全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2009年第 2期·研究报告·
收稿日期：2008-07-15
基金项目：国家自然科学基金（30470046），江苏省自然科学基金（BK2007020），江苏省高技术研究计划项目（BG2006011）资助
作者简介：李飏（1983-），女，硕士研究生，研究方向：酶工程与技术，分子生物学
通讯作者：徐岩，Tel：0510-85918201，E-mail：biosean@yahoo.com.cn
根霉脂肪酶是一类典型的微生物脂肪酶，其独
特的催化特性使其在脂肪酶理论研究和实际应用
中都占有重要地位 [1，2]。华根霉脂肪酶（Rhizopus chi-
nensis lipase，RCL）在酯类物质的合成、生物柴油和
手性化合物的制备等重要工业实践中表现出良好
的应用价值 [3~5]。 前期研究从具有自主知识产权的
华根霉中克隆得到脂肪酶全基因 （GenBank 登录
号 ：EF405962）， 与米根霉脂肪酶 （Rhizopus oryzae
lipase，ROL）较为接近（同源性约为 86%） [6]，包含 26
个氨基酸的信号肽序列 ，94 个氨基酸的前导序列
和 269 个氨基酸的成熟肽序列， 但其野生型脂肪酶
性质与米根霉等其他根霉脂肪酶相比有较大差异 [7，8]。
华根霉前导肽和成熟肽脂肪酶基因的克隆表达及性质研究
李飏 王栋 徐岩
（江南大学生物工程学院 教育部工业生物技术重点实验室，无锡 214122）
摘 要： 以华根霉（Rhizopus chinensis CCTCCM201021）为出发菌株，提取总DNA，PCR扩增出前导肽脂肪酶基
因（proRCL）及成熟肽脂肪酶基因（mRCL），克隆到原核载体pET-28a，转化E.coli BL21（DE3），诱导表达并纯化出活性目
的蛋白。经SDS-PAGE分析，重组蛋白ProRCL和MRCL的分子量分别约43 kD和33 kD。两重组脂肪酶主要酶学性质
基本相似，最适反应温度均为35℃，40℃下较为稳定；最适反应pH相近，分别为8.0和8.5；以pNP脂肪酸酯为底物，均对
短链脂肪酸酯底物特异性较高。MRCL上述性质与野生型RCL基本一致。研究结果表明，通过条件控制可以利用 E.coli
表达系统表达具有活性的华根霉前导肽脂肪酶ProRCL和成熟肽脂肪酶MRCL。与米根霉脂肪酶（ROL）不同，前导序列
对华根霉脂肪酶的主要酶学特性没有显著影响。
关键词： 华根霉 前导肽脂肪酶 成熟肽脂肪酶 克隆 表达 性质
Expression of the Gene of Pro-and Mature Rhizopus chinensis
Lipases and Associated Characteristics
Li Yang Wang Dong Xu Yan
（Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education School of Biotechnology，
Jiangnan University，Wuxi 214122）
Abstract： The prolipase and mature lipase gene was amplified by PCR method using the genomic DNA isolated
fromRhizopus chinensis CCTCCM201021.The target genes were then inserted into the expression vector pET-28a and
expressed inE.coli BL21 with IPTG induction. The partially soluble target proteins with lipase activity were obtained
and then purified. SDS-PAGE analysis showed that the relative molecular weight of pro- and matureRhizopus chinensis
lipases（ProRCL and MRCL）were about 43 kD and 33 kD，respectively. ProRCL and MRCL showed having similar
characteristics，and the same optimal temperature 35℃，both be ng s abl below 40℃，and pres nting optimal pH at 8.0
and 8.5 respectively. These two recombinant lipases were specific to short chain fatty acid ofp-nitrophenyl esters. The
properties of recombinant MRCL was similar to wild RCL. Based on the results，pro- and matureRhizopus chinensis
