全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·技术与方法· 2008年第3期
收稿日期:2007-11-19
基金项目:国家自然科学基金(No. 30460008)
作者简介:刘立鸿(1982-),男,硕士生,生化与分子生物专业,E-mail:xj iulihong1234@126.com
通讯作者:马正海(1971-),男,副教授,硕士生导师,E-mail:mzhxju@sohu.com
自1975年英国科学家E.M.Southern创立Southern
杂交技术以来,该技术已成为检测特定 DNA片段
的经典杂交方法之一[1]。此法快速、准确、灵敏,目
前已经广泛地应用于医学、病毒学、转基因动植物
鉴定、动物疾病诊断以及 DNA指纹分析等方面的
研究。Southern印迹杂交中使用的标记探针有同位
素与非同位素标记 2种。放射性同位素标记的探针
灵敏度较高,但存在半衰期限制,对操作者和环境
会造成放射性辐射危害。使用非同位素标记探针可
避免放射性危害[2],常规实验室大多采用后者,其
中最常用的是地高辛标记探针[3]。目前虽然有地高
辛标记探针标记的试剂盒,但是试剂盒侧重于步骤
流程描述,关于技术要点的介绍不是很多。国内关
于地高辛标记探针 Southern印迹杂交法技术要点
报道也较少。在开展 Southern印迹杂交中,参照文
献并结合实验室的具体情况对该技术的具体步骤
进行了一些探索和改进,现作一总结。
1 技术要点
1.1地高辛探针的标记与使用
1.1.1探针的标记方法 标记方法有缺口平移法、
末端标记法、随机引物法和聚合酶链反应法(PCR)
等。Southern杂交探针的制备一般用随机引物法,
模板量应达到 1μg以上,模板量不足 1μg,可适当
延长 37℃温育时间。当模板序列已克隆在载体上,
地高辛标记探针Southern印迹杂交技术要点及改进
刘立鸿 1 许璐 1 汪凯 2 张富春 1 马正海 1
(1新疆大学生命科学与技术学院分子生物学重点实验室 新疆生物资源基因工程重点实验室,乌鲁木齐 830046;
2中国科学院上海巴斯德研究所,上海 200025)
摘 要: Southern印迹杂交技术是检测特定DNA片段的常规方法之一,其操作程序繁琐,对基因组DNA的提
取、纯化、酶切等均有较高要求,要获得理想杂交结果需要反复摸索。总结地高辛标记探针 Southern印迹杂交的技术要
点,并结合具体操作提出改良方案。
关键词: 地高辛 Southern杂交 改进 技术要点
The Key Technological Points of Southern Blot Using
Dig-labeled DNA Probes and Improvement
Liu Lihong1 Xu Lu1 Wang Kai2 Zhang Fuchun1 Ma Zhenghai1
(1Key Laboratory of Molecular Biology,C lege of L fe Science and Technology,Xinjiang Key Lab ratory of Biological
Resources and Genetic Engineering,Urumqi 830046;2Institute Pasteur of Shanghai,Chinese Academy of Sciences,
Shanghai 200025)
Abstract: This is one of conventional methods detecting specific DNA fragment,its operation procedures a e
tedious. There are higher requirements in extraction,purification and digestion of the genomic DNA etc. To achieve the
desired hybridization results,repeated explorations are needed.This paper was aimed to sum up digoxinin-labeled probe
Southern blot hybridization techniques,and improvement programs were presented in conjunction with our concrete
operation.
