全 文 ：收稿日期:2010-08-17
基金项目:教育部科学技术研究重点项目(209076);河南省基础与前沿技术研究计划项目(082300450520 , 092300410099)
作者简介:杨献光(1980-),男 ,河北邯郸人 , 讲师 ,在读博士研究生 , 主要从事分子细胞生物学研究。
＊通讯作者:梁卫红(1968-), 女 ,山西祁县人 , 教授 ,博士 , 主要从事模式生物发育分子机制研究。
E-mail:liangw h@henannu.edu.cn
野生一粒小麦糖原合成酶激酶基因
TbGSK1 的克隆与分析
杨献光1 ,梁卫红1＊ ,马闻师2
(1.河南师范大学 生命科学学院 ,河南 新乡 453007;2.河北师范大学 生命科学学院 , 河北 石家庄 050016)
摘要:根据普通小麦糖原合成酶激酶基因序列设计引物 ,以野生一粒小麦 cDNA 为模板 ,利用
RT-PCR技术 ,扩增出野生一粒小麦糖原合成酶激酶基因的 cDNA 序列 ,克隆到 T 载体上并进行
测序 。结果显示 ,该基因全长 1 543 bp ,开放阅读框 1068 bp ,编码一个由 355 个氨基酸组成的蛋
白。Southern blo t分析显示 ,其在野生一粒小麦基因组中为单拷贝基因。该基因与普通小麦 、玉
米 、烟草 、苜蓿 、拟南芥等植物的糖原合成酶激酶基因序列同源性分别达到 94.1%、91.3%、
83.2%、81.5%、72.8%。
关键词:糖原合成酶激酶;野生一粒小麦;胁迫应答;Southern杂交
中图分类号:Q94 S512.1 文献标识码:A 文章编号:1004-3268(2010)11-0005-04
Cloning and Sequrce A nalysis of Glycogen Synthase
Kinase Gene TbGSK1 in T riticum boeoticum Boiss
YANG Xian-guang 1 , LIANG Wei-hong1＊ ,MA Wen-shi2
(1.College o f Life Science , Henan No rmal Univ ersity , Xinxiang 453007 , China;
2.Colleg e of Life Science , Hebei Normal Unive rsity , Shijiazhuang 050016 , China)
Abstract:The PCR primers w ere designed based on the sequence of gly cogen synthase kinase
f rom Trit icum aestivum and w ere used to amplify the cDNA fragment of gly cogen synthase kinase
gene in Tri t icum boeot icum Boiss by RT-PCR technique.The amplif ied f ragment w as further
cloned and sequenced.The result show ed that the full-length of the gene w as 1 543 bp , contained
an O RF of 1068 bp , and encoded 355 amino acid residues.Southern blot analy sis revealed that
TbGSK1 was a sing le-copy gene in Trit icum aest ivum genome.The identity o f the deduced amino
acid sequences wi th that of Trit icum boeoticum Boiss , Trit icum aestivum , Zea mays , Nicotiana
tabacum , Medicago sativa and Arabidopsis thal iana was 94.1%, 91.3%, 83.2%, 81.5%,
72.8%, respectively .