lipases expressed inE.coli coul obtain active forms under the control of conditon. The prosequence had no obvious
effects on the characteristics of RCL，which was different fromRhizopus oryzae lipase（ROL）.
Key words： Rhizopus chinensis Prolipase Mature lipase Cloning Expression Characteristics
2009年第 2期
国内外对米根霉脂肪酶基因表达研究表明 [9~13]，前导
肽米根霉脂肪酶 （ProROL）和成熟肽脂肪酶 （MRO-
L）由于前导序列的影响，在酶学特性和催化活力上
存在显著的差别 [9]；而成熟肽脂肪酶基因单独在酿
酒酵母中表达没有活性 [13]。 前期研究中利用毕赤酵
母表达前导肽华根霉肽脂肪酶基因 （prosequence
RCL，proRCL），得到的表达产物与一些关于米根霉
脂肪酶表达的报道相似，是保留了前导序列 C 端的
部分 27 个氨基酸和成熟肽 269 个氨基酸的重组蛋
白（Pro27RCL），难以得到完整的前导肽脂肪酶。 虽
然很多时候原核表达根霉脂肪酶得到的目的蛋白
不可溶且没有活性，但近来 Mirella 等 [14]的研究首次
表明，选择合适的条件在 E.coli 中表达米根霉脂肪
酶基因可以获得正确折叠的、具有活性的米根霉前
导肽脂肪酶，为根霉脂肪酶的活性表达提供了另一
种选择。
以华根霉总 DNA 为模板， 在克隆得到华根霉
前导肽脂肪酶基因和成熟肽脂肪酶基因（mRCL）的
基础上，利用原核表达系统进行表达，并对这两个
重组蛋白的酶学性质进行初步研究，考察华根霉脂
肪酶前导序列对其酶学特性的影响，为华根霉脂肪
酶的理论研究及今后的应用提供了一定的基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株、质粒 克隆宿主 E.coli JM109、表达宿
主 E.coli BL21 （DE3）和华根霉 （Rhizopus chinensis
CCTCCM201021）由本实验室保存。大肠杆菌表达质
粒 pET-28a 购自 Novagen 公司。 pMD19-T 载体购自
TaKaRa 公司。
1.1.2 各种工具酶及试剂盒 限制性内切酶 、T4
DNA 连接酶、Taq 酶、IPTG 购自 Takara 宝生物工程
有限公司，200 bp DNA Ladder Maker 为上海申能博
彩生物科技有限公司产品、 植物基因组 DNA 提取
试剂盒、 琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒购自天根生
化科技（北京）有限公司，质粒提取试剂盒为 OME-
GA BIO-TEK 产品， 其余试剂均为国产或进口分析
纯。
1.1.3 PCR 引物 以 RCL 全序列为基础， 参考不
同 ROL 基因片段序列， 采用引物设计软件 Primer
Premier 辅助设计， 上海申能博彩生物科技有限公
司合成。 proRCL 上游引物 P1：5′-GGAATTCCATAT-
GGTTCCTGTTGCTGGTCAT-3′（下划线部分为 NdeⅠ
酶切位点）；mRCL 上游引物 P2： 5′-GGGAATTCCA-
TATGTCTGATTCAGGTGAAGTT-3 ′ （下划线部分为
NdeⅠ酶切位点 ）；proRCL、mRCL 下游引物 P3：5′ -
CAGTGCGGCCGCCAAACAGCTTCCTTC-3′（下划线部
分为 NotⅠ酶切位点）。
1.2 方法
1.2.1 华根霉脂肪酶总 DNA 的提取 将华根霉孢
子接种于发酵培养基中，30℃、200 r/min 培养 72 h，
橄榄油作为脂肪酶合成诱导剂。 总 DNA 的提取参
照植物基因组 DNA 提取试剂盒说明书方法。
1.2.2 目的基因的克隆 以提取的华根霉脂肪酶
总 DNA 为模板，扩增 proRCL、mRCL 两段基因。PCR
扩增条件如下：94℃预变性 3 min，94℃ 1 min、55℃/
54℃ 2 min、72℃ 2 min，30 个循环，72℃延伸 10 min。
PCR 扩增产物与 pMD19-T 载体连接 ， 转化 E.coli
JM109。 阳性转化子验证后上海生工生物工程技术
服务有限公司测序。
1.2.3 pET28-proRCL、pET28-mRCL 表达载体的构
建 pMD19-proRCL、pMD19-mRCL 质粒用 NdeⅠ和
NotⅠ双酶切，回收目的基因片段，与经过相同内切
酶双酶切的 pET-28a 质粒连接，构建重组表达质粒
pET28-proRCL 及 pET28-mRCL。 双酶切验证后上海
生工生物工程技术服务有限公司测序。
1.2.4 proRCL、mRCL 基因的表达及重组蛋白纯
化 将 pET28-proRCL、pET28-mRCL 转化的 E.coli
BL21（DE3）菌株接种 LB 培养基，培养至菌液 OD600=
0.6~0.8，加入终浓度为 0.4 mmol/L 的 IPTG 进行诱
导。 收集的菌体超声破碎，上清液镍离子亲和层析