Keywords: Digoxin Southern blot hybridization Improvement Technological points
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第3期
而且多克隆位点附近有特异引物时,可以用 PCR
法制备探针[4]。杨克强等[5]采用 PCR法制备探针,发
现比用 Klenow酶随机标记探针效率要高,而且省
时。Solanas等[3]的研究表明,用地高辛标记探针最
好的方法是使用 PCR法,同时也提出如果模板
DNA量足够多,用随机标记法也可以达到满意的
效果,上述观点在本实验室也得到验证。PCR法制
备探针时有时会出现非特异条带,从而降低了探针
的特异性,故在用地高辛标记探针之前,一定要对
PCR条件进行优化以保证标记探针的特异性。
1.1.2 探针最适工作浓度 探针的最适工作浓度
要根据不同特定实验来确定,探针浓度过低则杂交
信号较弱;太浓则会产生一些非特异性背景[3]。在
杂交袋中杂交需要 0.2ml/cm2的杂交液;使用圆筒状
瓶子进行杂交可以使用较小的体积,约 0.1ml/cm2。
1.2 DNA样品的准备
1.2.1 DNA的量 不管是基因组还是 DNA限制
性内切核酸酶消化产物,目的基因必须达到一定浓
度。一般需要 10μgDNA样品,如果样品中目的基
因含量较高,可以按比例减少 DNA用量。在做转基
因植物分子检测时,常常发现 PCR检测为阳性,而
Southern检测为阴性,其原因在于转基因植株的材
料往往较少,或在转基因植物的基因组中目的基因
的拷贝数较低,致使常规的基因组用量不能满足
Southern杂交的需要,此时可加大基因组的用量。
1.2.2 判断是否完全消化 取适量的基因组消化
产物和未消化基因组进行预电泳,若消化产物呈弥
散状,位置较未消化基因组低,且在最上方没有出
现很明显的条带,则说明消化充分。在选酶时应尽
量避免星号活性。双酶切时,应优先选择有相同反
应缓冲液的酶,或者在同一种反应缓冲液中活性接
近的酶;在进行双酶切前,用每一种酶进行单独酶
切,以判断每种酶在选用的反应缓冲液中的活力。
酶切体积较大时,可以在消化结束后用无水乙醇沉
淀浓缩 DNA片断。消化后的 DNA样品保存在 4℃,
加样前 56℃水浴 2～3min,以破坏突出黏性末端可
能形成的任何碱基对[6]。
1.3 转移及固定
1.3.1 转移方法 将 DNA片段从凝胶转移至固相
支持物有 5种方法[6],即向上毛细管转移法、向下
毛细管转移法、同时向两张膜转移、电转法、真空转
移。经典的凝胶转膜方式为 Southern提出的向上转
移法,其操作简便,然而在转移过程中,由于凝胶受
压、脱水而变薄,凝胶的孔径变小,转移效率下降。
向下转移法克服了上述缺点,转移效率有所提高。
根据经验,当目的基因的含量较低或转移基因组
时,采用向下转移法能提高转移效率和检测信号的
强度。
1.3.2 固定方法 有 3种方法可以将 DNA样品固
定于膜上[6],即真空烘烤、微波炉固定、紫外交联。
紫外交联法快速、方便,大多实验室采用该法。进行
紫外交联时,要避免膜被过量照射,照射的目的是
使 DNA的一小部分胸腺嘧啶残基与膜表面带正电
荷的氨基基团形成交联[7],过量的照射将导致大部
分胸腺嘧啶共价结合,继而降低了胸腺嘧啶残基与
氨基基团的交联。照射时应该使膜上带有 DNA的
一面朝向紫外光源。
1.4 杂交最适温度、反应时间
根据所选择的预杂交液确定杂交温度,选用
Standardbufer时 , 杂 交 温 度 控 制 在 65～68℃;
Standardbufer中加入 50%formamide或选用 High
SDSbufer时,杂交温度控制在 37～42℃。在满足温
度条件的情况下,杂交的成败取决于杂交时间,时
间过短则杂交不充分;时间过长则可能导致非特异
结合增多。杂交时间一般控制在 20h左右。
1.5 祛除背景的方法
利用地高辛标记探针进行 Southern杂交时,最
常见的问题是高背景[8],以下 2种措施可降低背景
(1)适当延长梯度洗膜的时间和提高洗膜温度[9];
(2)控制地高辛抗体的浓度。Solanas[3]认为使用足够
量的地高辛抗体可以获得较好的杂交信号,但过量
的地高辛抗体会在膜上产生非特异结合斑点[10]。一
