全 文 ：第 ! 卷第 # 期
$%&& 年 && 月
生"物"加"工"过"程
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收稿日期%$%&& <%3 <&4
基金项目%国家重点基础研究发展计划"!4 计划#资助项目"$%&&)-4%41%(#&国家自然科学基金资助项目"$&%4#&%(#&江苏高校优势学科建
设工程资助项目
作者简介%陈可泉"&!3$#$男$江苏南京人$博士$讲师$研究方向%发酵工程)代谢工程&姜"岷"联系人#$教授$0*HGD>%6DBAEFDEAgEP=?;AI=;XE
氮源对重组大肠杆菌发酵产 5 精氨酸的影响
陈可泉$马江锋$姜"岷$韦"萍$孙娜亚
"南京工业大学 生物与制药工程学院 材料化学工程国家重点实验室$南京 $&%%%!#
摘"要%考察有机氮源种类)蛋白胨用量以及",N
1
#
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1
用量对重组 230$#+发酵产 - 精氨酸的影响( 结果表明%
以蛋白胨作为有机氮源且用量在 &% F2.$",N
1
#
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1
用量在 &( F2.时$摇瓶发酵产 - 精氨酸产量最高$达到 !c1
F2.( 在 ( .发酵罐进行补料分批培养$通过补加",N
1
#
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Y[
1
$- 精氨酸产量可以达到 &3c3 F2.$比未补加提高
了 &%3c!h(
关键词% - 精氨酸&发酵&氮源&重组230$#+
中图分类号%b5!$$""""文献标志码%L""""文章编号%$ <#43"$%&&#%# <%%&& <%1
#770:F27/.F42;0/1234:012/5H54;././0942G3:F.2/JL 40:2IJ./5/F6-2$#+
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GEI 98G@HGXA=?DXG>0EFDEAA@DEF$ ,GEPDEFREDaA@JD?VBCbAX8EB>BFV$ ,GEPDEF$&%%%!$ )8DEG#
*J1F45:F%b8AACAX?BCED?@BFAE JB=@XAJBE -*G@FDEDEAU@BI=X?DBE 6V@AXBH6DEGE?230$#+\GJJ?=IDAI;b8A
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K0L M24G1%-*G@FDEDEA& CA@HAE?G?DBE& ED?B@FAE JB=@XA& @AXBH6DEGE?230$#+
""- 精氨酸是生物体内的半必需碱性氨基酸$是
尿素循环中重要的中间代谢物$具有多种生理)药
理作用$在临床医药)食品)化妆品等领域中具有广
泛的用途*& <$+ (
国外发酵法产 - 精氨酸早已实现工业化$产量
达到 1% F2.以上*+ ( 但国内发酵法产 - 精氨酸目
前仍处于实验室研究开发阶段$还未实现产业化(
国内的 - 精氨酸生产菌株主要由黄色短杆菌或谷
氨酸棒杆菌经过诱变得到$产酸水平一般在 h左
右*1 <(+ ( 由于大肠杆菌"230$#+#对营养条件需求简
单$并具有生长迅速)遗传背景清楚)易调控)易改
造等特点$近年来改造大肠杆菌生产 - 精氨酸受到
了研究人员的广泛关注*# <4+ ( 培养基中 ,源主要
用于构成菌体细胞和含氮化合物( - 精氨酸是碱
性氨基酸$含氮量高达 $c&h( 因此$,源优化对
于.精氨酸合成的意义重大( 笔者利用所在实验
室保存的一株重组 230$#+L%&$优化其发酵产 -
精氨酸的,源$以提高 - 精氨酸产量(
D?材料与方法
DND?菌株
重组230$#+L%&"笔者所在实验室保存$遗传
标记%带有蛋氨酸和苏氨酸缺陷型标记$重组质粒
带有乙酰谷氨酸合成酶L@FL和蔗糖水解酶 YGXL#(
DNB?培养基
&c$c&"斜面平板培养基"F2.#
,G)>&c%$,G
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[c%$,N
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)>$c%$蛋
白胨 (c%$ TFY[
1
$c#$蛋氨酸 %c%1$苏氨酸 %c%1$硫
胺素 %c&$葡萄糖 3c%$卡那霉素 %c%&$琼脂 $%c%(
