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Vol.24 No.1
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ACTA AGRESTIA SINICA
2016$ 1%
Jan. 2016
犱狅犻:10.11733/j.issn.10070435.2016.01.018
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78
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犆犾狅狀犻狀犵犪狀犱犈狓狆狉犲狊狊犻狅狀犃狀犪犾狔狊犻狊狅犳犃犮狋犻狀(犕狑犃犆犜2)犻狀
犃犵狉狅狆狔狉狅狀犿狅狀犵狅犾犻犮狌犿 犓犲狀犵
AOTegenbaiyin1,5,GAOLijie5,ZHANGShuhua2,YUNJingfeng3,LANGMinglin2,YANGXueju2,4
(1.ColegeofAgronomy,AgriculturalUniversityofHebei,Baoding,HebeiProvince071000,China;
2.ColegeofLifeSciences,AgriculturalUniversityofHebei,Baoding,HebeiProvince071000,China;
3.ColegeofEcologyandEnvironment,InnerMongoliaAgriculturalUniversity,Huhhot,InnerMongolia010019,China;
4.KeyLaboratoryofCropGermplasminHebeiProvince,Baoding,HebeiProvince071000,China;
5.ColegeofAnimalScienceandTechnology,AgricultureUniversityofHebei,Baoding,HebeiProvince071000,China)
犃犫狊狋狉犪犮狋:AnActingeneof犃犵狉狅狆狔狉狅狀犿狅狀犵狅犾犻犮狌犿 KengwasisolatedbyRTPCRandRACE,wasnamed
as犕狑犃犆犜2.Sequenceanalysisindicatedthatthefullengthof犕狑犃犆犜2geneis1506bpandcontained
an1131bpopenreadingframe.Itencodesapolypeptideof376aminoacids.Theestimatedmolecular
weightoftheputative犕狑犃犆犜2proteinwas41.606kDawithanisoelectricpointof5.29.犕狑犃犆犜2hasa
highlyconservedactindomain,whichdemonstrateditisamemberofactinfamily.犕狑犃犆犜2waspredic
tedtobeanontransmembraneprotein.Thephylogeneticrelationshipalsoindicatedthat犕狑犃犆犜2protein
wassimilarto犜狉犻狋犻犮狌犿狌狉犪狉狋狌(accessionno.EMS62134.1)withaminoacidsequencessimilarityof99%.
ResultofsemiquantitativeRTPCRshowedthattheexpressionof犕狑犃犆犜2wasconstant.Therewasno
significantdifferenceunderhighsalt,droughtandcoldtreatment.
犓犲狔狑狅狉犱狊:犃犵狉狅狆狔狉狅狀犿狅狀犵狅犾犻犮狌犿 Keng;Actingene;Genecloning;5'RACE;Bioinformaticsanalysis;
Expressionanalysis
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:20141223;LMJK:20151017
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(06220114D);z:Po()¤)¾¨N]²´µ(1004002);z:«ïHµÁÂÉ¿£²³
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(1975),,34,234J¶É,ÊË,²Y,ÍÎ?-¼°JG/0,Email:atg12@sina.com;<Ôc Au
thorforcorrespondence,Email:shmyxj@hebau.edu.cn;langminglin@tsinghua.org.cn
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犺狔狆狅犵犪犲犪)、G Í N H I (犆犪狉犪犵犪狀犪犽狅狉狊犺犻狀狊犽犻
犻犓狅犿)、*0(犛狌犪犲犱犪犺犲狋犲狉狅狆狋犲狉犪犓犻狋狅犵)、?¸-
(犕犻犮狉狅狌犾犪狊犻犽犽犻犿犲狀狊犻狊犎犲犿狊犾)、eJ-(犣狅狔狊犻犪犼犪
狆狅狀犻犮犪)?&dd¡actin®5[1016]。
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ß
、TIANScriptcDNA!ßàBÜß1¶á}
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áiØù_Ð+é-70℃|à&Äd。
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Table1 Primersusedforcloning犕狑犃犆犜2cDNAfrom
犃犵狉狅狆狔狉狅狀犿狅狀犵狅犾犻犮狌犿 Keng
ÊKïS
Primer
name
ÊKlj
Primersequence(5'----3')
ÊKA
Sequence
length/bp
A4F CCGTTCTGTCCTTGTATGCCA 21
A5R CCACATCTGCTGGAAAGTGC 20
T7dT18 ACGACTCACTATAGGGC(dT)23 40
oligodT12
ACGACTCACTATAGGGC
TTTTTTTTTTTT
29
GSP3' CGGCCCTTGCTCCTAGCAGTATGAA 25
GSP5' CCACGTAAGCAAGCTTCTCC 20
UPM
5'CTAATACGACTCACTATAGGGCAAG
CAGTGGTATCAACGCAGAGT3'
45
NUP AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT 23
1.5 Nøâã\2äå
j34|-cDNA !ßànÂP,A4FnS
ÝÊK
,A4RnÝÊK\RTPCR,ií®5
TÐ=
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:cDNA1μL,A4F6 A4R
Ü1μL(10mol·μL
-1),Mix12.5μL,îddH2O
Í25μL。uÍÖ:94℃ S<4min,94℃<
30s,57℃ïn45s,72℃Áo1min,30MGH_,
72℃Áo10min。RTPCRií¤Kd2%aô¿
ij`b×Ã
,
ddPEASYT1/N,\Ãl。
1.6 3'犚犃犆犈
}ÏþkTÐ=lj²²déií®53'?