介质纯化。表达产物 SDS-PAGE 分析，按照文献[15]
的方法配制各种试剂。
1.2.5 脂肪酶活力的测定 参照文献[16]，以 pNP-
C16 为底物，每分钟释放 1 μmol 对硝基苯酚的酶量
定义为 1 个脂肪酶水解酶活国际单位。
1.2.6 pH 对脂肪酶活力和稳定性的影响 将酶液
分别加在不同 pH（pH7.0~10.0）的缓冲液中 ，按标
准方法测定脂肪酶活力 ， 以最高酶活为相对酶活
100%。酶液用不同 pH（pH6.0~10.0）的缓冲液稀释，
25℃保温 1 h，测定残余酶活，以未处理酶液的酶活
李飏等：华根霉前导肽和成熟肽脂肪酶基因的克隆表达及性质研究 83
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 2期
力为 100%。
1.2.7 温度对脂肪酶活力和稳定性的影响 在不
同的温度（20~60℃）下按标准方法测定酶液的水解
活力，以最高酶活为 100%。将酶液在不同的温度下
（20~60℃）分别保温 1 h，迅速冷却 ，按标准方法测
残余活力，以未保温酶液的酶活力为 100%。
1.2.8 重组脂肪酶的脂肪酸链长特异性 以不同
链长的 pNP 脂肪酸酯为底物， 在标准条件下测定
华根霉前导肽脂肪酶 （ProRCL）和华根霉成熟肽脂
肪酶（MRCL）对这些酯的水解活力，以酶活力最高
值为 100%[7]。
2 结果
2.1 proRCL、mRCL 基因的克隆及重组表达载体
的构建
以华根霉总 DNA 为模板 ， 用引物 P1/P3 PCR
扩增出大小约 1.1 kb 的 proRCL 基因片段；引物 P2/
P3 PCR 扩增出大小约 800 bp 的 mRCL 基因片段
（图 1-A）。 回收 PCR 产物与 T 载体相连后转化 E.
coli JM109。 阳性转化子双酶切回收目的基因片段，
与 pET-28a 连接，构建重组表达质粒 pET28-proRCL
及 pET28-mRCL，并转化 E.coli BL21（DE3）。 重组质
粒双酶切验证与目的基因相符（图 1-B），测序结果
也与目的基因一致。
2.2 目的基因在 E.coli BL21 中表达及重组蛋白
纯化
携带有 pET-28a 载体和重组质粒 pET28-proRCL
及 pET28-mRCL 的 E.coli BL21（DE3）分别在 LB 培
养基中培养，30℃ IPTG 诱导表达后，目的蛋白以包
涵体形式存在。 降低培养温度至 20℃诱导表达，细
胞破碎后对表达产物进行 SDS-PAGE 分析（图 2）。
目的蛋白较多仍形成包涵体，但破碎上清液中含有
部分明显可溶的重组蛋白，与对照相比具有明显的
活性。 ProRCL 的表达量明显高于 MRCL。 细胞破碎
上清液经镍离子亲和层析 ， 纯化得到目的蛋白 。
图 1 PCR 扩增 proRCL、mRCL 基因 （A）及重组
质粒双酶切验证（B）
1. 基因 proRCL PCR 产物；
2. 基因 mRCL PCR 产物；
3. 200 bp DNA 分子量标准
1. pET28-proRCL 双酶切产物；
2. pET28-mRCL 双酶切产物；
3. 200 bp DNA 分子量标准
图 2 表达及纯化的重组蛋白 SDS-PAGE 分析
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ProRCL 和 MRCL 相对分子质量分别约 43 kD 和 33
kD， 包含了利用该载体表达在重组蛋白 N 端及 C
端附加的氨基酸，与预期分子量相同。 两重组脂肪
酶分离纯化结果见表 1，纯化的 MRCL 比活相对较
高。
2.3 pH 对重组脂肪酶活力和稳定性的影响
对纯化得到的重组脂肪酶 ProRCL 和 MRCL 酶
学性质进行考察。 结果（图 3-A）表明，pH 显著影响
了这两个重组蛋白的脂肪酶活性，两重组脂肪酶最
适反应 pH 分别为 8.0 和 8.5，pH 7.5~9.0 均有相对
较高的活性，差异不大，较其它野生型根霉脂肪酶
偏碱性，与 Beer 等 [12]报道的重组米根霉脂肪酶（R-
OL）基本一致。 pH 稳定性如图 3-B 所示，两重组脂
肪酶在其最适反应 pH 稳定性最好， 当 pH<7.0 和
pH>8.5 时， 酶活迅速降低。 该研究结果与野生型
RCL 最适 pH 和稳定性基本一致 [7]。 而关于 ProROL
pH 稳定性的报道较少，Minning 等 [11]报道重组成熟
肽 ROL 在 pH 为 7.0 时最稳定，这与本研究得到的
华根霉脂肪酶有较明显的差异。
2.4 温度对脂肪酶活力和稳定性的影响
温度对两脂肪酶活力的影响如图 4-A。 ProRCL
和 MRCL 的最适反应温度相同，均为 35℃。 在 35℃
以下时，ProRCL 和 MRCL 的相对酶活均高于 60%。
温度对两脂肪酶的稳定性有类似的影响（图 4-B），
40℃以下脂肪酶活力损失不大，可保持原有活力的
60%以上。 但当温度高于 40℃，两脂肪酶酶活下降
明显。上述结果与野生型 MRCL相应性质基本相同[7]，
而与温度对重组米根霉脂肪酶活力和稳定性的影
响明显不同。 Beer 等 [12，17]的研究表明，米根霉前导
肽脂肪酶 （ProROL）和成熟肽脂肪酶 （MROL）温度

