全 文 ：桂竹糖芥苷对血管平滑肌细胞增殖的影响
李孟全1 , 王秋娟1＊ , 关利新2
1中国药科大学生理教研室 , 南京 210009;
2牡丹江医学院药理教研室 , 牡丹江 157011
【摘　要】　目的:考察桂竹糖芥苷对血管平滑肌细胞增殖的影响。方法:应用 80%乙醇回流提取 ,正己烷
萃取 ,MCI 柱层析甲醇洗脱获得桂竹糖芥苷。采用体外培养的血管平滑肌细胞 , 检测细胞增殖 、细胞内钙和 c-
myc 基因的 mRNA 表达 ,并与哇巴因 、地高辛进行比较。结果:(1)桂竹糖芥苷浓度在 10-5mg·mL-1时具有促血
管平滑肌细胞增殖作用;哇巴因和地高辛浓度分别在10 -14和 10-9mg·mL-1时具有促血管平滑肌细胞增殖作用 ,
最大增殖率分别为 49.08%和 51.05%。(2)桂竹糖芥苷浓度在 10-3 mg·mL-1时可暂短升高细胞内钙;哇巴因浓
度在 10-4 mg·mL-1时可持久升高细胞内钙。(3)桂竹糖芥苷浓度在 10-8mg·mL-1时对 c-myc mRNA表达没有影
响;哇巴因和地高辛浓度在 10-12 mg·mL-1时可增加 c-myc mRNA 表达。 结论:与哇巴因和地高辛相比 ,桂竹糖
芥苷对血管平滑肌细胞增殖的影响较小。
【关键词】　糖芥苷;哇巴因;地高辛;血管平滑肌细胞;增殖
【中图分类号】　R965.1;R972　　【文献标识码】　A　　【文章编号】　1672-3651(2007)05-0370-04
【收稿日期】　2007-01-01
【基金项目】　黑龙江省自然科学基金资助项目(No.TD2005-03)
【＊通讯作者】　王秋娟:教授 ,博导 ,Tel:025-83271341 , Fax:025-
83301606 , E-mai l:qjwangnj @126.com
　　桂竹糖芥(Erysimum cheiranthoides L.)是十字
花科糖芥属二年生草本植物 , 又名小花糖芥 , 主
要分布于我国东北地区 , 野生资源丰富 。桂竹糖
芥主要有效成分为糖芥强心苷 ,具有强心 、抗心律
失常作用[ 1, 2] 。然而对血管平滑肌细胞增殖作用
尚未见报道。本实验从天然桂竹糖芥种子中提取
分离出桂竹糖芥强心苷(以下简称糖芥苷),采用
体外培养的血管平滑肌细胞 ,检测细胞增殖 、细胞
内钙和 c-myc mRNA表达 ,并与哇巴因 、地高辛进
行比较 ,旨在为进一步充分开发利用这一药材资
源提供依据。
1　材料与方法
1.1　药品 、试剂与药材
哇巴因 、地高辛 、胰酶 、噻唑兰(MTT)、二甲基
亚砜(DMSO),均为 Sigma 公司产品;DMEM 培养
基 、胎牛血清(FBS), Invitrogen 公司产品;Fluo-3-
AM ,Molecular Probes(Eugene , Oreg.),其他试剂均
为分析纯 。
实验药材采集于黑龙江省牡丹江地区 ,经牡
丹江医学院药学系中药教研室郭清玉教授鉴定为
十字花科糖芥属植物桂竹糖芥(Erysimum cheiran-
thoides L.)。药材标本存放在牡丹江医学院药理教
研室 。
1.2　提取分离
干燥的糖芥种子 120 g ,80%乙醇回流提取 4
次 ,前2次2 h ,后两次 1 h ,过滤 ,合并滤液 ,回收乙
醇 ,得水溶液 80 mL ,过滤 ,滤液置于 250 mL 分液
漏斗中 ,加正己烷 80 mL萃取 ,共 4次。萃取液过
滤 ,80 mL ,上 10 g MCI 层析柱 ,分别用水 ,10%甲
醇 ,20%甲醇 ,30%甲醇 ,40%甲醇 ,60%甲醇 , 80%
甲醇及 100%甲醇洗脱分离。根据文献[ 3] 报道
60%甲醇处是强心苷 ,富集后用于实验 , 收率为
0.66%,薄层层析后 ,用 kedde 试剂及 25%三氯乙
酸显色均为阳性。
1.3　血管平滑肌细胞培养
无菌条件下迅速取出新生牛的胸主动脉 ,剥
离内外膜后剪碎组织 ,参照组织块培养法[ 4] 进行
平滑肌细胞的培养 ,经免疫组化鉴定 ,呈 α-actin阳
性 , 3-6代细胞用于实验。
1.4　MTT 法测定细胞增殖
将血管平滑肌细胞以 5.0×104浓度接种于 96
370　　Chin J Nat Med　Sep.2007　Vol.5　No.5 　2007年 9月　第 5卷　第 5期
