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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011年第 5期
蒙古冰草MwLEA3基因 ihpRNA表达载体的构建
石凤敏 1, 2 云锦凤 1, 2, 3 赵彦1, 2
( 1内蒙古农业大学生态环境学院,呼和浩特 010019; 2内蒙古自治区草品种育繁工程技术研究中心,呼和浩特 010019;
3内蒙古农业大学草地资源教育部重点实验室,呼和浩特 010019)
摘 要: 采用 RT-PCR方法从蒙古冰草中克隆出 MwLEA3基因的特异性 cDNA序列,并连入克隆载体 pGM-T中。根据
植物中 ihpRNA原理,成功构建了 35S启动子调控的具有 MwLEA3基因反向重复结构的 ihpRNA表达载体 pART27-MwLEA3
( HB )-MwLEA3( EX ) ,并通过冻融法转化将 MwLEA3基因的 ihpRNA表达框架成功导入根癌农杆菌 LBA4404中。
关键词: 蒙古冰草 MwLEA3基因 ihpRNA表达载体
Construction of ihpRNA Expression Vector ofMwLEA3
Gene from MongolianWheatgrass
ShiF engm in
1, 2 Yun Jinfeng1, 2, 3 ZhaoYan1, 2
(
1
College of Ecology and Environmental Science, InnerM ongolia Agricultural University,H uhhot 010019;
2
InnerM ongo lia Engineering and Technique Center for Forage B reeding and Reproduction, H uhhot 010019;
3
InnerM ongolia Agricultural University, Key Laboratory of Grassland R esourcesM inistry of Education, H uhhot 010019)
Abstrac:t A spec ific cDNA fragment o f theMwLEA3 genew as amp lified by RT-PCR from the to ta lRNA from M ongo lian whea-t
g rass, and then inserted into pGM-T vector. The ihpRNA expressed vector pART27-MwLEA3( HB)-MwLEA3( EX ) wh ich w as contro lled
by C aMV 35S prom oterw as construc ted w ith inverted repeats o fMwLEA3 gene. It was in troduced into LBA4404 o fAgrobacter ium tum e-
faciens w ith freeze- thaw m ethod fo r follow ing-up researches.
Key words: Agropy ron m ongolicum Keng MwLEA3 gene ihpRNA expression vector
收稿日期: 2010-11-04
基金项目: / 9730项目子课题 ( 2007CB108901-1 ) ,国家自然科学基金资助项目 ( 30760159 ) ,内蒙古草业重大专项 ( 20091401)
作者简介:石凤敏,女,博士研究生,研究方向:植物分子遗传学; E-m ai:l sh ifengm in318@ 163. com
通讯作者:云锦凤,女,教授,博士生导师,研究方向:牧草遗传育种; E-m ai:l csgrass@ v ip. 163. com
植物胚胎发育晚期丰富蛋白 ( La te-embryogene-
sis-abundan t prote in, LEA protein)是在种子成熟过程
逐渐产生的,通常在植物胚胎发生后期种子内大量
积累的一系列蛋白质, 广泛存在于高等植物中 [ 1 ]。
其中, 第 3组 LEA基因具有结构特征最明显、序列
保守性强等优点,受到人们的广泛关注,在小麦、大
麦、油菜、大豆、棉花和玉米等多种植物中都有关于
第 3组 LEA蛋白或基因的报道, 众多研究证明第 3
组 LEA蛋白具有干旱保护功能 [ 2- 6]。
RNA介导的基因沉默是指在进化中高度保守
的由双链 RNA ( doub le stranded RNA, dsRNA )诱导
细胞内与之同源的互补 mRNA降解, 从而阻断相应
基因的表达,出现转录后水平的基因沉默 ( post tran-
scriptional gene silence, PTGS ), 生物体产生相应的
功能缺陷表型。研究发现, 带有柄环结构的双链
