酶进行过
70%硫酸铵盐析、CM Sepharose FF离子层析、Pheny l
Sepharose 6 Fast疏水层析、Sephadex G75凝胶过滤
后, 胆固醇氧化酶被纯化了 93倍,收率为 21%。最
终获得在 SDSPAGE图谱上呈现单一蛋白条带。
对酶的部分酶学性质进行了研究,结果表明,酶的
最适反应温度和 pH分别为 37 和 75,酶的温度稳定
性较差,稳定范围在 40 以下,酶的 pH稳定范围为 6
~ 9。利用 SDSPAGE和 Sephadex G75测得该酶的分
子量分别为 50 kD和 52 kD。酶动力学参数 Km值和
Vmax分别为 82 10- 5mol/L和 021mmo l/ ( Lm in)。
参 考 文 献
1 吕陈峰,陈毅力,王龙刚,等 无锡轻工大学学报, 2001, 20( 5 ):
485~ 488
2 M alik V, Pund ir CS B iotechno lApp l B iochem, 2002, 35 ( 3 ):
191~ 197
3 吕陈峰,王龙刚,杨胜利,等 食品与生物技术, 2001, 20(6): 555~ 559
4 Purcell John P, Greenp late John T B iochem B iophys R es Com
m un, 1993, 196 ( 3) : 1406~ 1413
5 季文明,陈毅力,张和春,等 无锡轻工大学学报, 2000, 19( 3 ):
251~ 254
6 BradfordMM Anal B iochem, 1976, 151: 571~ 574
7 王龙刚, 梁爽, 王武 华东理工大学学报, 2007, 33 ( 2 ) : 190
~ 194
8 M acLach lana J, Wotherspoona ATL, An sella RO, et alM olecu lar B i
ology, 2000, 72: 169~ 195
9 K im iyasu Isobe, Kayako Shoj,i Yu ji Nakan ish ,i et al Journa lO eb io
scienceand B ioengin eerin, 2003, 95 ( 3) : 252~ 263
10 M Tabatabaei Yazd ia, Zahraeib, M Aghaepoura K, et al E nzym e
andM icrob ialTechnology, 2001, 28: 410~ 414
68