&c$c$"种子培养基"F2.#
蛋白胨 $c%$TFY[
1
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$c%$尿素 (c%$
蛋氨酸 &c($苏氨酸 &c($硫胺素 %c&$蔗糖 $%c%$卡
那霉素 %c($ )G)[
%c%(
&c$c"发酵培养基"F2.#
蛋白胨 &(c%$TFY[
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[%c%&$蛋氨酸&c($
苏氨酸 &c($硫胺素 %c&$蔗糖 #%c%$卡那霉素 %c($
)G)[
(%c%(
DNQ?培养方法
&cc&"摇瓶发酵培养
<4% l保存的菌种在斜面平板培养基中 % l
活化 &# 8$然后转接至种子培养基中% l)&3%
@2HDE摇床培养 &# 8$(h接种量转接发酵培养基中
在 % l)&3% @2HDE 摇床中培养 !# 8( 摇瓶发酵培
养结果取 次平行实验的平均值(
&cc$"( .发酵罐培养
( .发酵罐中发酵培养基的装液量为 .$接种
量为 (h$搅拌转速为 1%% @2HDE)% l培养 4$ 8(
采用氨水调节 UN时$不添加 (% F2.)G)[
$调节
UN至 #c3( 补加",N
1
#
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1
培养时$当分批培养
$1 8后$每 &$ 8 添加无菌的 ( F2.",N
1
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1
溶液$
添加 1 次共计 $% F2.",N
1
#
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Y[
1
( ( .发酵罐培养
结果取 $ 次平行实验的平均值(
DNV?分析方法
&c1c&"菌体生长的测定
单位体积发酵液中加入双倍体积 $ HB.2.的盐酸
后$稀释 $(倍$/R#(%型紫外 可见分光光度计"-AXW*
HAE#在 #%% EH处测定发酵液中菌体光密度"[/
#%%
#$
蒸馏水为空白对照( 以[/
#%%
为 & 等于每升发酵液中
含 %c1(% F细胞干质量来换算细胞干质量"/)S#(
&c1c$"- 精氨酸的测定
采用N9.)*0.Y/法来测定 - 精氨酸*3+ (
B?结果与讨论
BND?有机$源种类对发酵产5 精氨酸的影响
培养基中的有机 ,源可以提供菌体生长繁殖
的营养$有的还是产物合成的前体物( 采用酵母
粉)牛肉膏)蛋白胨)玉米浆和大豆饼粉分别作为有
机,源"添加量按照总氮量等于 &( F2.蛋白胨$即
$c%1 F2.#$考察其对 - 精氨酸产量的影响$结果见
表 &( 由表 & 可知%不同有机 ,源对重组 2c0$#+产
- 精氨酸的产量影响显著$以蛋白胨作为 ,源时$
重组2c0$#+发酵产 - 精氨酸的产量最高$其次是玉
米浆)大豆饼粉)牛肉膏$以酵母粉作为 ,源时产量
最低( 这可能由于不同有机 ,源中含有的产物合
成前体)生长因子等成分存在差异所致(
表 D?有机$源对5 精氨酸产量的影响
E5J60D?#70:F127G.7040/F24;5/.:/.F42;0/1234:012/5H54;././0942G3:F.2/
有机,源 玉米浆 酵母膏 牛肉膏 蛋白胨 大豆饼粉
"
"- 精氨酸#2"F!.<&# 1c3 i%c# %c1 i%c &c i%c 4c$ i%c( c# i%c$
BNB?蛋白胨用量对发酵产5 精氨酸的影响
考察发酵培养基中蛋白胨用量对细胞生长以
及 - 精氨酸产量的影响"图 &#( 由图 & 可知%蛋白
胨添加量较低时$菌体细胞干质量和 - 精氨酸产量
都较低&随着蛋白胨用量的增加$菌体细胞干质量
也随之增加$但蛋白胨量过多"大于&% F2.#$菌体
生长过于旺盛$- 精氨酸产量反而下降( 因此$发
酵产 - 精氨酸的蛋白胨最佳用量为 &% F2.$此时
- 精氨酸产量达到 4c# F2.(
$& 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
图 D?蛋白胨用量对5 精氨酸产量的影响
O.;=D?#70:F127909F2/0:2/:0/F45F.2/2/
5H54;././0942G3:F.2/
BNQ?"$"
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用量对5 精氨酸产量的影响
",N
1