Key words:Glycogen synthase kinase;Trit icum boeot icum Boiss;S tress re sponse;Southern hy-
bridiza tion
干旱 、盐 、氧化胁迫等各种非生物胁迫 ,严重危
害着农业生产 ,是造成全球粮食作物减产的首要原
因 ,致使大部分粮食作物减产 50%以上[ 1] 。在许多
地区 ,干旱和盐渍化面积迅速扩大 ,预计到 2050年 ,
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河南农业科学
DOI :10.15933/j.cnki.1004-3268.2010.11.014
将有 50%的可耕地面积严重盐渍化[ 2] 。而全世界
土地面积的 43%属于干旱和半干旱地区 ,我国干旱
面积占国土面积的一半以上。非生物胁迫可以导致
植物发生一系列形态学 、生理学 、生物化学和分子水
平的变化 ,影响植物的生长发育和产量 。例如 ,干旱
和盐渍主要表现为渗透胁迫 ,破坏细胞的正常离子
分布和动态平衡。而伴随着高温 、高盐或干旱胁迫
而来的氧化胁迫 ,可以使功能蛋白和结构蛋白变
性[ 3] 。植物对干旱 、盐渍等非生物胁迫的应答非常
复杂 ,常常互相关联 ,这些非生物胁迫可以造成细胞
的损伤 ,并引起某些二次胁迫 ,如渗透胁迫和氧化胁
迫。渗透性 、离子性 、温度性 、膜流动性改变等胁迫
刺激信号被质膜上的受体感知 ,并作为起始因子通
过 IP3等第二信使引发下游的信号转导。然后通过
转录因子进行转录调控 ,激活细胞重建内部动态平
衡的胁迫应答机制 ,积累相溶性溶质维持细胞渗透
平衡;利用 Na+/H+逆向转运蛋白重建细胞内的离
子动态平衡;依靠热激蛋白和胚胎晚期丰富蛋白修
复被损伤的蛋白质和膜。从而使细胞产生胁迫耐
受 ,存活下来。一旦细胞胁迫信号转导和基因激活
过程出现一步或几步错误 ,最终将会不可逆地破坏
细胞内的动态平衡 ,使结构和功能蛋白质失活 ,导致
细胞死亡[ 4 , 5] 。
糖原合成酶激酶(GSK)是一种高度保守的丝
氨酸/苏氨酸蛋白激酶 ,在动物中参与诸如糖原合
成 、胰岛素调节 、多种蛋白的转录激活和发育调控等
许多生命活动的信号转导 。近来已经有证据表明 ,
GSKs家族在植物中也扮演着重要的角色[ 6-8] 。现
有的证据表明 ,植物 GSKs 可能参与植物的渗透胁
迫应答 、伤害应答以及油菜素内酯信号转导 ,调节花
的发育等一系列生命活动进程[ 9] 。例如 ,拟南芥中
的 AtGSK1[ 10] ,苜蓿中的 WIG[ 11] , 普通小麦中的
TaGSK1[ 12 , 13] 等。为了克服六倍体小麦基因组庞
大 ,难以进行单个基因功能分析的弊端 ,本研究运用
RT-PCR方法从野生一粒小麦中克隆得到了糖原合
成酶激酶基因 ,并就该基因的结构和预测蛋白在不
同植物之间进行了比较和分析 。
1 材料和方法
1.1 材料
野生一粒小麦(Tri ticum boeoticum Boiss)由河
北师范大学遗传学系保存。播种于蛭石中 ,灌溉
Hongland营养液 ,并于暗室中培养黄化苗 ,提取细
胞总 RNA 。
1.2 PCR引物的设计
根据普通小麦糖原合成酶激酶基因 TaGSK1
(GenBank 登录号:AF525086)序列设计引物。上游
引物序列为 P1:5′-GT TGG TG TGG TGCGTCCT-
TCC-3′;下 游 引 物 序 列 为 P2:5′-GGGGGC-
CTCGATCCATGAAC-3′。预计扩增片段长度为
1 500 bp。
1.3 总 RNA 的提取及 cDNA 合成
总 RNA 抽提采用生工生物工程(上海)有限公
司 SK1321试剂盒进行。紫外分光光度法及变性琼
脂糖凝胶电泳检测 RNA的浓度及完整性。 cDNA第
一链的合成按照 Promega M-MLV说明书进行。
1.4 PCR扩增 、PCR产物的克隆及序列测定
以 cDNA 为模板进行 PCR扩增。反应程序为
94℃预变性5min , 94℃变性 30s , 60℃复性 45s , 72℃
延伸1.5min ,30个循环;然后72℃延伸10min。
回收 RT-PCR 反应产物 ,与 pGEM-T Vecto r
连接后转化大肠杆菌 DH5α菌株 ,经蓝白板筛选 、