  U 
mg  U/mg
  %
ProRCL


423.49

69.65

6.08

1.0

100
 !" 368.20 20.32 18.12 2.98 86.94
MRCL


45.80

19.74

2.32

1.0

100
 !" 38.60 1.22 31.90 13.75 84.28

表 1 ProRCL 和 MRCL 纯化结果
图 3 pH 对 ProRCL、MRCL 活力（A）和稳定性（B）的影响
图 4 温度对 ProRCL、MRCL 活力（A）和稳定性（B）的影响
李飏等：华根霉前导肽和成熟肽脂肪酶基因的克隆表达及性质研究
相
对
酶
活
（ %
）
温度 （℃ ）
相
对
酶
活
（ %
）
温度 （℃ ）
85
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 2期
特性差异显著，分别在 55℃和 25℃时酶活力最高、
稳定性最好， 温度分别升至 70℃和 50℃时两米根
霉脂肪酶完全失活。前导序列对提高米根霉脂肪酶
的温度耐受性有一定的帮助，但在本研究中对于华
根霉脂肪酶却没有得到前导序列有助于增加重组
脂肪酶温度耐受性的结果。
2.5 脂肪酶的脂肪酸链长特异性
脂肪酶水解底物的脂肪酸链长特异性是脂肪
酶的一个重要特性。通常不同来源微生物脂肪酶的
作用底物特异性较高，而不同脂肪酸链长特异性的
脂肪酶在工业中也具有不同的应用价值。本研究分
别以不同链长的 pNP 脂肪酸酯为底物， 对重组脂
肪酶 ProRCL 和 MRCL 进行考察，结果如表 2。 两脂
肪酶底物选择性差别不大，对短链的脂肪酸酯水解
活力较高，分类学上更接近于酯酶。其中 ProRCL 对
pNPC3 水解活力最高 ， 而 MRCL 对 pNPC6 水解活
力最高。 二者对长链的 pNP 脂肪酸酯也有一定的
水解活力，研究结果与野生型 MRCL 相同 [7]。 重组
米根霉脂肪酶的研究表明，ProROL 对长链脂肪酸酯
底物特异性较高，其中 C12 脂肪酸酯是最适底物 [13]，
而 MROL 最适底物为 C8 脂肪酸酯， 对长链脂肪酸
酯水解活力较低 [11]。 米根霉前导序列调节脂肪酶的
活力 [9]，ProROL 和 MROL 底物特异性差异较大，而P
roRCL 和 MRCL 性质较为接近，前导序列没有表现
出类似作用。
3 讨论
利用原核表达系统对 RCL 进行外源表达 ，得
到了具有活性的 ProRCL 和 MRCL， 纯化后对目的
蛋白主要酶学性质进行了研究 。 研究结果表明 ，
pH、温度及不同链长的脂肪酸酯对 ProRCL 和 MRCL
的影响比较相似 ， 其中 MRCL 上述性质与野生型
RCL 基本一致。
由于本研究中重组 ProRCL 和 MRCL 性质较为
接近，表明华根霉脂肪酶前导序列对该脂肪酶酶学
性质影响不大，这一结果与重组米根霉脂肪酶有较
大差异。 据文献报道，米根霉脂肪酶 ROL 前导序列
对其脂肪酶活性有显著的影响， 从而使 ProROL 与
MROL 在底物特异性和催化活力等性质上存在明
显差异 [9]。 此外，ROL 前导序列还起到分子伴侣的
作用 [13]，有利于米根霉脂肪酶形成活性构象 ，因此
ProROL 比活明显高于 MROL；但在本研究中 ProRCL
的比活却低于 MRCL，也就是说 RCL 前导序列表现
出相反的作用。由于华根霉脂肪酶与米根霉脂肪酶
存在一定差异，上述现象产生的原因还有待进一步
研究。
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%
   ProRCL MRCL
pNPC2 2 85.08±2.01 75.40±1.67
pNPC3 3 100±1.1 94.73±1.51
pNPC6 6 64.86±0.69 100±1.4
pNPC8 8 13.11±0.21 29.40±0.25
pNPC12 12 3.98±0.10 10.64±0.12
pNPC16 16 3.33±0.12 7.38±0.15

表 2 ProRCL 和 MRCL 的脂肪酸链长专一性
86