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不仅含有菌体生长和氨基酸生产所
需的氮元素$其中 Y[$<
1
也是菌体含硫化合物代谢中
不可缺少的成分( ",N
1
#
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Y[
1
作为无机,源被广泛
应用于氨基酸的发酵生产*! <&%+ ( 考察发酵培养基中
不同",N
1
#
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Y[
1
量对菌体生长及 - 精氨酸产量的影
响"图 $#( 由图 $可知%当培养基中",N
1
#
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1
质量
浓度大于 &% F2.$菌体细胞干质量在逐渐下降( 由此
可见$",N
1
#
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1
对菌体生长存在抑制作用( 当
",N
1
#
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1
用量从 ( F2.增加至&( F2.$- 精氨酸产
量随之增加&继续增加",N
1
#
$
Y[
1
用量$- 精氨酸产
量反而下降( 在",N
1
#
$
Y[
1
用量在 &( F2.时$- 精
氨酸产量最高达到 !c1 F2.( 当,Nj
1
作为培养基无
机,源时$,Nj
1
质量浓度高于 c& F2.时$会抑制重
组大肠菌体的生长*&&+ ( 同样$在利用重组 230$#+发
酵产 - 色氨酸的过程中$",N
1
#
$
Y[
1
亦对菌体生长
存在抑制作用*!+ ( 因此$减少铵盐的抑制作用是提高
- 精氨酸产量的关键(
图 B?"$"
V
#
B
!+
V
用量对菌体生长和5 精氨酸产量的影响
O.;=B?#70:F127:2/:0/F45F.2/27"$"
V
#
B
!+
V
2/:06
;42MF-5/G275H54;././0942G3:F.2/
BNV?W [发酵罐补料分批发酵产5 精氨酸
""为了降低铵盐对重组 230$#+发酵产 - 精氨酸
的抑 制 作 用$ 采 用 补 加 氨 水 以 及 间 歇 补 加
",N
1
#
$
Y[
1
$ 种补料方式考察对 - 精氨酸产量的
影响$起始蛋白胨为 &% F2.$ ",N
1
#
$
Y[
1
用量为
&( F2.( 在发酵过程中通过流加氨水控制 UN的
方式添加无机 ,源$在起始的 $1 8 内$添加的
,N
j
1
质量浓度达到 &c# F2."根据实验过程中添
加的氨水总量换算得到此数据#$而 - 精氨酸的
产量仅为 (c1 F2."图 #$此时发酵液中总 ,Nj
1
浓
度达到重组 230$#+受抑制的 ,Nj
1
浓度 1 倍以
上*&&+ ( 由图 可知%随着氨水的添加$菌体生长受
到明显的抑制作用$最终的 - 精氨酸产量低于对
照样( 而通过分批添加",N
1
#
$
Y[
1
的方式可以显
著提高 - 精氨酸产量( 对照样在发酵 $1 8 后
- 精 氨 酸 产 量 几 乎 不 再 增 加$而 通 过 补 加
",N
1
#
$
Y[
1
$- 精氨酸产量保持增加趋势( 通过 1
次共计流加 $% F2.",N
1
#
$
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1
$- 精氨酸最终产
量达到 &3c3 F2.$比对照提高了 &%3c!h( 因此$
通过补加",N
1
#
$
Y[
1
$减少了 ,Nj
1
的抑制作用$提
高了 - 精氨酸的产量(
图 Q?补料方式对菌体生长和5 精氨酸产量的影响
O.;=Q?#70:F127700G./; I2G02/:06;42MF-
5/G5H54;././0942G3:F.2/
&"第 # 期 陈可泉等%氮源对重组大肠杆菌发酵产 - 精氨酸的影响
Q?结?论
有机,源对重组230$#+产 - 精氨酸的产量影
响显著$蛋白胨为最佳的有机 ,源&蛋白胨用量增
加$重组230$#+的生长也随之增加$但过高的蛋白胨
用量对 - 精氨酸产量不利( 无机 ,源",N
1
#
$
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1
对菌体生长及 - 精氨酸的积累存在一定的抑制作
用( 在蛋白胨用量 &% F2.)",N
1
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1
用量 &( F2.