TÊK GSP3'(g1),·_Ïd A4F/T7dT186
GSP3'/oligodT12\OâPCR,ií®5T3'?
lj
。
!ß;PCRiíu:j34|-cDNA
!ßànÂP
,A4FnSÝÊK,3'?#BÊK
T7dT18nÝ\PCRií,PCRuN]n:
cDNA1.5μL,A4F 6 T7dT18 Ü 0.5μL(10
mol·μL
-1),Mix12.5μL,îddH2O Í25μL,
PCRuÄln:94℃ S<4min,94℃<30
s,57℃ïn45s,72℃Áo1min,30MGH_,
72℃Áo10min。!å;PCRiíu:j!ß;
PCR¤KnÂP,GSP3'nSÝÊK,3'?#BÊK
oligodT12nÝ,\ií®53'?TPCRu,
25μLPCRiíuN]:!ß;PCR¤K1μL,
GSP3'6oligodT12Ü0.5μL(10mol·μL
-1),Mix
12.5μL,îddH2OÍ25μL。uÄln:94℃ S
031
!1# À8}¦§?:34|-9!ó¦®5(MwACT2)dgW=
<4min,94℃<30s,63℃ïn45s,72℃Áo
1min,8MGH;94℃<30s,58℃ïn45s,72℃
Áo1min,25MGH_72℃Áo10min。PCR¤
KÀ2%aô¿ij`b×Ã,jÊ_dd
PEASYT1/N,\Ãl。
1.7 5'犚犃犆犈
}Ï3'RACEkdT3'?ljTÐ=,²²
ÊKGSP5'déií®5T5'?lj,ÆBÜß
T5'?#BÊKUPM6NUP\OâPCR,
ií®5T5'?lj。!ß; PCRiíuN]
(25μL):cDNA1.2μL,A4R(10mol·μL
-1)0.5
μL,UPM(BÜß)2.5μL,Mix12.5μL,î
ddH2OÍ25μL。uÄln:94℃ S<5min;
94℃<30s,72℃Áo3min,5MGH;94℃<
30s,70℃ïn45s,72℃Áo3min,5MGH;94℃
<30s,58℃ïn45s,72℃Áo3min,25MG
H
;72℃Áo10min。!å;PCRiíuN]
(25μL):!ß; PCR ¤K0.1μL,GSP5'(10
mol·μL
-1)
6NUP(BÜß)Ü0.5μL,Mix
12.5μL,îddH2OÍ25μL。uÍÖ:94℃ S<
4min,94℃<30s,58℃ïn45s,72℃Áo
1.5min,30MGH_,72℃Áo10min。PCRií
¤KÀ2%aô¿ij`b×Ã,jÊ_dd
PEASYT1/N,\Ãl。
1.8 ÑY>rfæçè
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1.10 г1犚犜犘犆犚>r
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â@1.4),Æ\`b(RNA T×Aß#),j?
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2.1 犕狑犃犆犜2âã\
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j34|-!ßàcDNA nÂP,ÏdA4F/
A4RÊKií,kd1ÍAn656bpT®5´
,
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=1 犚犜犘犆犚Z[犕狑犃犆犜2Nøâã\æì=
Fig.1 ElectrophoresisofRTPCRamplification
productof犕狑犃犆犜2conservedregion
ü
:M:DNA=m`FÏDL2000;
1:犕狑犃犆犜2®5Ð=ií¤K
Note:M:DNAmarkerDL2000;1:Amplificationproduct
of犕狑犃犆犜2conservedregion
2.2 犕狑犃犆犜223'犚犃犆犈pq
}ÏÐ=lj²²8ºÊK GSP3'ií
犕狑犃犆犜2T3'?lj,d A4F/T7dT186 GSP
3′/oligodT12\OâPCR,!ß;PCRïÍÜ,
!å;PCRkd1ÍAn422bpT´,(ë2),
ÏdBLAST\¸D°P,Y´,GJK9
!ó¦®53'?lj@ûs(>90%),UhÚ
犕狑犃犆犜2®5T3'?lj。
131
! " # $ !24"
2.3 犕狑犃犆犜225'犚犃犆犈pq
}ÏÐ=lj²²8ºÊK GSP5'ií
犕狑犃犆犜2T5'?lj,jSMARTRACEcDNA
AmplificationkitT!ßàcDNA nÂP,
dA4R/UPM,GSP5'/NUPÊK\OâPCR,
!ß;PCRïÍÜ,!å;PCRkd1ÍAn
790bpT´,(ë3),ÏdBLAST\¸D°P,
Y´,GJK9!ó¦®55'?lj@û
s
(>90%),UhÚ犕狑犃犆犜2®5T5'?lj。
=2 犕狑犃犆犜23'犚犃犆犈Z[4,
Fig.2 3'RACEamplificationproductof犕狑犃犆犜2
ü
:M:DNA=m`FÏDL2000;1:3'RACEií¤K
Note:M:DNAmarkerDL2000;
1:Amplificationproductof3'RACEof犕狑犃犆犜2
2.4 ÑY>rfæçè
Ï d DNAstar Õ Ö D Ð = 、3'RACE、