孔板中孵育 24 h , 以 PBS 为对照组 , 用糖芥苷
(Erysimosides)、哇巴因(ouabain)和地高辛(digoxin)
刺激 ,每药用 PBS 配 5个浓度 ,每组做 8个复孔 。
12 h后每孔加 20 μL MTT(5 mg·mL-1)继续孵育 4
h ,小心吸出原液 ,每孔加 150μL DMSO 溶解结晶 ,
在酶联免疫仪上于 490 nm 测定其吸收值(A)。
1.5　激光共聚焦显微镜检测细胞内游离 Ca2+
将血管平滑肌细胞接种于预先放置盖玻片的
6孔板中孵育 ,24 h 后用 Hank s液(pH 7.2)洗涤
细胞 3次 ,于 37 ℃避光条件下负载 Fluo-3-AM ,30
min后用 PBS洗涤细胞 3次 ,洗去细胞外残余的染
料 ,而后在激光扫描共聚焦显微镜(Bio-Rad公司
产品)下进行扫描检测 ,检测荧光强度代表细胞内
Ca
2+的相对浓度。扫描过程中分别以 10-3 mg·
mL
-1的糖芥苷 PBS溶液和 10-4 mg·mL-1的哇巴因
PBS 溶液刺激 ,观察荧光强度的变化。每份标本随
机检测5个细胞的荧光强度 。
1.6　逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测 c-myc
基因 mRNA的表达
将血管平滑肌细胞接种于 6孔板中孵育 ,生
长融和后于不同孔中分别加入 10-8 mg·mL-1糖芥
苷PBS 溶液 、10-12 mg·mL-1哇巴因PBS 溶液 、10-12
mg·mL-1地高辛PBS 溶液和PBS继续孵育 4 h 。
RNA提取:用酸性酚-硫氰酸胍-氯仿法提取
平滑肌细胞中总 RNA[ 5] 。
cDNA合成(RT):取 2 μg 总 RNA及 0.5 μg 随
机引物 ,加水至 17 μL ,70 ℃变性 5 min。加 5×缓
冲液 5.0 μL 、10 mmol·L-1 dNTPs 1.25 μL、Rnasin
0.75μL、M-MLV 逆转录酶 1.0 μL , 37 ℃反应 1 h 。
然后经94 ℃水浴 5 min , -20 ℃保存。
引物设计:根据基因库 c-myc 人牛同源序列 ,
应用Oligo 5 software for windows(National Biosciences
Inc., Plymouth , MN)进行引物设计。上游和下游
引物分别是 5′-AGAGGGCTAAGTTGGACAGTG-3′和
5′-CAAGAGTTCCGTATCTGTTCAAG-3′, 产物是 346
bp 。管家基因 glyceraldehyde-3-phosphate dehydroge-
nase(GAPDH)被用作内参 ,其上下游引物分别是
5′-ATTCAACGGCACAGTCAAGG-3′和 5′-GCAGAA
GGGGCGGAGATGA-3′, 产物是 213bp。
扩增(PCR):建立 25 μL 的扩增体系 ,依次加
入下列试剂:无菌双蒸水 15.2μL 、10×缓冲液 2.5
μL 、25 mmol·L-1 MgCl2 2.0 μL 、10 mmol·L-1 dNTP
1.0 μL 、5μmol·L-1 3.0μL 、cDNA 1.0μL 、5 U·μL-1
Taq 0.3 μL 、液体石蜡 1滴 ,离心 ,置 PCR仪内扩
增。首先 94 ℃5 min ,然后按下列循环条件扩增:
94℃45 s ～ 53 ℃45 s ～ 72 ℃45 s ,循环 30次 ,
最后 72 ℃10 min。取 PCR产物 10 μL 在 1.0%的
琼脂糖中电泳 ,SYBRGreen I 染色 ,紫外透照仪上
观察 ,摄影 ,条带的灰度代表扩增产物的含量 。
1.7　统计学分析
实验数据采用 x ±s 表示 ,两组比较用 t 检
验 ,多组比较用单因素方差分析。
2　结果
2.1　糖芥苷对血管平滑肌细胞增殖的影响
图 1 显示:糖芥苷有微弱的促增殖作用 , 与
PBS对照组比较浓度在 10-5 mg·mL-1时增殖具有
统计学意义 ,增殖率为 33.3%;对比之下哇巴因和
地高辛促增殖作用较强 ,与 PBS 对照组比较具有