时$摇瓶发酵产 - 精氨酸产量最高达到!c1 F2.(
在 ( .发 酵 罐 通 过 补 加 ",N
1
#
$
Y[
1
$ 减 少
",N
1
#
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Y[
1
对菌体生长及 - 精氨酸的积累的抑制
作用$- 精氨酸产量达到 &3c3 F2.$比对照提高了
&%3c!h( 今后实验可通过监控发酵液中 ,Nj
1
浓
度$进一步优化补料策略来提高 - 精氨酸的产量(
参考文献%
* & +"单永红$刘炳成;- 精氨酸%多功能的生化药物*++;生物生
化药物杂志$$%%&$$$"(#%$#(*$#4;
* $ +"彭瑛$蔡力创;精氨酸的保健作用及其调控研究进展*++;湖
南理工学院学报%自然科学版$$%%&$$1"&#%(!*#$;
* +"王霞$陶文沂$孙志浩;- 精氨酸发酵研究进展*++;工业微
生物$$%%%$%"1#%(%*(1;
* 1 +"赵俊平$黄继红$和晶亮$等;,j注入 - 精氨酸产生菌诱变
育种的研究*++c发酵科技通讯$$%%#$("$#%*(;
* ( +"苏令鸣$王宜敏c- 精氨酸产生菌的选育及其发酵条件的研
究*++;工业微生物$$%%$$$"&#%&*1;
* # +"刘建成$宋佳$娄恺;产 - 精氨酸基因工程菌发酵培养基优
化*++;新疆农业科学$$%%3$ 1("(#%!!*!11;
* 4 +"M=JVG?DEA@TT$.ABEBaGbf$ 9?D?JVE .e$A?G>c-*G@FDEDEAU@B*
I=XDEF2,0"&%+0"+ 0$#+GEI HA?8BI BCU@BI=XDEF-*G@FDEDEA%RY$
4%($331*9+c$%%#*%(*%c
* 3 +"姜岷$王倩楠$苏溧$等;N9.)*0.Y/法测定发酵液中 - 精氨
酸含量*++;生物加工过程$$%%#$1"1#%#&*#1;
* ! +"黄静$史建明$霍文婷$等;氮源对 -*色氨酸发酵的影响*++;
食品与发酵工业$ $%&&$4"(#%$&*$(;
*&%+"冯志彬$王东阳$徐庆阳$等;氮源对 -*苏氨酸发酵的影响
*++;中国生物工程杂志$ $%%#$$#"&&#%(1*(3;
*&&+"b8BHUJBE -M$ B^>AT$MA@JBE [];)BE?@B>BCGHHBED=HXBE*
XAE?@G?DBE DE 2,0"&%+0"+ 0$#+CA@HAE?G?DBE *++c-DB?AX8EB>-DB*
AEF$&!3($$4%
""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""
3&3*3$1;
国内简讯
中科院徐国良等阐明卵细胞重编程机制
中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所徐国良和李劲松课题组在,,G?=@A-上发
表了关于卵细胞重编程机制的研究成果( 此成果阐明了自然受精和克隆过程中卵细胞重编程的机制$使人
们对早期胚胎如何获得正常的发育能力有了更清晰的认识( 精子和卵细胞融合为一个受精卵的过程$是动
物个体发育的起点( 为了形成一个具有发育全能型的早期胚胎$卵细胞需要对精子基因组进行一系列的重
编( 其中$最为重要的一项就是基因组/,L上胞嘧啶碱基的去甲基化( 以前$人们并不清楚这种化学修饰
的改变是如何实现的$也不知道它为什么要发生( 徐国良和李劲松等的研究发现$来自卵细胞的一个叫
.bA?/的母源蛋白可以氧化精子基因组/,L$并进一步调控父源基因的表达$以支持早期胚胎的正常发育(
卵细胞去除.bA?/氧化酶的母鼠生育力显著下降$大部分胚胎在妊娠期发生了退化$被母体吸收( 此外$在
动物克隆过程中$.bA?/也同样发挥着重要的作用( 这项研究为开发女性不孕不育症的治疗手段提供了新
的理论依据和参考$也为提高动物克隆效率带来了新的希望(
"胡晓丽#
1& 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"