RNA特别是带有内含子 ( intron)的 ihpRNA诱导的
靶基因沉默,无论在诱导的频率上还是在基因沉默的
程度上均优于共抑制或反义 RNA技术, 其诱导的靶
基因沉默转基因植株其性状可以稳定遗传 [ 7, 8]。近年
来, RNA基因沉默技术发展迅速, 已经成为一种高
效、可靠的抑制植物基因表达, 验证基因功能和改良
植物品质的有力工具,得到了广泛应用 [ 9- 13]。
本研究利用基因工程技术,根据 RNA基因沉默
原理,构建了蒙古冰草 MwLEA 3基因的 ihpRNA表
达载体 pART27-MwLEA 3 (HB )-MwLEA 3 ( EX ), 并
将该表达载体转化到根癌农杆菌 LBA4404中,以期
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 5期
为进一步研究蒙古冰草 MwLEA3基因的遗传转化
及功能鉴定奠定基础。
1 材料与方法
111 材料
11111 菌株与质粒 大肠杆菌 (E 1coli ) TOP10感
受态购自天为时代生物工程公司;农杆菌 LBA4404
由内蒙古大学生命科学学院张鹤龄教授惠赠; 质粒
pHANN IBAL、pART27由澳大利亚 Peter M Water-
house博士惠赠。
11112 酶和试剂 Taq DNA聚合酶、限制性内切
酶、RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、DNA回收试剂
盒、连接试剂盒、质粒小量抽提试剂盒, 均购自
TaKaRa公司和天为时代生物工程公司; 其他常规试
剂采用进口分装或国产分析纯;引物合成及基因测
序由上海生工生物工程公司完成。
112 方法
11211 蒙古冰草 MwLEA3基因片段的克隆 根据
载体质粒及 MwLEA3基因位点分布情况,应用 DNA-
man软件设计特异性引物,考虑到目的片段在 ihpR-
NA表达载体的插入位置和顺序,分别在引物的 5c端
插入不同的限制性内切酶酶切位点。引物序列如下:
P rimer1: 5c-GAATTC AAGCTTAGTGGTGGTGTT-
GGTGTTGT-3c(E coRÑ& H ind Ó ); P rimer 2: 5c-CTCGA
GGATCCGACAGGGCAGATGATGGTCT-3c ( Xho Ñ &
BamH Ñ),由上海生工生物工程公司合成。
取自然干旱 7 d后蒙古冰草叶片,参照北京天为
时代生物工程公司的总 RNA提取试剂盒说明书提取
总 RNA, 用 Quant Reverse Transcriptase合成第一链
cDNA。以反转录得到的 cDNA第一链为模板, 通过
RT-PCR扩增蒙古冰草 MwLEA3基因部分 cDNA片
段。 PCR反应体系为: cDNA110 LL, Taq M ix 1215
LL,上下游引物各 110 LL,加 ddH2O至 25 LL。PCR
扩增程序: 94e 预变性 5m in; 94e 变性 30 s, 65e 复性
30 s, 72e 延伸 60 s, 30个循环; 72e 后延伸 10 m in。
RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离, 回
收纯化后连接到克隆载体 pGM-T vector上,连接产
物转化大肠杆菌 ( TOP10)感受态细胞, 经过蓝白斑
筛选并提取质粒 DNA,经过 PCR和酶切方法鉴定后
送至上海生工生物工程公司测序。
11212 ihpRNA表达载体的构建与鉴定 根据植物
中 ihpRNA原理, 将 RT-PCR得到的 MwLEA3基因
的部分 cDNA片段分正反向连入植物表达载体, 具
体操作过程如下:
¹用 H in dÓ-BamH Ñ分别双酶切质粒 pGM-T-
MwLEA3和载体 pHANN IBAL, 回收 pHANN IBAL
( HB )片段与 MwLEA3( HB )片段, 将两个片段连接
为质粒 pHAN-MwLEA3(HB );
º 用 E coRÑ-XhoÑ 分别双酶切质粒 pHAN-
MwLEA3 ( HB ) 和 pGM-T-MwLEA3, 回收 pHAN-
MwLEA3(HBEX )和 MwLEA3( EX ), 并将两个片段
连接为 中间表 达载 体 pHAN-MwLEA3 ( HB )-
MwLEA3( EX) ;
» 用 N ot Ñ单 酶切质 粒 pART27与 pHAN-
MwLEA3(HB)-MwLEA3( EX ) ( 2) ,回收 11 kb的线状
pART27与 4 kb的 MwLEA3( HB )-MwLEA3 ( EX )片
段,将两个片段连接为 ihpRNA表达载体 pART27-
MwLEA3(HB)-MwLEA3( EX)。
11213 ihpRNA表达载体转化根癌农杆菌及检测
制备根癌农杆菌 LEA4404感受态细胞, 并用质粒小
量抽提试剂盒提取 ihpRNA 表达载体 pART27-
MwLEA3(HB )-MwLEA3( EX )质粒 DNA, 采用冻融