些杂交试剂盒说明书提到 EB对背景有一定的影
响,但是Solanas[3]认为EB对背景的影响不大,Solanas
亦采用不同量的多种 DNA上样缓冲液,发现其对
背景影响不大。
1.6 杂交膜的选择与保存
杂交膜有 3种:尼龙膜、硝酸纤维素膜和 PVDF
膜。尼龙膜是一种较为理想的核酸固相支持物,有
多种类型,其结合能力、温度适应性、韧性比硝酸纤
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维素膜都强,是最常用的杂交膜。硝酸纤维素膜与
DNA和 RNA(尤其是小片段核酸)结合能力相对较
弱,膜较脆,易破碎。PVDF膜的性能介于尼龙膜、
硝酸纤维素膜之间。杂交膜用 TE漂洗 2次后封
存,膜干燥或久置后,信号将会有所减弱或褪色,但
经 TE润湿后仍然会重现原有的杂交信号[11]。
2 技术改进
2.1 转移台的搭建
盛转移液的容器不可过大,可以用大小相差一
定程度的培养皿作为转移用的容器和支持物。支持
物上放置 2～3张普通滤纸充当盐桥,这不仅可以减
缓转移液的挥发,同时也促使转移液从四周上吸,
加快转移速度,缩短转移时间。吸水纸上方可置一
块比吸水纸稍大的培养皿或玻璃板,压之以盛满水
的方型试剂瓶,并以自制简易支架固定试剂瓶(以
几个洗瓶的吸嘴固定试剂瓶亦可)。
2.2 湿膜交联
为防止操作过程中膜的污染,可以将膜及时置
于少量转移液浸润的滤纸槽中(该纸槽应置于干净
的一次性手套上)。操作时需戴一次性手套,用无齿
镊夹膜的边缘。
2.3 探针变性
探针体积通常只有几微升,为了最大程度地减
少探针的损失,可以先将约 0.5ml的预杂交液置于
探针变性温度进行预处理,然后加入探针并变性。
该操作除了在最大程度避免探针的损失,也可避免
高浓度探针直接粘附于膜上产生污染斑点。
2.4 杂交
如果杂交炉不是水平浴锅摇床,建议使用
50ml摇菌管作为杂交管,而不采用杂交袋,因杂交
袋常常弯折而导致杂交膜弯折,并形成非特异条
带。杂交时,不带 DNA的膜面朝向摇菌管管壁,有
较深 DNA上样缓冲液颜色的一面为带 DNA的膜
面,或根据膜上的切角标记判断带 DNA的膜面。为
避免杂交过程中杂交液的漏出,可以用生料带缠饶
摇菌管口后再拧紧盖子,并在盖子口缠饶封口膜或
透明胶布。
2.5 提高转移效率
对于大于 15kb的 DNA片断,转膜之前用盐酸
进行脱嘌呤可以促进转膜效率,但脱嘌呤过度可导
致分子量相对较小的 DNA被打断成过小的片段而
难以和尼龙膜结合[3]。如果实验转膜过程中同时含
有大于 15kb的 DNA (通常为基因组)和小片段
DNA(通常是基因组酶切产物),那么在转移的过程
中倾斜容器,仅使凝胶上半部分浸泡于盐酸,这样
既可以提高大片断 DNA的转移效率,又不会打碎
小片段 DNA。
以上是根据实验室具体情况对地高辛标记探
针 Southern印迹杂交的一些具体操作进行了探索
和改进,以供同行借鉴。
参考 文献
1 SouthernEM.JMolBiol,1975,98:503~517.
2 MathewsJA,KrickaLJ.AnalBiochem,1988,169:1~25.
3 SolanasM,EduardE.JBiochemBiophysMethods,1997,35:153~159.
4 ClarkMS,顾红雅译,翟礼嘉译.植物分子生物学实验手册[M].
北京:北京高等教育出版社,1988,13~42.
5 杨克强,王跃进,张今今,等.农业生物技术学报,2005,13(3):
294~298.
6 J萨姆布鲁克,DW拉塞尔,黄培堂 译.分子克隆实验指南(第
3版)[M].北京:科学出版社,2002,487~515.
7 ChurchGM,GilbertW.PNAS,1984,81:1991~1995.
8 HauptC,TolnerEA,HeinemannU,etal.BrainRes,2006,1118
(1):232~238.
9 徐晓玲,杨平勋,白云秀,等.生物技术通讯,2006,17(4):580~
582.
10 GabiEB,MonikaM,FrankJ,GerhardAM.AnalBiochem,1993,
210:235~244.
11 陆小平,周文军,小岛峰雄,等.生物学通报,2003,38(1):
52~53.
刘立鸿等:地高辛标记探针Southern印迹杂交技术要点及改进 59