EcoRⅠ酶切鉴定后的阳性克隆子送交生工生物工
程(上海)有限公司测序 。
1.5 序列分析
测序结果采用 BLAST 程序(http://www .nc-
bi.nlm .nih.gov/BLAST/)进行同源性搜索 , DNA
序列及氨基酸序列的比较采用 DNAStar 软件进行
分析。
1.6 DNA提取和 Southe rn杂交
DNA 抽提 、Southe rn 杂交 、X光片放射自显影
按《分子克隆实验指南》进行 。10μg 基因组 DNA
经 EcoRⅠ 、HindⅢ完全酶切后在 0.8%的琼脂糖凝
胶上电泳分离 ,将 DNA 转移到尼龙膜 Hybond-N +
(Amersham Bio sciences , Li t tle Chalfont , UK)上 ,
80℃烘烤固定 ,65℃预杂交 4 h ,65℃杂交 18h ,洗膜
3次 ,每次 15min ,然后压 X光片 , -80℃放射自显
影后洗片检测结果 。
2 结果与分析
2.1 野生一粒小麦糖原合成酶激酶 cDNA 的分离
和鉴定
以野生一粒小麦总 RNA 为模板 , o ligo(dT)18
为引物反转录合成总 cDN A 。以 cDNA为模板进行
PCR扩增 ,得到清晰的目的条带 ,大小 1 543 bp(图
1),回收 ,与测序载体连接后测序 。
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2010年第 11期
图 1 野生—粒小麦 TbGSK1 cDNA的 RT-PCR 产物
2.2 序列测定及测序结果的同源性比对
测序结果表明 , 该克隆长 1 543 bp , 包含一个
1068 bp的开放读码框 ,编码一个含 355个氨基酸的
多肽 ,其5′端非翻译区长 78 bp ,3′端非翻译区长 397
bp。GenBank登录号:DQ443471。在 GenBank 中
比较发现它同普通小麦 、玉米 、烟草 、苜蓿 、拟南芥等
植物中该基因的核苷酸序列同源性分别为 99%、
86%、84%、83%、83%,表明该基因为一粒小麦糖原
合成酶激酶基因。
2.3 编码氨基酸序列同源性及系统进化分析
利用 DNAStar软件进行编码蛋白的预测 ,并与
普通小麦 、玉米 、烟草 、苜蓿 、拟南芥等植物中的该蛋
白进行多重比对分析。结果显示 ,这些蛋白序列高
度同源 ,分别达到 94.1%、91.3%、83.2%、81.5%、
72.8%的一致性(图 2)。系统进化分析进一步显示
出各种植物 GSK蛋白的进化关系(图 3)。
图 2 野生一粒小麦 TbGSK1 预测蛋白的氨基酸序列与其他植物 GSK的同源性比对
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河南农业科学
图 3 6 种植物 GSK蛋白的系统进化关系
2.4 Southern杂交
2组酶切均显示一条特异杂交(图 4)。结合野生
一粒小麦糖原合成酶激酶基因序列酶切位点分析 ,该
基因在野生一粒小麦基因组中为单拷贝形式存在。
左:基因组 DNA 经 E coRⅠ(E)和 H ind Ⅲ(H)
完全酶切后琼脂糖凝胶电泳检测
右:全长 AbGSK1 探针 S ou th ern杂交结果
图 4 野生一粒小麦基因组 DNA的 Southern杂交
3 讨论
植物非生物胁迫现象非常复杂 ,非生物胁迫应
答的机制至今仍不十分清楚 ,但是对某一个胁迫应
答组分(如转录因子)进行的遗传改造可以使胁迫耐
受能力大大提高。除转录因子外 ,对上游信号调节
因子如水稻钙依赖蛋白激酶(OsCDPK)或拟南芥糖
原合成酶激酶(AtGSK1)的调控也是提高植物胁迫
耐受前景良好的方法 。
植物中 GSK 基因家族的存在 ,的确为了解不
同的信号转导通路提供了思路 ,并且加深了在分子
水平上对这些生理过程的理解 。研究 GSK s在发育
和环境信号应答中的特定角色 ,以及它们与其他通
路的交叉作用 ,是未来的一项重要任务。这些研究
有望为搞清植物对诸如盐胁迫 、干旱 、水分 、低温及
伤害应答的分子机制 、利用基因工程手段培育抗逆
作物新品种提供新的思路 。
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2010年第 11期