法 [ 14]转入根癌农杆菌 LBA4404感受态细胞中, 在
含 50mg /mL卡那霉素的 YEB固体培养基上筛选阳
性克隆,对转化得到的单菌落进行 PCR鉴定。
2 结果与分析
211 蒙古冰草 MwLEA 3基因片段的克隆
以蒙古冰草总 RNA经 RT-PCR扩增获得的 cD-
NA为模板, 以 Pr imer1和 Primer2为特异引物进行
PCR扩增。 PCR产物经电泳得到一条与预期大小
相符的特异性条带 (图 1) , 片段大小约为 520 bp。
将其回收后克隆到 pGM-T载体上, 提取阳性克隆质
粒 DNA,以其为模板进行 PCR (图 2)和酶切 (图 3)鉴
定并测序。测序结果经 BLAST及 DNAMAN等软件
分析对比表明本研究所得到的 MwLEA3片段符合构
建 ihpRNA表达载体的需要, 并将所获得的带有
MwLEA3片段的重组质粒命名为 pGM-T-MwLEA3。
212 ihpRNA表达载体的构建与鉴定
根据植物中 ihpRNA原理, 将 RT-PCR得到的
MwLEA3基因的部分 cDNA片段分正反向连入植物
表达载体,构建流程如图 4所示。
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2011年第 5期 石凤敏等:蒙古冰草MwLEA3基因 ihpRNA表达载体的构建
M. 100 bp DNA M arker; 1, 2. MwLEA3目的基因
图 1 MwLEA3基因片段
M. 100 bp DNA M arker; 1- 6. pGM-T-MwLEA3质粒 PCR
图 2 pGM-T-MwLEA3质粒 PCR检测
M 1. DL15000; M 2. 100 bp DNA M ark er; 1, 2. pGM-T-MwLEA3质粒;
3, 4. pGM-T-MwLEA3质粒酶切
图 3 pGM-T-MwLEA3的酶切检测
21211 中间表达载体 pHAN-MwLEA3(HB)-MwLEA3
(EX)的构建与鉴定 首先,用H in dÓ-BamHÑ双酶切
质粒 pGM-T-MwLEA3 与载体 pHANN IBAL, 回 收
pHANN IBAL(HB)片段与 MwLEA3(HB)片段 (图 5),
并用 T4 DNA连接酶连接,转化到大肠杆菌 TOP10感
受态细胞中,经 LB固体培养基筛选后进行 PCR(图
6)及H ind Ó-BamHÑ双酶切鉴定 (图 7),获得重组质
粒 pHAN-MwLEA3(HB);然后用 E coRÑ-XhoÑ双酶切
质粒 pHAN-MwLEA3 (HB )与 pGM-T-MwLEA3, 回收
pHAN-MwLEA3(HBEX)和 Mw-LEA3( EX) ,并进行连
接转化,抗生素筛选后进行 PCR、H ind Ó-BamH Ñ及
E coRÑ-XhoÑ双酶切鉴定 (图 8), 获得中间表达载体
pHAN-MwLEA3(HB)-MwLEA3( EX)。
21212 ihpRNA表达载体的构建与鉴定 用N otÑ分
别酶切质粒 pART27与中间表达载体 pHAN-MwLEA3
(HB)-MwLEA3( EX ) (图 9), 回收 11 kb的 pART27
片段与 4 kb的 MwLEA3(HB)-MwLEA3(EX )片段,用
T4 DNA连接酶连接, 转化到大肠杆菌 TOP10感受态
细胞中,用含有 50mg /mL卡那霉素的 LB固体培养
基筛选后进行 PCR鉴定 (图 10) ,获得 ihpRNA表达
载体 pART27-MwLEA3( HB )-MwLEA3 ( EX )。其中,
MwLEA3(HB)的插入方向与 35S启动子的方向相同,
MwLEA3( EX )的插入方向与 35S启动子的方向相反
(图 4),这种结构使转录产物通过杂交形成 ihpRNA,
从而使 MwLEA3基因沉默。
213 ihpRNA表达载体转化根癌农杆菌及检测
将已构建的 ihpRNA表达载体 pART27-MwLEA3
(HB)-MwLEA3( EX) ,通过冻融法导入根癌农杆菌
LBA4404感受态细胞中, 用卡那霉素进行筛选, 对
转化得到的单菌落用 MwLEA3基因的特异引物
Pr imer1和 Prim er2进行 PCR鉴定 (图 11)。经检
测, ihpRNA 表 达载体 pART27-MwLEA3 ( HB )-
MwLEA3( EX)已成功转入农杆菌 LBA4404中,可直
接用于后续的遗传转化。
3 讨论
RNA i是基因转录后沉默的一种方式,是生物界
古老而且进化上高度保守的现象之一。它能够高效
地关闭生物体内某一基因的表达, 产生相应的功
能缺陷表型, 从而确定特定基因的功能。因此,
RNA i作为一种反向遗传学工具对分析植物基因
功能和品质遗传改良具有非常重要的作用。可用
于沉默植物基因的 RNA结构有正向 ( cosuppres-
sion) RNA、反向 ( antisense) RNA、发卡 RNA ( ha ir-
p inRNA, hpRNA )和含有内含子的发卡 RNA ( intron-