5'RACEkdTef\P#,kd1Ín1506
bpTlj,³»WTPolyAep,ýïn34|
-9!ó¦®5犕狑犃犆犜2。
=3 犕狑犃犆犜25'犚犃犆犈Z[4,
Fig.3 5'RACEamplificationproductof犕狑犃犆犜2
ü
:M:DNA=m`FÏDL2000;
1:mb½;2:5'RACEií¤K
Note:M:DNAmarkerDL2000;1:Blanklane;
2:Amplificationproductof5'RACEof犕狑犃犆犜2
2.5 ,éê÷>r
ÏdNCBIORFFINDERÊQ¼>â(É
ù
,
~ë41,Ylj»J1131bpT ORF³)
376M
®W,Æò»J5'UTR129bp,3'UTR
246bp。
=4 ÝÞß犕狑犃犆犜2Nø2犗犚犉>r
Fig.4ORFanalysisof犕狑犃犆犜2from犃犵狉狅狆狔狉狅狀犿狅狀犵狅犾犻犮狌犿 Keng
~ë51,BlastXefgh,犕狑犃犆犜2Ý
a¢ ë u ^
(犜狉犻狋犻犮狌犿 狌狉犪狉狋狌)、å v C R -
(犅狉犪犮犺狔狆狅犱犻狌犿犱犻狊狋犪犮犺狔狅狀)、m(犛犲狋犪狉犻犪犻狋犪犾犻
犮犪)?ÞJtsT@(>98%)。
ÏdLf9KÔ:+=ÕÖ Expasy(ht
tp://web.expasy.org/compute_pi/)=gh,Y
231
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®5³)ó¦T=m`n41.606KDa,?`n
5.29。ÏdInterproscan(http://www.ebi.ac.uk/
Tools/pfa/iprscan/)Lf=Õ Ö D 3 4 | -
犕狑犃犆犜2®5T
®Wlj\Ð=epS
Ã
,
efghY
®Wlj¬éActinó¦,Æ
ò»JActinÐ=(ë6)。
=5 ÝÞß犕狑犃犆犜2Nø犗犚犉¯NqÑY犖犆犅犐<2$pq
Fig.5 Blastresultsoftheputativeaminoacidsequenceof犃犵狉狅狆狔狉狅狀犿狅狀犵狅犾犻犮狌犿
Keng犕狑犃犆犜2openreadingframe(ORF)inNCBI
=6 ÝÞß犕狑犃犆犜2Nø2âãpÝ]>r
Fig.6 Conserveddomainanalysisofthe犃犵狉狅狆狔狉狅狀犿狅狀犵狅犾犻犮狌犿 Keng犕狑犃犆犜2
ÏdDNAMANÕÖD34|-、»z、á
âºu
(犛犪犮犮犺犪狉狌犿狅犳犳犻犮犻狀犪狉狌犿)、6¾(犜狉犻狋犻犮狌犿_
狌狉犪狉狋狌)、Ý a ¢ ë u ^ (犅狉犪犮犺狔狆狅犱犻狌犿 _犱犻狊
狋犪犮犺狔狅狀)、åvCR-(犛犲狋犪狉犻犪犻狋犪犾犻犮犪)、m(犎犲狏
犲犪犫狉犪狊犻犾犻犲狀狊犻狊)、Sj{(犞犲狉狀犻犮犻犪犳狅狉犱犻犻)、çT
(犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪)、&ZA(犃狀犪狀犪狊犮狅犿狅狊狌狊)、
UC
(犕犲犱犻犮犪犵狅狋狉狌狀犮犪狋狌犾犪)6ìí12MJKT
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犮狌犿_狌狉犪狉狋狌)T Actin
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Fig.7 Multiplealignmentresultsaminoacidsequences
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Fig.8 Phylogenetictreeof犃犵狉狅狆狔狉狅狀犿狅狀犵狅犾犻犮狌犿
KengActinwithotherplantActins
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Fig.9 Predictionoftransmemberanceregion
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Keng犕狑犃犆犜2aminoacid
sequencewithTMHMMsoftware
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Fig.10 Thehydropathydistributingof
犃犵狉狅狆狔狉狅狀犿狅狀犵狅犾犻犮狌犿Keng犕狑犃犆犜2aminoacids
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Fig.11 Thesecondarystructurepredictionof犃犵狉狅狆狔狉狅狀犿狅狀犵狅犾犻犮狌犿 Keng犕狑犃犆犜2aminoacidssequence
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(犕狑犃犆犜2)2`Ô
Fig.12 Theexpressionlevelof犃犵狉狅狆狔狉狅狀犿狅狀犵狅犾犻犮狌犿
Keng犕狑犃犆犜2underdifferentstressconditions
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