统计学意义的最低增殖浓度分别为 10-14和 10-9
mg·mL-1 ,最大增殖率分别为 49%和 51%。
Fig 1　Effect of Erysimosides on the proliferation of bovine
vascular smooth muscle cells(n = 8 , ＊ P < 0.05 , ＊＊ P <
0.01 vs PBS control)
2.2　糖芥苷对血管平滑肌细胞内游离 Ca2+的影
响
在激光扫描共聚焦显微镜扫描过程中 , 以
10
-3
mg·mL-1的糖芥苷刺激 ,被检测细胞内的荧光
强度变化见图 2 ,箭头表示刺激点 ,刺激后荧光强
度有所增加 , 1 min内返回到正常水平 ,随后缓慢
提高 ,表明糖芥苷可暂短升高细胞内游离 Ca2+。
对比之下以 10-4 mg·mL-1的哇巴因刺激 ,刺激后
荧光强度立即增加且一直保持在较高水平 ,表明
哇巴因可迅速 、持久地升高细胞内游离 Ca2+ 。
　2007年 9月　第 5卷　第 5期 Chin J Nat Med　Sep.2007　Vol.5　No.5　371　
Fig 2　Effect of ouabain(10-4 mg·mL-1)and erysimosides
(10-3 mg·mL-1)on intracellular free Ca2+ in bovine vascu-
lar smooth muscle cells(n=5)
2.3　糖芥苷对血管平滑肌细胞内 c-myc 基因
mRNA表达的影响
如图 3所示:糖芥苷的 c-myc 条带灰度与对照
组没有差异 ,而哇巴因和地高辛组的 c-myc 条带灰
度明显高于对照组 。表明糖芥苷对 c-myc mRNA
表达无影响 ,而哇巴因和地高辛均能增加 c-myc
mRNA的表达;说明哇巴因和地高辛在基因水平上
有促进增殖作用 。
Fig 3 　Comparison of erysimosides(10-8 mg·mL-1) to
ouabain(10-12 mg·mL-1)and digoxin(10-12 mg·mL-1)on
c-myc mRNA expression in bovine vascular smooth muscle
cells
3　讨　论
强心苷在临床用于治疗充血性心衰已经 200
多年了 ,以往的诸多研究侧重于它的强心 、利钠等
方面的作用。近年来的研究发现这类药物具有剂
量依赖性地直接收缩血管平滑肌作用[ 6] ,导致高
血压[ 7] 。随着对内源性强心苷认识的不断深入 ,
已证明体内的这种活性物质也是导致血压升高的
重要激素[ 8 ] 。强心苷与高血压的关系研究亦成为
热点之一 。
血管平滑肌细胞(VSMCs)的增殖是高血压的
发生发展 、动脉粥样硬化的形成和血管再狭窄共
同的细胞病理基础之一[ 9] 。然而 ,VSMCs增殖的
分子机制尚未完全阐明[ 10] 。有文献报道细胞内游
离Ca2+参与细胞增殖的过程[ 11] 。增加细胞内游
离Ca2+促进细胞增殖[ 12] ,降低细胞内游离 Ca2+抑
制增殖[ 13] 。 c-myc是一种原癌基因 ,参与细胞的增
殖过程[ 14] 。在静止的平滑肌细胞中该基因表达量
低甚至难以测出[ 15] ,然而 ,当动脉损伤或受丝裂素
刺激 ,该基因在增殖的细胞中持续表达[ 16] 。 c-myc
基因的激活是细胞从静止状态进入增殖周期的必
要而充分的条件[ 17] 。
本文研究结果显示糖芥苷与哇巴因和地高辛
均有促进VSMCs增殖的作用 ,但是糖芥苷作用比
较微弱。糖芥苷和哇巴因在促进增殖的有效浓度
下对细胞内游离 Ca2+无明显影响 ,在较高浓度时
才显示出升高细胞内游离Ca2+的作用 。提示除细
胞内游离 Ca2+以外 ,可能有其他机制参与 VSMC
增殖过程 。对 c-myc 基因的影响是在促进增殖有
效浓度下产生 ,说明促增殖作用与该基因表达密
切相关 。总之 ,糖芥苷在浓度明显高于哇巴因和
地高辛时(一个数量级以上)对血管平滑肌细胞的
增殖 、细胞内游离 Ca2+以及 c-myc mRNA表达的影
响均小于哇巴因和地高辛。文献[ 1] 报道糖芥苷与
哇巴因的等效剂量在同一个数量级内 ,提示糖芥
苷的血管副作用较小。进一步考察糖芥苷强心作