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 5期
图 4 ihpRNA表达载体构建流程
conta in ing ha irp in RNA, ihpRNA )。其中带有内含子
的 ihpRNA表达载体导入植物体后, 在转录过程中
产生含 intron的 mRNA发卡结构,形成稳定的双链
RNA ( dsRNA )诱导同源的内源基因,平均可以得到约
90%的沉默转基因株系,具有较高的沉默效率 [ 8]。目
前,带有内含子的发卡结构 RNA( ihpRNA )高效克隆
和表达载体用于特定基因表达调控及功能研究是
RNA i技术应用在植物研究的热点之一。
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2011年第 5期 石凤敏等:蒙古冰草MwLEA3基因 ihpRNA表达载体的构建
M 1.DL15000; M 2. 100 DNA M arker; 1, 2. pGM-T-MwLEA3质
粒双酶切; 3. pHANN IBAL载体双酶切
图 5 pGM-T-MwLEA3以及 pHANNIBAL载体双酶切
M. 100 bp DNA Marker; 1- 4. pHAN-MwLEA3 (HB )质粒 PCR
图 6 pHAN-MwLEA3(HB)质粒 PCR检测
M1. DL15000;M 2. M arker I; 1, 2. pHAN-MwLEA3(H B)质粒
H indÓ-BamHÑ双酶切; 3, 4. pHAN-MwLEA3(HB )质粒
图 7 pHAN-MwLEA3(HB)H ind Ó-BamHÑ双酶切检测;
本试验中在扩增 MwLEA3目的基因片段时, 在
所设计的上下游特异引物 5c端分别添加了一对酶
切位点,这样设计酶切位点比设计正反序列两对引
物要方便,在合成引物、目的基因扩增、序列测序等方
面大大节省了物力和财力。这两对酶切位点位置的
设计是成功构建 ihpRNA载体的关键。因为要构建
含有内含子的 ihpRNA表达载体,在内含子两端的目
的基因序列 MwLEA3必须是反向重复的。根据载体
酶切位置及目的基因中酶切位点分布设计引物, PCR
扩增将得到 /E coRÑ-H indÓ -目的基因 - BamHÑ-
Xh oÑ0结构的基因片段,分别经过H in d Ó-BamH Ñ
M 1. DL15000; M 2. M ark er I; M 3. DL15000& M arker I; 1 - 4. pHAN-MwLEA3 (H B )-MwLEA3 ( EX)质粒 PCR; 5- 8. pHAN-MwLEA3
(H B)-MwLEA3 ( EX )质粒 H indÓ-BamHÑ双酶切; 9- 12. pHAN-MwLEA3(H B )-MwLEA3( EX )质粒 E coRÑ -XhoÑ双酶切
图 8 pHAN-MwLEA3(HB)-MwLEA3(EX)质粒 PCR及双酶切检测
双酶切和 E coRÑ-XhoÑ双酶切后, 可以得到正确的
ihpRNA结构。另外, 因为 E coRÑ和 XhoÑ酶切位
点分别在酶切位点H indÓ、BamH Ñ的外侧, 如果先
进行 E coRÑ-XhoÑ双酶切, 再用 H indÓ-BamH Ñ双
酶切,会导致先前构建到载体上的目的基因被切下
来, 无法构建载体。因此, 需要先对 pHANN IBAL载
体进行H indÓ-BamHÑ双酶切, 连接目的基因得到
pHAN-MwLEA3( HB )重组质粒, 再进行 E coRÑ-XhoÑ
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 5期
双酶切把目的基因反方向连接到 pHAN-MwLEA3
(HB)重组质粒内含子的另一端。由此可见, 在进
行试验设计时,要对各种因素进行综合考虑才能达
到最优的效果。
M.DL15000; 1.中间表达载体 N otÑ酶切; 2. pART27载体 N otÑ酶切
图 9 中间表达载体和 pART27载体 NotÑ酶切
M. 100 bp DNA M arker; 1- 4. ihpRNA表达载体 PCR
图 10 ihpRNA表达载体 PCR检测
M 1. DL15000; M 2. M ark er I; 1. Part27载体质粒 PCR; 2. pGM-T-
MwLEA3质粒 PCR; 3- 5. ihpRNA表达载体转入农杆菌 PCR
图 11 ihpRNA表达载体转入农杆菌 PCR检测
本研究利用基因工程技术, 根据 RNA i技术原
理, 成功构建了蒙古冰草 Mw-LEA3基因的 ihpRNA
表达载体 pART27-MwLEA3 ( HB )-MwLEA3 ( EX ),
将该表达载体成功转化到根癌农杆菌 LBA4404中,
以期为进一步研究蒙古冰草 MwLEA3基因的遗传
转化及功能鉴定奠定基础。
参 考 文 献
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(责任编辑 马鑫 )
92