用的剂量 、有效成分及含量列入我们下一步的研
究项目。
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Effects of Erysimosides on Proliferation in Vascular Smooth
Muscle Cells
LI Meng-Quan1 , WANG Qiu-Juan1＊ , GUAN Li-Xin2
1
Department of Physiology , China Pharmaceutical University , Nanjing 210009 ;
2
Department of Pharmacology , Mudanjiang Medical College , Mudanjiang 157011 , China
【ABSTRACT】　AIM:To investigate the effects of erysimosides on proliferation in vascular smooth muscle cells.METHODS:Erysimo-
sides were obtained by extraction with 80% ethanol and isolation with M IC column.Effects of erysimosides on proliferation , intracellular
free calcium and c-myc mRNA expression in vascular smooth muscle cells were observed and compared with those of ouabain and digoxin.
RESULTS:(1)Erysimosides at the concentration of 10-5 mg·mL-1 presented the effect of stimulating proliferation;Ouabain and digoxin
presented the effect of stimulating proliferation at the concentration of 10-14 mg·mL-1 and 10 -9 mg·mL-1 , respectively.(2)Erysimosides
at the concentration of 10 -3 mg·mL-1 appeared a tentative increase of intracellular free calcium;Ouabain at the concentration of 10 -4 mg
·mL-1 appeared a permanent increase of intracellular free calcium.(3)Erysimosides at the concentration of 10-8 mg·mL-1 had no effect
on c-myc mRNA expression;an increase of c-myc mRNA expression was observed by ouabain and digoxin at the concentration of 10-12 mg
·mL-1.CONCLUSION:Compared with ouabain and digoxin , the effects of erysimosides on proliferation in vascular smooth muscle cells
is small.
【KEY WORDS】　Erysimosides;Ouabain;Digoxin;VSMCs;Proliferation
【Foundation Item】　This project was supported by the Natural Science Fundation of Heilongjiang province(No.TD2005-03)
　2007年 9月　第 5卷　第 5期 Chin J Nat Med　Sep.2007　Vol.5　No.5　373